孟祥玉，許 龍，宋曉梅

（佳木斯大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007）

咖啡因濃度作為判斷茶葉質(zhì)量的主要因素，其對(duì)測(cè)試茶葉質(zhì)量具有至關(guān)重要的作用，尤其在信息化時(shí)代背景下，我國(guó)咖啡因濃度檢測(cè)方式趨于多樣化，如紫外分光光度法、薄層色譜法等，其中相色譜法憑借自身高效性、高靈敏度等特點(diǎn)，被經(jīng)常應(yīng)用在茶葉咖啡因檢測(cè)當(dāng)中。而從茶葉中提出咖啡堿最常用的方法有二氯甲烷有機(jī)溶劑提取法和醇提法兩種，而醇提法是通過利用乙醇溶液和提取器來(lái)提取咖啡因，或利用熱度進(jìn)行加熱，通常前面提取方式往往要耗費(fèi)2-3小時(shí)，需要耗費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間，后者需要應(yīng)用大量二氯甲烷、丙酮、三氯甲烷等有機(jī)藥劑，這種藥劑會(huì)對(duì)人體與環(huán)境造成嚴(yán)重污染，且需要經(jīng)過水浴回收、蒸餾、抽濾等過程，不利于日常檢測(cè)。雖然我國(guó)政府部門利用合理隨便對(duì)樣品處理過程進(jìn)行升級(jí)，將水作為溶劑的替代品，利用氧化鎂來(lái)檢測(cè)茶葉中單寧酸元素，但由于整個(gè)處理過程十分復(fù)雜，往往要利用沸水處理兩次，且要不定期搖晃，需要耗費(fèi)大量時(shí)間，操作步驟十分繁瑣，提取率很低。針對(duì)以上這些問題，為了提高提取率、縮短操作步驟，對(duì)提取方式進(jìn)行了優(yōu)化。用70%乙醇溶液做主體，對(duì)其進(jìn)行加熱、超聲提取、微波萃取等，來(lái)提高提取效果，并對(duì)測(cè)試萊蕪干烘茶中咖啡堿的高效液相色譜法進(jìn)行優(yōu)化，為后續(xù)研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

LTB-800數(shù)控超聲波清洗機(jī)主要生產(chǎn)在濟(jì)寧魯通超聲電子設(shè)備公司；而TDZ5-WS離心機(jī)是出廠于湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器，江蘇金怡儀器科技有限公司；U3000高效液相色譜儀；日本島津公司UV-2700紫外可見分光光度計(jì)。同時(shí)咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品≥99.8%，；無(wú)水乙醇、甲醇、乙腈、氧化鎂（分析純）、萊蕪干烘茶、測(cè)試用水為娃哈哈純凈水。

1.2 液相色譜條件

流動(dòng)相：甲醇-水比例25∶75，V/V；檢測(cè)波長(zhǎng)275mm；色譜柱acclaim120c18；柱長(zhǎng)度4.6mmX150mm，直徑5um；流動(dòng)相流速1ml/min；柱溫30°。

1.3 干烘差樣品處理

當(dāng)工作人員將干烘茶放在低溫環(huán)境下進(jìn)行干燥粉碎后，要將其放在孔徑為0.600mm的孔徑篩內(nèi)，將所提煉出來(lái)的氧化鎂與茶葉樣品放入在微波萃取管和三角瓶當(dāng)中，然后在三角瓶中添加不同劑量的乙醇溶液，再將這些溶液進(jìn)行攪拌，等到所有溶液全部攪拌均勻后，可采用加熱的方式進(jìn)行提取，或者可利用超聲提取、微波萃取等方式來(lái)提取茶葉中蘊(yùn)含的咖啡堿成分。將會(huì)得到大量的提取液，將全部提取液放置在瓶中，再用純凈水進(jìn)行定容，經(jīng)過有機(jī)相針式過濾器后在進(jìn)行測(cè)試。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的研究分析

2.1.1 檢測(cè)器波長(zhǎng)確定。在正常情況下，工作人員根據(jù)行業(yè)要求，將咖啡堿溶液利用紫外分光光度計(jì)來(lái)進(jìn)行掃描，再合理利用掃描數(shù)據(jù)來(lái)制作吸收曲線，幫助工作人員發(fā)現(xiàn)咖啡因的最長(zhǎng)吸收波長(zhǎng)（如圖1所示）。從吸收曲線圖可見，在咖啡因280mm左右，所吸收波漲幅達(dá)到最高點(diǎn)。由于在最大吸收波長(zhǎng)條件下檢測(cè)，所具有的雜質(zhì)最少，讓其具有較好的穩(wěn)定性與靈敏性，從而將275mm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸收曲線

2.1.2 流動(dòng)相組成及比例確定。經(jīng)過有關(guān)人員研究發(fā)現(xiàn)，乙晴和甲醇兩種物質(zhì)與不同體積水相融合，當(dāng)其逐漸流動(dòng)時(shí)，很容易給雜質(zhì)峰和目標(biāo)峰帶來(lái)不同程度的影響，經(jīng)過有關(guān)人員分析發(fā)現(xiàn)，在有機(jī)環(huán)境下雜質(zhì)峰和目標(biāo)峰分離狀態(tài)能達(dá)到預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)，且峰形能滿足實(shí)際需求。但由于在研究過程中發(fā)現(xiàn)甲醇毒性較低，研究人員可將甲醇和水進(jìn)行相互結(jié)合，形成全新的流動(dòng)物質(zhì)來(lái)進(jìn)行流動(dòng)。將甲醇與水根據(jù)不同體積比例對(duì)干烘茶提取液進(jìn)行測(cè)試，這時(shí)甲醇與水的體積分為別10:90/20:80/25:75，而柱溫為30°，紫外波長(zhǎng)為275mm，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)兩者體積比達(dá)到第一比例時(shí)，咖啡堿提取時(shí)間不會(huì)超過18min；當(dāng)體積比在達(dá)到第二階段時(shí)，咖啡堿提取時(shí)間下降到7min；當(dāng)體積比達(dá)到第三階段后，咖啡堿提取時(shí)間降低到5min內(nèi)，并且體積比達(dá)到第三階段后雜質(zhì)峰和目標(biāo)峰呈現(xiàn)分離狀態(tài)，具有相同比例的色譜峰形狀，給甲醇檢測(cè)效率帶來(lái)不同程度的影響。

2.1.3 確定色譜柱溫度。經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)色譜柱溫度控制在40°—52°時(shí)，要嚴(yán)格遵循色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，每隔5°要測(cè)試一次咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)過研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定溫度中柱溫并不會(huì)給咖啡堿保留時(shí)間、色譜峰峰形帶來(lái)嚴(yán)重；隨著溫度不斷升高，很容易給會(huì)色譜柱壽命帶來(lái)嚴(yán)重限制，甚至?xí)行Ы档透鹘M分離度，經(jīng)過專業(yè)人員實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)柱溫可控制在30°。

2.2 咖啡堿提取方法的優(yōu)化選擇

在信息化時(shí)代背景下，茶葉咖啡堿提取方式是根據(jù)提取溶劑不同使用不同的提取方法，如二氯甲烷提取法、醇提法、水提法等。按照提取方式不同可分為微波萃取、加熱浸提、超聲提取等方式。經(jīng)過專業(yè)研究發(fā)現(xiàn)，利用乙醇溶液、水、二氯甲烷作為提取劑效果更好，但值得注意的是，要選擇不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液作為提取溶劑，并將直接加熱浸提優(yōu)化為加熱振蕩提取，將三種不同的提取法進(jìn)行對(duì)比，選擇一種性價(jià)比最高的提取方法。

2.2.1 加熱振蕩提取。加熱振蕩提取是現(xiàn)代應(yīng)用范圍較廣的提取方式，其具有簡(jiǎn)單易操作特點(diǎn)。取0.5g萊蕪干烘茶樣品和5份氧化鎂，將其放在5只100mL三角瓶當(dāng)中，分別在這個(gè)瓶子內(nèi)加入40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml的乙醇溶液，將其放入到恒溫的振蕩器中，由于在常規(guī)條件下的乙醇溶液沸點(diǎn)較低，為避免提取過程當(dāng)中乙醇沸騰降低其功效，在提取時(shí)要控制溫度，不宜過高，溫度控制在80°左右。

2.2.2 超聲提取。超聲提取是利用超聲波機(jī)械獨(dú)特的性能，如粉碎功能、空化功能，提高提取速度，將其向溶劑四周拓展，能有效提高提取率。嚴(yán)格遵循行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行稱取重量，在干烘茶樣品和氧化鎂中添加乙醇溶液，在功率為200w，78°情況下，利用超聲波來(lái)提取60min。

2.2.3 微波萃取。微波萃取技術(shù)是一種新型的提取技術(shù)，其具有試劑用量少、萃取時(shí)間短、節(jié)能高效等特點(diǎn)，已被普及到生物樣品分析、食品分析等方面。在國(guó)家政策當(dāng)中有明確表明，在茶葉提取實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，我們應(yīng)該通過化學(xué)實(shí)踐，自己準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)藥品、實(shí)驗(yàn)裝置，親自實(shí)驗(yàn)，才能明白干烘茶藝之間的反應(yīng)，明白提取法在干烘茶里面的重要意義，讓我們?cè)趯?shí)驗(yàn)當(dāng)中學(xué)到實(shí)際知識(shí)、提升我們的動(dòng)手能力。這種萃取方法是以CEM微波化學(xué)技術(shù)作為基礎(chǔ)，再結(jié)合其他文獻(xiàn)進(jìn)行優(yōu)化，稱取0.5g粉碎干烘茶樣品和5份1g氧化鎂，分別放置在5個(gè)萃取管內(nèi)，分別在這個(gè)瓶子內(nèi)加入40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml的乙醇溶液，研究人員要嚴(yán)格根據(jù)方法1進(jìn)行萃取。通過三種不同方法進(jìn)行提取液將所有上清液用純凈水定容在50ml，經(jīng)過有機(jī)相針式過濾器進(jìn)行過濾，從而準(zhǔn)確判斷檢測(cè)條件來(lái)確保提取液的順利進(jìn)行，如圖4所示。

表1 微波萃取方法

從圖2可見，提取方法和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)咖啡因提取效果存在不同程度的影響。當(dāng)茶葉樣品基本數(shù)據(jù)相同時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)在70%，研究人員可通過微波萃取方式來(lái)提高咖啡堿的質(zhì)量；當(dāng)乙醇體積為80%時(shí)，依舊利用微波萃法所得到的咖啡堿質(zhì)量最高；當(dāng)乙醇體積小于70%時(shí)，加熱振蕩法所產(chǎn)生的咖啡因質(zhì)量最低。從以上數(shù)據(jù)可知，當(dāng)乙醇溶液體積在70%時(shí)，微波萃取方法效果最好，其具有操作簡(jiǎn)單、用時(shí)最短的特征。

圖2 提取方法及乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)咖啡堿提取效果的影響

2.3 咖啡因線性和方法檢出限

將咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制作成為六種不同質(zhì)量濃度溶液，要根據(jù)測(cè)試條件來(lái)做出相應(yīng)測(cè)試，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這個(gè)范圍內(nèi)峰面積線性和質(zhì)量濃度具有直接性關(guān)系（如圖3所示）。曲線方程如表2所示。

如圖3 咖啡因校正曲線圖

如表2 校正曲線和檢出限

2.4 方法精密度實(shí)驗(yàn)

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)裝置創(chuàng)新時(shí)，要以安全為主，保證實(shí)驗(yàn)時(shí)實(shí)驗(yàn)裝置的安全性、穩(wěn)定性，嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)規(guī)范。比如在改良設(shè)備裝置時(shí)，安裝順序應(yīng)該是由左到右、由下到上，依次操作，實(shí)驗(yàn)的操作過程應(yīng)該是按照設(shè)備——檢查設(shè)備裝置的密閉性——添加實(shí)驗(yàn)藥品——進(jìn)行實(shí)際操作。節(jié)約型原則在改進(jìn)設(shè)計(jì)時(shí)非常重要，需要明白實(shí)驗(yàn)的要求，可以在實(shí)驗(yàn)課當(dāng)中學(xué)到實(shí)際知識(shí)、提升動(dòng)手能力，在實(shí)驗(yàn)當(dāng)中盡可能的少用儀器以及藥劑，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟。比如在創(chuàng)新干烘茶裝置時(shí)，可以采用取代的方式，避免實(shí)驗(yàn)過程中藥劑的浪費(fèi)（如表3所示）。

表3 咖啡因精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，在經(jīng)過六次測(cè)量后，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差大概為0.46%，干烘茶樣品當(dāng)中的咖啡因平均值為23.85mg/g，通過數(shù)據(jù)我們不難看出，這種方法精密度較高，能應(yīng)用于日常檢測(cè)當(dāng)中。

2.5 方法加標(biāo)回收率的測(cè)定

稱取茶葉樣品在校正曲線范圍內(nèi)，加入不同量的咖啡因，并利用合理方式來(lái)進(jìn)行測(cè)定（如表4所示）。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

通過對(duì)不同提取咖啡堿方法進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過離心過濾后能直接進(jìn)行上機(jī)測(cè)試，與加熱振蕩提取相比，這種提取方式效率更高、更簡(jiǎn)單、耗時(shí)較少；與其他測(cè)試茶葉中咖啡堿的高效液相色譜法相比，這種方式的回收率更高、分析時(shí)間較少，檢出限較高。符合政府部門檢查要求，適合應(yīng)用于萊蕪干烘茶中，對(duì)測(cè)試咖啡因含量具有非常重要的作用。