賈尊尊, 付開赟, 丁新華, 吐爾遜·阿合買提,姜衛(wèi)華，王小武, 郭文超

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，烏魯木齊 843005；2. 新疆農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091；3. 南京農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，南京 844200；4. 新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】 外來入侵性昆蟲由于其強繁殖力及適應性，使得入侵地的生態(tài)平衡遭到破壞[1]，煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)是入侵性極強的農(nóng)業(yè)害蟲[2]，對于寄主植物危害在于刺吸葉片使得葉片生理性受損，分泌蜜露造成葉片煤污病，還會攜帶植物病毒病[3]。煙粉虱是使用口器刺入植物葉片組織吸取營養(yǎng)，造成植株葉片退綠或萎蔫，誘導植物的防御機制產(chǎn)生[4]，煙粉虱所攜帶的棉花曲葉病毒(Cotton leaf curl virus, CLCuV) 對棉花生產(chǎn)造成威脅[5]。研究不同蟲口密度煙粉虱在不同時間脅迫棉花苗期植株后，觀察其體內(nèi)丙二醛、脯氨酸、過氧化氫酶、可溶性蛋白含量、可溶性糖和葉綠素含量的變化，分析棉花對煙粉虱造成的蟲害脅迫所產(chǎn)生的防御機制產(chǎn)生的生理生化影響，進一步研究煙粉虱與棉花的互作關(guān)系，對控害和預防煙粉虱的發(fā)生有重要意義。【前人研究進展】 葉綠素是植物光合作用關(guān)鍵物質(zhì)[6]，其含量可受多種逆境的脅迫而下降，與植物的光合能力、發(fā)育階段相關(guān)性顯著，也是植物抗逆性生理指標之一[7]。植物營養(yǎng)物質(zhì)在昆蟲取食后其含量發(fā)生變化，其變幅決定了植物對昆蟲的防御能力[8]，可溶性糖能夠刺激昆蟲取食，也是其重要營養(yǎng)物質(zhì)和能量來源[9]；可溶性蛋白含量的高低影響昆蟲生長發(fā)育與存活率[10]，植物氨基酸含量的高低與植物抗蟲性密切相關(guān)[11]，脯氨酸(Pro)是一種多功能的氨基酸，主要維持植物遭受逆境脅迫下細胞的正常功能，其作用可協(xié)助調(diào)控細胞氧化還原勢和穩(wěn)定細胞滲透壓等[12-14]。丙二醛(MDA)是植物膜脂過氧化反應的代謝產(chǎn)物[15]，過氧化氫酶(CAT)是抗氧化活性氧代謝相關(guān)的關(guān)鍵性酶，其作用可以緩解MDA的積累，使得植物形成對脅迫的防御機制，提高植物的抗性[16-17]?！颈狙芯壳腥朦c】 昆蟲與寄主植物之間生態(tài)關(guān)系隨著時間不斷進化演變逐漸形成某種化學聯(lián)系[18]，植物對昆蟲會產(chǎn)生一種防御機制來抵擋昆蟲的攻擊、產(chǎn)生次生代謝物質(zhì)以吸引天敵或者恢復受害部[19]，這種防御機制具體表現(xiàn)為植物自身體內(nèi)生理生化指標變化，如葉綠素的變化改變光合作用，保護酶增多、滲透物質(zhì)增加，次生代謝物質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生變化等[20-21]。亟需研究不同密度與不同為害時間下，棉花植株對煙粉虱持續(xù)取食脅迫所產(chǎn)生防御應答響應。【擬解決的關(guān)鍵問題】 研究煙粉虱在不同蟲口密度與為害時間下，棉花苗期葉片的營養(yǎng)物質(zhì)及代謝物質(zhì)可溶性蛋白、可溶性糖、葉綠素、丙二醛、脯氨酸及過氧化氫酶含量動態(tài)變化規(guī)律，分析煙粉虱與棉花植株的互作關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 煙粉虱

MED煙粉虱采自新疆農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所內(nèi)，寄主植物為南瓜，分別使用COI測序以及CAPs方法[22]鑒定為Mediterraean (MED) 隱種，后在NJ-135棉花植株上罩籠擴繁。使用棉花NJ-135，催芽后移入盆內(nèi)在養(yǎng)蟲網(wǎng)內(nèi)移栽，長至8片葉后接蟲。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

取棉花苗期植株，罩籠140目尼龍網(wǎng)，單株分別接蟲0頭、50頭、500頭煙粉虱，重復5次，成蟲分別取食24、48和72 h后采樣，后用于相關(guān)指標的測定。

1.2.2 測定指標

1.2.2.1 植物營養(yǎng)物質(zhì)

采用蒽酮比色法植物可溶性糖測定[23]，糖與濃硫酸發(fā)生經(jīng)脫水反應會生成糖醛或者羥甲基糖醛，所生成的糖醛或羥甲基糖醛均可與蒽酮顯色反應，可生成藍綠色的衍生物，在630 nm可見光下測定其吸光度值。

植物可溶性蛋白測定使用BCA法[24]，在堿性的條件下，蛋白可將二價銅離子還原為一價銅離子，同時一價銅離子可與BCA試劑發(fā)生顯色反應形成紫色絡合物，在562 nm處有最大的吸收峰，吸光度與濃度成正比，測吸光度，計算待測蛋白的濃度。

測定植物體內(nèi)所含有的氨基酸中的脯氨酸(PRO)使用酸性茚三酮與其發(fā)生的相關(guān)顯色反應所生成紅色產(chǎn)物，測定515 nm可見光的吸光度值[25]。

1.2.2.2 植物葉綠素

葉綠素a和葉綠素b在663 nm分別具有最大吸收峰，根據(jù)葉綠素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計在最大吸收波長測定其吸光度，從而計算總?cè)~綠素含量[26]。

1.2.2.3 丙二醛

使用TBA法，MDA可以與硫代巴比妥酸(TBA)縮合發(fā)生顯色反應，最終反應生成紅色產(chǎn)物，在532 nm處會有最大的吸收峰，隨后使用測得吸光度計算丙二醛濃度[27]。

1.2.2.4 過氧化氫酶

使用鉬酸銨法，H2O2與鉬氨酸的反應[28]，產(chǎn)生的絡合物為淡黃色，加入鉬氨酸可使過氧化氫酶(Catalase)分解H2O2的反應迅速終止，在405 nm處可有最大峰，計算過氧化氫酶活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸、葉綠素、丙二醛及過氧化氫酶的含量使用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件的鄧肯 (Tukey) 進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時間與密度的蟲害脅迫下棉花營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化

研究表明，24、48和72 h的處理組中，對照間差異不顯著(16.16, 16.77和18.10 mg/g)。在50頭/株的處理下，隨著煙粉虱持續(xù)取食時間延長，可溶性糖含量降低。在處理24、48和72 h后，可溶性糖含量降低(16.77，15.83和15.64 mg/g)，但差異性不顯著；在500頭/株密度下，可溶性糖含量降低且程度增大，隨著持續(xù)取食時間的延長在24、48和72 h其含量依次為18.10、15.75和7.84 mg/g，處理72 h與處理24和48 h含量存在顯著性差異。在相同的煙粉虱持續(xù)取食時間下，取食24 h后隨著蟲口密度的增加可溶性糖含量上升，500頭/株的含量最高，差異性不顯著；取食48和72 h，均表現(xiàn)為隨著蟲口密度的增加可溶性糖含量下降；而取食72 h后，這種下降程度表現(xiàn)更加明顯，密度為50頭/株的處理組與對照組相比下降14 %，處理密度為500頭/株，下降了57 %，僅密度為500頭/株處理組與對照相比可溶性糖含量差異性顯著。圖1

煙粉虱持續(xù)取食脅迫下，棉花葉片的總蛋白含量均上升。對于50頭/株處理組，隨著為害時間的延長總蛋白的含量逐漸升高，24、48和72 h總蛋白含量分別為3.23、4.87和5.55 μg/mL，且差異性顯著；500頭/株處理組，隨著為害時間的延長總蛋白含量同樣也為逐漸升高的趨勢，24、48和72 h總蛋白含量分別為3.84、5.38和5.92 μg/mL；在相同處理時間，可溶性蛋白的含量隨著蟲口密度的升高而升高。圖2

煙粉虱對棉花植株為害后，棉花葉片脯氨酸含量隨為害時間延長其含量逐漸升高，500頭/株處理組，為害72 h下與為害24和48 h具有顯著性差異，且處理48 h與處理24 h相比脯氨酸含量增加11%，而處理72 h與處理24 h相比脯氨酸含量增加36%。隨著為害時間的延長，50頭/株的處理組脯氨酸含量升高，差異不顯著，對于不同處理時間下，處理組與對照組相比，為害密度越大其脯氨酸含量升高，且隨著為害延長，這種現(xiàn)象更加明顯，在72 h處理時間下，隨蟲口密度增加，脯氨酸含量升高(0.85, 0.92和1.21 μg/g)，50頭/株脯氨酸含量與對照組差異性不顯著，而500頭/株處理組與50頭/株和對照均表現(xiàn)為脯氨酸含量顯著升高。圖3

圖1 不同煙粉虱密度與持續(xù)取食時間下棉花葉片可溶性糖含量變化Fig.1 Soluble sugars content of cotton leaves treated under different whitefly densities or stress time

圖2 不同煙粉虱密度與持續(xù)取食時間下棉花葉片總蛋白含量變化Fig.2 Total protein content of cotton leaves treated under different whitefly densities or stress time

圖3 不同煙粉虱密度與持續(xù)取食時間下棉花葉片脯氨酸含量變化Fig.3 Proline content of cotton leaves treated under different whitefly densities or stress time

2.2 不同時間與蟲口密度的蟲害脅迫下棉花丙二醛含量變化

研究表明，隨著為害時間的延長，蟲口密度分別為50與500頭/株處理組棉花葉片丙二醛含量均先降低后升高。在相同為害時間，蟲口密度越高其丙二醛含量越高，且處理組與對照組相比其含量變化隨著為害時間延長，丙二醛含量變幅越大，在72 h時，500頭/株的處理組與對照相比增加55%，而50頭/株的處理組與對照組相比增加34%，而為害時間在24和48 h時，500頭/株與對照相比分別增加33%和19%；50頭/株與對照組相比分別增加13%和0%。圖4

圖4 不同煙粉虱密度與持續(xù)取食時間下棉花葉片丙二醛含量變化Fig.4 Malondialdehyde content of cotton leaves treated under different whitefly densities or stress time

2.3 不同時間與蟲口密度的蟲害脅迫下棉花過氧化氫酶(CAT)含量變化

研究表明，相同處理時間下，過氧化氫酶活力變化均隨為害密度增大而增加(6.42, 9.81和12.42 U/mg prot；7.40,10.98和15.29 U/mg prot；10.74,18.45和19.16 U/mg prot)；相同處理密度下，過氧化氫酶活力變化隨煙粉虱持續(xù)取食時間延長而增大。在煙粉虱持續(xù)取食24和48h， 500頭/株與對照間均差異性顯著。在煙粉虱持續(xù)取食72 h后，50頭/株和500頭/株處理組與對照組相比均差異性顯著。圖5

2.4 不同時間與蟲口密度的蟲害脅迫下棉花植物葉綠素含量變化

研究表明，24和48 h處理，處理組與對照組隨著蟲口密度的增加葉綠素含量顯著下降，而在為害時間延長至72 h，50頭/株處理組與500頭/株對于50頭處理組間葉綠素含量差異性不顯著，但與對照間均表現(xiàn)差異性顯著增高的情況。500頭/株隨著為害時間的延長，葉綠素含量升高，48 h比24 h升高72%，72 h比48 h升高129%，對于50頭/株處理組，葉綠素含量先下降30%后上升113%。不同處理密度，隨著為害時間的延長，棉花葉片內(nèi)葉綠素含量呈現(xiàn)下降后上升的情況，對照間無顯著性差異。圖6

圖5 不同煙粉虱密度與持續(xù)取食時間下棉花葉片過氧化氫酶含量變化Fig.5 Catalase content of cotton leaves treated under different whitefly densities or stress time

圖6 不同煙粉虱密度與持續(xù)取食時間下棉花葉片葉綠素含量變化Fig.6 Chlorophyll content of cotton leaves treated under different whitefly densities or stress time

3 討 論

植物對蟲害脅迫的響應表現(xiàn)為不同物質(zhì)的生理生化指標在昆蟲為害后發(fā)生改變，如營養(yǎng)物質(zhì)、次生代謝物質(zhì)、防御酶以及植物激素等，變化來抵御昆蟲侵害[29]。煙粉虱的口器為刺吸式，其為害作物的方式為吸食食物葉片造成植物生理性受損[30]，發(fā)現(xiàn)煙粉虱對棉花進行取食脅迫后，棉花葉片的營養(yǎng)物質(zhì)中可溶性糖、可溶性蛋白和游離氨基酸脯氨酸均產(chǎn)生了不同程度的變化，且變化程度與煙粉虱的為害密度和為害時間密切相關(guān)，72 h的處理時間中，可溶性糖的含量隨著為害密度升高含量降低，隨著為害時間延長含量降低，脯氨酸和總蛋白含量的變化是隨著為害密度的升高而含量升高，隨著為害時間的延長含量上升。植物的可溶性糖是存在于葉肉細胞中的營養(yǎng)物質(zhì)，也是植物的抗逆性境調(diào)控的重要組成物質(zhì)，是刺吸式口器昆蟲直接吸食的物質(zhì)，隨著昆蟲的吸食使得葉片中可溶性糖含量降低，與前人研究結(jié)論一致[23]，脯氨酸和總蛋白含量的變化，很大可能性是植物本身的防御機制對刺吸式口器昆蟲為害產(chǎn)生的一種生理補償反應，是對蟲害脅迫的應答，其體內(nèi)總蛋白含量上升，脯氨酸含量長期研究在植物受到逆境脅迫的條件下會在植物體內(nèi)積累[31]，最初發(fā)現(xiàn)游離的脯氨酸的大量積累的現(xiàn)象出現(xiàn)在萎蔫的黑麥草中[32]，脯氨酸長期研究發(fā)現(xiàn)其作用是作為細胞的有效滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，同時能夠保護酶和膜的結(jié)構(gòu)，一直以來相關(guān)研究多將脯氨酸作為細胞結(jié)構(gòu)與功能受損評價指標[31]。在較低密度煙粉虱為害棉花葉片，棉花葉片的葉綠素含量是先下降后上升的，而對于較高蟲口密度下對棉花為害，葉綠素含量隨處理時間延長而升高。

植物在蟲害脅迫的情況下，其體內(nèi)保護酶系的含量和活性上升可用于維持植物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除之間的平衡，預防膜脂過氧化的反應的發(fā)生[33]；但當蟲害脅迫的時間及脅迫的程度加劇，使得活性氧、自由基產(chǎn)生就會明顯增加，破壞植物體內(nèi)保護酶系能夠維持的平衡，導致自由基積累，造成膜脂過氧化。丙二醛(malondialdchydc MDA)是膜脂過氧化反應的產(chǎn)物之一，通常利用它作為脂質(zhì)過氧化指標，表示細胞膜脂過氧化程度和對逆境地條件反應的強弱[34-37]。研究發(fā)現(xiàn)，不同密度為害棉花葉片內(nèi)丙二醛的含量隨著為害時間的增長其變化是先降低再升高的，而在相同為害時間內(nèi)，丙二醛含量隨著蟲害密度增加而升高。過氧化氫酶CAT是ROS系統(tǒng)中的一種關(guān)鍵性的保護酶，是植物體內(nèi)常見的以鐵卟啉為輔基的酶類清除劑其主要功能是促使過氧化氫分解為氧和水，避免過氧化氫的積累，以維護細胞膜的穩(wěn)定性[38-39]，通過系統(tǒng)研究了煙粉虱不同密度和取食持續(xù)時間對棉花防御酶酶活性、營養(yǎng)物質(zhì)與代謝產(chǎn)物含量的變化，發(fā)現(xiàn)了CAT活性變化、蛋白質(zhì)、可溶性糖、脯氨酸、丙二醛和葉綠素的含量變化均與煙粉虱取食棉花葉片相關(guān)。研究僅從煙粉虱MED隱種為害棉花葉片，在不同為害時間和為害密度的條件下其葉片的營養(yǎng)物質(zhì)以及葉綠素、丙二醛以及相關(guān)防御酶等物質(zhì)含量變化的角度去揭示棉花受蟲害脅迫后其防御應答機制，但對于更深層次的原因還需要進一步的發(fā)掘和研究。

4 結(jié) 論

4.1棉花對煙粉虱持續(xù)取食脅迫產(chǎn)生應答響應，與棉花生理生化性質(zhì)改變相關(guān)。煙粉虱對棉花的取食為害作用部位一般在葉片背面，在棉花葉片上，不同取食密度和持續(xù)取食時間均是造成棉花葉片營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物和防御酶活力發(fā)生變化的原因。

4.2不同密度煙粉虱持取食棉花葉片后，葉片中3種營養(yǎng)物質(zhì)含量動態(tài)變化不同。在持續(xù)取食24 h后，棉花葉片可溶性糖含量隨密度升高逐漸增高(16.16, 16.77 和18.10 mg/g)；在持續(xù)取食48和72 h后，其含量均隨密度升高而降低，取食時間延長會增加降低的程度?？偟鞍缀侩S著煙粉虱密度增加而升高，隨煙粉虱持續(xù)取食時間延長而升高，在500頭/株處理下，煙粉虱脅迫72 h 后，含量最高(5.92 μg/mL)。脯氨酸含量的變化與總蛋白含量動態(tài)變化情況一致，均隨著煙粉虱密度增加而升高，隨煙粉虱持續(xù)取食時間延長而升高，脯氨酸含量在500頭/株處理組持續(xù)取食72 h后含量最高。

4.3丙二醛含量在不同密度煙粉虱持取食后，隨著持續(xù)取食時間延長，丙二醛含量在50和500頭/株處理密度下呈現(xiàn)先降低后升高的情況。在24和72 h處理下隨煙粉虱處理密度升高含量升高。

4.4植物防御酶CAT隨著煙粉虱處理密度增高和持續(xù)取食時間延長，含量均升高。葉綠素在煙粉虱持續(xù)取食24和48 h含量隨密度升高而下降，72 h測定含量隨取食密度升高而升高(1.55, 1.92和1.98 mg/g)。