孟立鋒，劉前程，吳敏華，劉 鑫，周少華

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530023；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

腹膜透析(Peritoneal dialysis，PD)是終末期腎臟病(end stagerenal disease，ESRD)患者有效的腎臟替代療法，在我國已得到廣泛應(yīng)用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國PD人口已逾9萬人，占全球 PD 患者總?cè)藬?shù)的33%[1]。盡管近年來PD患者生存率及技術(shù)存活率顯著提高[2]，但是，由于腹膜炎、腹膜纖維化(peritoneal fibrosis，PF)、透析液的不相容性等原因?qū)е略S多患者無法接受長期PD。其中，PF所導(dǎo)致的超濾衰竭(ultrafiltration failure,UFF)是PD患者退出PD最重要的原因。臨床研究已經(jīng)確定了幾種防治PF的策略，包括使用新型腹膜透析液[3]、腹透液添加藥物單體[4]、間充質(zhì)干細(xì)胞治療[5]和羅格列酮[6]、維生素B1衍生物都具有有益的作用，但是PF的最佳治療方案尚未確立，PF仍然威脅PD患者生命。獲得PF的病理生理知識(shí)并制訂相應(yīng)的治療策略是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵，許多關(guān)于PF的研究都依賴于體內(nèi)動(dòng)物模型或基于體外細(xì)胞系統(tǒng)，理想的PF動(dòng)物模型其疾病進(jìn)展和特征應(yīng)與PF患者相似。本文從腹膜纖維化發(fā)病機(jī)制、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模方法、每種模型的優(yōu)缺點(diǎn)及中醫(yī)藥抗腹膜纖維化的應(yīng)用等方面，總結(jié)了近年來常用的感染性腹膜炎、非感染性腹膜炎致腹膜纖維化大鼠模型的研究進(jìn)展，旨在為腹膜纖維化的發(fā)生機(jī)制、抗纖維化藥物的篩選等研究中的動(dòng)物模型選擇提供參考。

1 PF 的發(fā)病機(jī)制

盡管PF的主要病因不清楚，但很可能是多因素作用的結(jié)果。PD期間，反復(fù)發(fā)作的腹膜炎癥、低生物相容性腹膜透析液的長期暴露、PD開始前尿毒癥本身均可能導(dǎo)致腹膜結(jié)構(gòu)改變，包括間皮下增厚和血管病變[7]。持續(xù)暴露于這些危險(xiǎn)因素最終可能導(dǎo)致PF，但是尚不明確這些因素中每個(gè)因素對(duì)腹膜損傷發(fā)展的貢獻(xiàn)程度。

腹膜炎癥的反復(fù)發(fā)作在PF的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中十分重要。首先，反復(fù)發(fā)作的腹膜炎癥是PD患者死亡的重要原因。雖然腹膜炎的病死率僅3%，但它的發(fā)生率卻很高，每43～47例患者就有1例患者每月發(fā)生1次，據(jù)報(bào)道，16%～18%的PD患者因?yàn)楦腥綪D相關(guān)性腹膜炎癥而死亡[8-10]。其次，反復(fù)發(fā)作的腹膜炎癥是PD患者腹膜免疫功能下降的重要因素。ESRD選擇PD患者體內(nèi)通常存在不同程度的微炎癥狀態(tài)，腹膜長期暴露于低生物相容性腹膜透析液中，對(duì)腹膜的結(jié)構(gòu)和免疫功能均產(chǎn)生一定的影響，表現(xiàn)為T細(xì)胞中TH2 和 TH1 細(xì)胞失去平衡，促炎癥因子上調(diào)、抗炎癥因子下調(diào)最終導(dǎo)致免疫紊亂，免疫功能下降。第三，反復(fù)發(fā)作的腹膜炎癥是PD患者殘余腎功能下降的風(fēng)險(xiǎn)之一。腹膜炎癥發(fā)作的次數(shù)與殘余腎功能水平具有相關(guān)性，發(fā)生腹膜炎的次數(shù)越多殘余腎功能水平越低，最終完全無尿。第四，反復(fù)發(fā)作的腹膜炎癥PD患者腹膜損傷的重要原因。腹膜炎能引起腹膜硬化、腹膜纖維化及其導(dǎo)致的腹膜超濾功能衰竭等嚴(yán)重后果，導(dǎo)致PD患者退出PD。

有研究顯示，低生物相容性腹膜透析液，特別是那些高滲、高葡萄糖濃度、乳酸含量，低pH值、葡萄糖降解產(chǎn)物(GDPs)和晚期糖基陽離子終產(chǎn)物(AGEs)的溶液可以刺激各種炎癥因子上調(diào)，如白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)等[11]。這些高表達(dá)的因子反過來又能促進(jìn)炎性細(xì)胞活化進(jìn)而加重腹膜損傷，引起腹膜纖維增生。此外，GDPs本身對(duì)腹膜細(xì)胞有毒性，還能加快AGEs的合成，最終結(jié)果是過表達(dá)的AGEs與糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)結(jié)合，導(dǎo)致RAGE激活并參與介導(dǎo)氧化應(yīng)激的多種信號(hào)通路促進(jìn)了活性氧(ROS)的上調(diào)，引起組織損傷并激活TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)被證實(shí)為激活纖維化途徑的關(guān)鍵分子[12]，可介導(dǎo)腹膜損傷、炎癥及纖維化之間的相互轉(zhuǎn)化從而加重腹腔粘連。此外，TGF-β1刺激間皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞(PMC)發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)等致使纖維化的發(fā)生[13]，并減少降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的酶的產(chǎn)生，包括膠原酶、肝素酶和溶血素。因此低生物相容性腹膜透析液在PF的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。

上述研究表明，反復(fù)發(fā)作的腹膜炎癥、低生物相容性腹膜透析液的長期暴露等因素在腹膜損傷發(fā)展到腹膜功能衰竭中起著至關(guān)重要的作用。PF動(dòng)物模型的建立對(duì)改善腹膜炎所致的腹膜損傷、腹膜纖維化有重要意義，對(duì)闡明PF的機(jī)制和發(fā)展以及測(cè)試PF的防治有重要的意義。已開發(fā)出具有與PD相關(guān)性腹膜炎(包括感染性和非感染性腹膜炎)致PF相同的病理特征的動(dòng)物模型。

2 動(dòng)物模型

動(dòng)物模型應(yīng)基于實(shí)際PF中與臨床相關(guān)的危險(xiǎn)因素，迄今為止，由于難以完全再現(xiàn)PF的病理學(xué)，已經(jīng)使用了幾種不同的方法，模仿腹膜炎改變腹膜組織來誘導(dǎo)腹膜纖維化。動(dòng)物模型中建議的腹膜纖維化模型方法包括PD相關(guān)的感染性腹膜炎模型、非感染性腹膜炎模型。

2.1感染性腹膜炎模型 感染性腹膜炎是由細(xì)菌、真菌或其他微生物感染引起的，包括使用金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌等[14-15]，注射方式為反復(fù)腹膜內(nèi)注射或植入導(dǎo)管將真菌、細(xì)菌注入腹腔，從而誘導(dǎo)急性腹膜炎癥。這些急性傳染性腹膜炎模型主要用來闡述腹膜急性炎癥或腹膜急性損傷的機(jī)制，通常不用于研究PF。Hautem等[16]報(bào)道直接腹腔注射細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖(LPS)10 mg/kg誘導(dǎo)腹膜炎，模擬PD合并間歇性炎癥刺激致PF，LPS造模方法與臨床PD相關(guān)性PF比較接近。還有一些學(xué)者利用聚維酮碘等增塑劑、酸性溶液和化學(xué)刺激物，例如脫氧膽酸鹽、二氧化硅或家用漂白劑誘導(dǎo)腹膜炎癥致腹膜纖維化[17-18]，但報(bào)道較少。

感染性腹膜炎致PF模型主要研究了腹膜急性炎癥和急性腹膜損傷的機(jī)制，能復(fù)制出部分PD相關(guān)性腹膜炎致PF的特征，可以用于觀察不同藥物對(duì)腹膜炎癥的療效或用于測(cè)試防治腹膜炎癥的新藥。此外，它還可以用于查找腹膜炎癥的早期指標(biāo)。該造模方法的優(yōu)點(diǎn)是手術(shù)過程簡單，建立模型所需的時(shí)間相對(duì)較短。缺點(diǎn)是這些造模方法并未涉及新血管的生成，還容易造成導(dǎo)管堵塞、模型嚴(yán)重感染等后果，病死率較高，因此并未得到廣泛的應(yīng)用。

2.2非感染性腹膜炎模型 隨著PD技術(shù)的進(jìn)步,腹膜感染發(fā)生率降低,非感染性腹膜炎動(dòng)物模型亟待構(gòu)建。各種因素刺激，如高糖腹膜透析液(PDF)、脂多糖、葡萄糖酸鹽氯己定(CG)或甲基乙二醛(MGO)，都被認(rèn)為與腹膜纖維化有關(guān)。有學(xué)者使用脂多糖LPS(0.6 mg/kg)腹腔連續(xù)注射7 d引起腹膜損傷模型，結(jié)果表現(xiàn)為腹膜厚度增加，TGF-β1顯著升高，ECM大量沉積，腹膜超濾顯著降低，D4/D0明顯降低[19-20]；有研究者采用每日腹腔內(nèi)注射4.25% PDF(100 mL/kg)誘導(dǎo)大鼠腹膜炎癥[21]；另有報(bào)道使用尿毒癥大鼠模型采取高糖PDF(100 mL/kg)和LPS(0.6 mg/kg)的造模方法可以建立PD大鼠PF模型，表現(xiàn)為腹膜增厚、成纖維細(xì)胞增生、ECM大量沉積，血管增生等纖維化表現(xiàn)[22]；此外，有研究使用0.1%葡萄糖酸鹽氯己定CG(1 mL/100 g)腹腔連續(xù)注射3周后成模，可見模型TGF-β1、α-SMA表達(dá)增加[23-24]；有學(xué)者在模型大鼠腹膜內(nèi)注射4.25% PDF(100 mL/kg)和20 mM甲基乙二醛(MGO)連續(xù)2周誘導(dǎo)PF[25]。另有報(bào)道，有一種由機(jī)械刮擦腹膜引起腹膜急性炎癥從而誘導(dǎo)PF的模型，Nishimura等[26]和Mizuno等[27]首先報(bào)道了非感染性腹膜炎刮擦方法誘發(fā)的PF模型，Hewitson等[28]改進(jìn)了這種機(jī)械刮擦模型，在刮擦腹膜的基礎(chǔ)上每天添加5次酵母聚糖(5 mg/d)誘導(dǎo)腹膜炎、腹膜纖維化。Guo等[29]和Liu等[30]分別使用復(fù)制子缺陷并攜帶轉(zhuǎn)化生長因子β1基因腺病毒，通過腹膜內(nèi)注射1次給予，引起腹膜纖維化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的組織學(xué)改變。

在非感染性腹膜炎模型中，MGO、CG、PDF+LPS等腹腔注射的方法優(yōu)點(diǎn)是手術(shù)過程簡單，重復(fù)性較好，但反復(fù)穿刺可能有腹膜機(jī)械損傷及刺破內(nèi)臟的風(fēng)險(xiǎn)。經(jīng)導(dǎo)管注射可以避免這種反復(fù)穿刺的機(jī)械損傷，并且將導(dǎo)管植入腹腔最能真實(shí)地模擬臨床PD情況。此外，腹腔置管還能用來了解在PD過程中導(dǎo)管對(duì)腹膜的作用情況。缺點(diǎn)是外科手術(shù)難度較大，如果喂食，可能由于較高的感染風(fēng)險(xiǎn)而導(dǎo)致病死率增加[31]。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物PF大鼠模型雖出現(xiàn)血管增生、腹膜高轉(zhuǎn)運(yùn)等表現(xiàn)，但價(jià)格較貴、且要求的材料及技術(shù)水平較高，限制了其推廣應(yīng)用?，F(xiàn)以所查文獻(xiàn)做腹膜炎動(dòng)物模型特點(diǎn)的簡單評(píng)估，見表1。

表1 感染性、非感染性腹膜炎動(dòng)物模型的特點(diǎn)

2.3動(dòng)物模型的局限性 盡管以非生物相容性透析液(如PDF+LPS)注射的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂紤]了腹膜長期暴露于生物不相容的腹膜透析液、PD 微炎癥狀態(tài)、PD開始前尿毒癥本身對(duì)PF的影響。但應(yīng)使用正確反映PF發(fā)病機(jī)制(尤其是腹膜炎癥和新生血管形成)的合適的動(dòng)物模型來探討合適的PF治療方法。然而，單純利用腹膜在非生物相容性腹透液長期暴露的方法很難制作出與人類PF相一致的動(dòng)物模型。其中一個(gè)因素是時(shí)間跨度：腹膜透析患者需要很長時(shí)間才能發(fā)生PD相關(guān)性PF，但在動(dòng)物模型中誘導(dǎo)的腹膜纖維化改變卻發(fā)生在很短的時(shí)間內(nèi)，一般在4周以內(nèi)。此外，用于造模的試劑通常被注射到腹膜腔內(nèi)，反復(fù)穿刺會(huì)對(duì)腹膜組織造成機(jī)械性損傷[32]及多次腹腔注射本身引起的感染均可能干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

在使用動(dòng)物模型時(shí)，物種和品系的選擇至關(guān)重要。在 PD相關(guān)性PF或腹膜炎的模型中多使用齲齒動(dòng)物：大鼠或小鼠。大鼠和小鼠模型之間的主要區(qū)別是建立模型所需的時(shí)間長短以及所用藥物的量。通常要獲得相同的結(jié)果，大鼠模型需要的藥物和時(shí)間更多。大鼠的優(yōu)勢(shì)在于它可以獲得相對(duì)較多的樣品，但其需要的藥物及時(shí)間也更多。另一方面，由于轉(zhuǎn)基因模型的載體多為小鼠，使用小鼠進(jìn)行機(jī)制研究將更具有優(yōu)勢(shì)[33]。因此，動(dòng)物種類和品系的差異可能會(huì)影響活體研究的結(jié)果，需要在動(dòng)物模型中仔細(xì)評(píng)估腹膜結(jié)構(gòu)和功能。

3 PF動(dòng)物模型的中醫(yī)藥治療策略

長期使用 PD 治療最終會(huì)導(dǎo)致PF、超濾失敗和 PD 中斷。當(dāng)前沒有有效的療法來預(yù)防或延遲這種病理過程，其原因?yàn)閷?duì)PF的發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)有限及治療途徑狹窄。研究表明，臨床上許多現(xiàn)代抗纖維化藥物可能有效，但存在一些較大的不良反應(yīng)，如干咳、血肌酐水平增高等[34]; 中醫(yī)中藥具有療效好、毒副作用較小及價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，成為近年來防治PD相關(guān)性腹膜纖維化研究熱點(diǎn)[35]。中醫(yī)藥的應(yīng)用在纖維化動(dòng)物模型抗纖維化研究中取得長足進(jìn)展。

3.1中藥策略 近年來，通過應(yīng)用不同的PF動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)許多中藥，包括中藥單體、中藥復(fù)方及中成藥等對(duì)PD相關(guān)性PF防治具有重要作用。其中，利用動(dòng)物模型結(jié)合其他交叉學(xué)科、新技術(shù)，如中醫(yī)中藥治療PF機(jī)制可呈現(xiàn)在代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、腸道菌群、免疫等方面，并取得一定的進(jìn)展，見表2。通過探究中醫(yī)藥治病機(jī)制的過程也可為全面認(rèn)識(shí)PF提供了更好的研究方向。

表2 PF動(dòng)物模型在抗纖維化中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

3.2針灸策略 通過中藥的應(yīng)用，我們可以看出中醫(yī)藥在防治腹膜炎癥、PF中的潛力和優(yōu)勢(shì)。但PF患者病情急、相關(guān)并發(fā)癥多，口服藥物可能具有的腎臟毒性，不利于殘余腎功能的保護(hù)。研究顯示，針灸可以改善PD患者腎功能，提高患者生活質(zhì)量。姜新龍等[36]通過臨床發(fā)現(xiàn)針灸可改善患者臨床癥狀，減輕尿蛋白生成,改善腎功能；Yu等[37]發(fā)現(xiàn)針刺治療后，SCr下降、腎小球?yàn)V過率上升患者腎功能得到改善；聶峰等[38]針灸患者后發(fā)現(xiàn)，患者24 h尿蛋白定量下降明顯，SCr明顯降低，患者腎功能得到改善。

3.3中醫(yī)“證候”的腹膜纖維化動(dòng)物模型 辨證論治是中醫(yī)的特色，在中醫(yī)藥抗PD相關(guān)性PF中據(jù)有重要地位;建立中醫(yī)PF“證候”的動(dòng)物模型，是中醫(yī)藥抗PD相關(guān)性PF研究的難點(diǎn)之一。一些學(xué)者結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論，就建立腹膜纖維化對(duì)應(yīng)的中醫(yī)“證候”動(dòng)物模型進(jìn)行了有益探討。孟立鋒等[39]采5/6腎切除聯(lián)合腹腔注射PDF造模法，發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)毛發(fā)稀疏、反應(yīng)遲鈍、喜好蜷臥等癥狀，且逐漸出現(xiàn)形體消瘦等癥狀，建立了中醫(yī)脾氣虧虛證的PF動(dòng)物模型。鄭登勇等[40]認(rèn)為PF中醫(yī)亦屬于“微型癥積”“血瘀證”范疇，PDF聯(lián)合LPS腹腔注射可建立血瘀證型PF動(dòng)物模型。此外，還有研究認(rèn)為痰瘀交結(jié)是腹膜纖維化的主要病機(jī)，采取PDF加紅霉素腹腔注射可建立痰瘀交結(jié)證型PF模型[41]。

4 小結(jié)與展望

獲得PF的病理生理知識(shí)并制訂相應(yīng)的防治手段對(duì)改善患者預(yù)后至關(guān)重要；使用PF動(dòng)物模型并評(píng)估可能導(dǎo)致PF的危險(xiǎn)因素對(duì)研究PF病理生理過程至關(guān)重要；建立標(biāo)準(zhǔn)PF模型對(duì)于分析數(shù)據(jù)并使之適應(yīng)臨床至關(guān)重要。但由于臨床PD相關(guān)性PF發(fā)病的復(fù)雜性，目前暫無公認(rèn)的用于PF研究的標(biāo)準(zhǔn)模型，也難以完全復(fù)制PF的病理生理過程，各研究中模型動(dòng)物的選擇、造模方法、給藥途徑、模型評(píng)價(jià)方法等也存在較大差別。研究者基于不同的研究目的、研究方向去選擇合適的PF動(dòng)物模型，在現(xiàn)有的嚙齒類動(dòng)物外，重視非嚙齒類PF動(dòng)物模型的研究，更精準(zhǔn)地模擬PD患者臨床狀況，是今后研究的重點(diǎn)之一。PF動(dòng)物模型應(yīng)用于中醫(yī)藥抗PD相關(guān)性PF的研究取得了一定的進(jìn)展，表明中醫(yī)藥在一定水平可以改善腹膜超濾功能，延緩腹膜超濾衰竭發(fā)生的時(shí)間，彌補(bǔ)了當(dāng)前PDF和PD技術(shù)本身的欠缺，有著不錯(cuò)的研究遠(yuǎn)景。當(dāng)前，大多數(shù)研究偏重于相應(yīng)的藥理實(shí)驗(yàn)研究，選擇動(dòng)物模型的標(biāo)準(zhǔn)也未十分明確。如何將傳統(tǒng)中醫(yī)理論與現(xiàn)代新技術(shù)和交叉學(xué)科聯(lián)合應(yīng)用，從而深入探究PD相關(guān)性PF的病理、藥物作用機(jī)制，是一個(gè)很有意義的探索方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。