周曉明，張付春，鐘海霞，張 雯，韓守安，伍新宇，潘明啟

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】酒石酸與蘋果酸是葡萄果實(shí)中最重要的有機(jī)酸，是轉(zhuǎn)色期前葡萄漿果中積累的主要可溶性有機(jī)成分，兩者占漿果總酸的70%～90%[1]。葡萄果實(shí)中酒石酸的積累代謝相對穩(wěn)定。蘋果酸積累與分解受環(huán)境因素影響較大，特別是轉(zhuǎn)色期前后及成熟期的氣候條件[2]。新疆葡萄栽培產(chǎn)區(qū)存在成熟期短且氣溫較高等現(xiàn)象，導(dǎo)致釀酒葡萄的酸度相對偏低。研究葡萄果實(shí)中蘋果酸等有機(jī)酸的代謝規(guī)律，對葡萄品質(zhì)調(diào)控技術(shù)的改良有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蘋果酸(malic acid, malate)是一種四碳二羧酸,參與許多細(xì)胞代謝, 還作為碳素和還原力載體在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞器以及細(xì)胞器之間傳遞碳素和還原力。轉(zhuǎn)色前期蘋果酸的積累主要依靠糖代謝轉(zhuǎn)運(yùn)至漿果內(nèi)以及潛在的漿果光合作用生成[3]。轉(zhuǎn)色后期蘋果酸從液泡中釋放出來并參與各類分解代謝反應(yīng)，包括TCA循環(huán)、呼吸作用、糖異生反應(yīng)、氨基酸互化、乙醇發(fā)酵，以及產(chǎn)生系列復(fù)雜的此生代謝產(chǎn)物如花色苷和黃酮醇[4-6]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、蘋果酸脫氫酶(NAD-MDH)、蘋果酸酶(NADP-ME)是果實(shí)參與蘋果酸代謝的3種關(guān)鍵酶[7-9]。PEPC能利用碳酸根將PEP縮合成OAA。其活性在漿果發(fā)育早期一直保持較高水平，其變化與蘋果酸含量積累變化相一致，在漿果成熟開始之前其活性迅速降低。MDH能催化OAA與蘋果酸之間的可逆反應(yīng)，并維持二者之間的平衡。ME能夠降解蘋果酸并將其脫羧變?yōu)楸?，催化二者的可逆反?yīng)，在葡萄[10]、蘋果[11]、梨[12]等果實(shí)上的研究結(jié)果表明，NADP-ME活性與蘋果酸含量呈負(fù)相關(guān)。對櫻桃[13]、歐洲李[14]的果實(shí)發(fā)育研究，均表明NAD-MDH和NADP-ME 活性分別與蘋果酸含量呈極顯著的正、負(fù)相關(guān)，其共同作用造成了不同品種果實(shí)中蘋果酸的積累差異。葉幕形對葡萄果實(shí)的品質(zhì)有較大的影響。不同的葉幕高度[15]、厚度處理[16]，可以改變葡萄的光合作用效率及果實(shí)生長區(qū)域微氣候環(huán)境，影響葡萄的果實(shí)品質(zhì)。楊君[17]比較了直立葉幕和V形葉幕下赤霞珠葡萄的果實(shí)品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)V形葉幕果實(shí)著色較好，單株產(chǎn)量、可溶性固形物含量以及果皮的總黃烷醇、總花色苷含量均高于直立葉幕?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在廠形樹形的基礎(chǔ)上進(jìn)行簡約化的葉幕形處理，從而達(dá)到調(diào)控葡萄果實(shí)蘋果酸代謝方面的研究至今鮮有報(bào)道。需研究不同葉幕形果實(shí)蘋果酸等有機(jī)酸的積累代謝及蘋果酸相關(guān)代謝酶活性的變化規(guī)律。【擬解決的關(guān)鍵問題】在廠形樹形的基礎(chǔ)上，設(shè)置對照直立形葉幕及2種高度的廠形葉幕，研究葉幕微氣候調(diào)控對赤霞珠葡萄果實(shí)蘋果代謝的影響及作用規(guī)律，為釀酒葡萄品質(zhì)的精準(zhǔn)化調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

采樣地點(diǎn)位于新疆烏魯木齊市新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院安寧渠試驗(yàn)場。葡萄為單主干樹形廠形架勢，2011年定植，南北行向，株行距1 m×3 m。

2017年7月19日～9月8日采樣。每隔10 d采樣1次，分別為葡萄盛花期后35 d(7月19日)、45 d(7月29日)、55 d(8月8日)、65 d(8月18日)、75 d(8月28日)、85 d(9月7日)、95 d(9月18日)。

每個(gè)單株分東西面各選2個(gè)果穗，從1個(gè)果穗的上、中、下共采5～8粒果實(shí)，混合樣分3份即為3個(gè)重復(fù)。果實(shí)采摘后立即用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，液氮速凍，破碎去除種子，于-40℃保存待測。

1.2 方 法

1.2.1 葉幕處理

盛花期后25 d(2017年7月9日)，在廠形樹形架勢的基礎(chǔ)上，設(shè)置頂端向西側(cè)生長型廠形葉幕H1及H2，二者頂端葉幕分別為距地面1.5 m及1 m。CK為對照處理，即直立形葉幕，頂端葉幕高度1.2～1.5 m。每種葉幕處理10株葡萄。3種葉幕形樹體生長過程簡約化修剪，保持葉果比相對一致，盡可能減少其他因素的交互影響。圖1

圖1 3種葉幕形示意Fig.1 Schematic diagram of three canopy types

1.2.2 指標(biāo)測定

1.2.2.1 酸組分

采用HPLC方法并參考林耀盛[18]的方法并進(jìn)行優(yōu)化。

檢測儀器及色譜條件：島津LC-20A高效液相色譜儀(配紫外檢測器)，Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)。流動相為甲醇與0.01 mol/L磷酸氫二銨緩沖液(3:97，磷酸調(diào)整pH=2.6)，檢測波長210 nm，柱溫25℃，流速0.5mL/min，進(jìn)樣量10 μL。酒石酸、蘋果酸、檸檬酸在10 min內(nèi)出峰完成。

1.2.2.2 酶活性

酶液的制備參照Hirai[19]及史娟[20]的方法。取3 g果肉用3 mL 研磨液在冰浴下研磨(4℃)，4 000 r/min離心20 min，取上清液定容至5mL，加入等體積(5 mL)提取液，即得NAD-MDH和NAD-ME 酶液，取4 mL在提取緩沖液中4℃透析過夜，即得PEPC 酶液。各項(xiàng)操作均在 0～4℃下進(jìn)行。研磨緩沖液：0.2 mol/L Tris-HCl，pH 8.2，0.6 mol/L蔗糖，10 mmol/L異抗壞血酸。提取緩沖液：0.2 mol/L Tris-HCl，pH8.2，10 mmol/L 異抗壞血酸，0.1% TritonX-100。

酶活性測定參考Hirai[19]及羅安才[21]等的方法。酶活性以U/(min·g)FW表示。

1.2.2.3 其他成分

果域微環(huán)境溫度：分別在3種葉幕處理的葡萄結(jié)果區(qū)域放置高精度溫度測量儀(路格L90-1)，每1 h記錄1次溫度變化。當(dāng)?shù)貧庀笳舅鶞y氣溫的日均溫度作為環(huán)境溫度以作參照。

總酸(TA)：參照國際《GB/T 12456-2008 食品中總酸的測定》的方法，結(jié)果以酒石酸計(jì)。

可溶性固形物(TSS)：ATAGO PAL-1數(shù)顯糖度計(jì)測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 26.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。使用Origin2020作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 果域微環(huán)境的溫度變化

研究表明，溫度變化為CK>H1>環(huán)境溫度>H2。環(huán)境溫度、CK、H1、H2的均溫分別為 23.3、24.2、23.4和22.7℃。CK的果域溫度高于環(huán)境溫度和其他處理。H1的果域溫度比CK低0.8℃，H2果域溫度比CK低1.5℃，H1的果域溫度比H2高0.7℃。

H1與H2的葉幕處理一定程度上起到了降低果域溫度的效應(yīng)。H1果域溫度高于H2。圖2

圖2 果域微環(huán)境的溫度變化Fig.2 Temperature change of the fruit-zone microenvironment

2.2 不同葉幕形有機(jī)酸含量變化

研究表明，L-酒石酸與L-蘋果酸在花后35～85 d的過程呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢，花后45～55 d變化幅度最為劇烈，該時(shí)段也是赤霞珠葡萄的轉(zhuǎn)色期?；ê?5 d L-酒石酸含量極小幅度的增高可能與成熟末期果實(shí)失水有關(guān)。赤霞珠果實(shí)的檸檬酸含量較低，在果實(shí)發(fā)育過程中呈現(xiàn)不規(guī)則變化，H1處理在較小范圍有含量略高于其他處理的趨勢。

成熟過程果實(shí)可溶性固形物含量呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢，在轉(zhuǎn)色期出現(xiàn)較大幅度的上升。酒石酸與檸檬酸占到總酸的82%～95%，二者是葡萄果實(shí)最主要的有機(jī)酸。總酸含量的變化趨勢與這2種酸的含量變化也基本一致。

CK處理的葡萄果實(shí)酒石酸、蘋果酸含量整體下降的幅度大于H1與H2處理?；ê?5 d，H1、H2處理的酒石酸含量分別為4.684、4.670 mg/g，比CK處理分別高0.774、0.760 mg/g；H1、H2處理的蘋果酸酸含量分別為1.038、1.065 mg/g，比CK處理分別高0.338、0.365 0 mg/g。H1與H2的葉幕處理與CK相比，一定程度上提高了果實(shí)酒石酸與蘋果酸的含量，成熟過程H1處理的果實(shí)酒石酸與蘋果酸含量整體呈現(xiàn)略高于H1的趨勢，但差別極小?；ê?5 d H2處理果實(shí)蘋果酸含量呈現(xiàn)高于H1的情況，但也僅為0.027 mg/g。圖3

圖3 不同葉幕形葡萄果實(shí)有機(jī)酸含量變化Fig. 3 Changes of organic acids in grape fruits with different canopy types

2.3 不同葉幕形蘋果酸代謝相關(guān)酶活性的變化

研究表明，果實(shí)PEPC酶活性在成熟過程整體呈現(xiàn)下降的趨勢。該酶參與的蘋果酸合成的作用可能逐漸減弱。

果實(shí)NAD-MDH酶活性在成熟過程也整體呈現(xiàn)下降趨勢。45～55 d時(shí)，大幅度的下降，該時(shí)期是赤霞珠葡萄轉(zhuǎn)色的關(guān)鍵時(shí)期。此時(shí)期的果實(shí)蘋果酸含量也有較大幅度的下降，該酶活性的降低可能對蘋果酸合成有較大影響。

NADP-ME酶活性在果實(shí)成熟過程中前期呈現(xiàn)較明顯的上升趨勢，中后期出現(xiàn)小范圍的下降。該酶與蘋果酸的分解有關(guān)，轉(zhuǎn)色期赤霞珠果實(shí)蘋果酸較大幅度的下降與該酶在這一階段的變化有較一致的正相關(guān)趨勢。圖4

2.4 蘋果酸代謝相關(guān)酶活性與蘋果酸含量及果域溫度變化的相關(guān)性

研究表明，CK處理與PEPC酶活性、H2處理與NAD-MDH酶活性達(dá)到極顯著正相關(guān)。CK處理與NAD-MDH酶活性顯著正相關(guān)，與NADP-ME酶活性顯著負(fù)相關(guān)。H1處理與PEPC酶活性及NAD-MDH酶活性顯著正相關(guān)。CK處理與蘋果酸合成代謝酶的相關(guān)性較好。表1

表1 蘋果酸相關(guān)代謝酶活性與蘋果酸含量相關(guān)性Table 1 Correlation between malate-related metabolic enzyme activity and malate content

階段性溫度變化與3種酶活性變化無顯著相關(guān)性。NAD-MDH與溫度的正相關(guān)性較高，NADP-ME與溫度呈現(xiàn)一定的負(fù)相關(guān)性。低溫可能不利于NADP-ME的活性升高，低溫帶來的效應(yīng)可能是減弱蘋果酸的降解。表2

圖4 不同葉幕形葡萄果實(shí)蘋果酸代謝相關(guān)酶活性變化Fig. 4 Changes of enzyme activities related to malate metabolism in grape fruits with different canopy types

表2 蘋果酸相關(guān)代謝酶活性與果域微環(huán)境溫度相關(guān)性Table 2 Correlation between the activity of malate-related metabolic enzymes and the temperature of the fruit-zone microenvironment

3 討 論

新疆地區(qū)的葡萄栽培需要進(jìn)行埋土防寒，在廠形樹形的基礎(chǔ)上，改變頂端的部分葉幕為西向廠形葉幕，在簡約化的基礎(chǔ)達(dá)到了對底部果實(shí)的部分遮陰效果，一定程度上改變了果域微環(huán)境的溫度。東西雙向的V形葉幕也是改變果域微環(huán)境及樹體光合效應(yīng)[22]的手段之一，但V形葉幕從結(jié)果部位以上的葉幕中底部開始改變?nèi)~幕形，操作相對較復(fù)雜。葡萄是喜陽光的植物，除了葉片的光合效應(yīng)，果實(shí)表面的光照對成分積累及代謝也有較為重要的作用[23]。V形葉幕遮陰作用較強(qiáng)，過早布置還會對果實(shí)有機(jī)酸等物質(zhì)的積累產(chǎn)生不利影響[24]。設(shè)置西向的廠形葉幕，可以有效降低午后的日照高溫對果域微環(huán)境的影響，東向果實(shí)仍可接受清晨及上午較為溫和的日光。較早的果實(shí)部分遮陰，對有機(jī)酸及其他成分積累的影響仍需深入研究。

葉幕形的調(diào)整在一定程度上達(dá)到了調(diào)控蘋果酸等有機(jī)酸代謝的目的。PEPC、NAD-MDH、NADP-ME 3種蘋果酸代謝相關(guān)酶變化與蘋果酸含量變化呈現(xiàn)出的相關(guān)性也與前人[10,25,26]的研究相吻合。3種代謝酶與果域溫度呈現(xiàn)出不同的相關(guān)性，但并未達(dá)到顯著水平，果實(shí)中蘋果酸的代謝可能受更復(fù)雜因素的影響。關(guān)于不同葉幕造成的樹體光合效應(yīng)的改變以及不同光照溫度對果實(shí)光合物質(zhì)代謝的影響，研究并未涉及，需要今后進(jìn)一步的深入研究。

葡萄果實(shí)酒石酸的積累代謝雖然相對穩(wěn)定[27]，但是試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)葉幕形的改變對酒石酸含量可能起到了一定的調(diào)控作用。葡萄中檸檬酸含量較低，其代謝可能受多方因素影響[28]，試驗(yàn)中的葉幕處理對其代謝的影響規(guī)律并不十分明確。

4 結(jié) 論

廠形葉幕與直立形葉幕相比，降低了赤霞珠葡萄果域微環(huán)境的溫度，2種廠形葉幕處理分別降低了0.8℃與1.5℃。廠形葉幕在一定程度上提高了酒石酸與蘋果酸的含量，2種廠形葉幕處理的葡萄果實(shí)酒石酸含量分別提高了0.774與0.760 mg/g，蘋果酸含量提高了0.338與0.365 mg/g。3種葉幕下，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶與果實(shí)蘋果酸含量呈現(xiàn)不同程度的正相關(guān)，蘋果酸酶與果實(shí)蘋果酸含量呈現(xiàn)不同程度的負(fù)相關(guān)。果域微環(huán)境溫度與3種酶未達(dá)到顯著相關(guān)。廠形葉幕處理可以在一定程度上提高赤霞珠果實(shí)的有機(jī)酸含量，H1高度處理可能是增高果實(shí)蘋果酸等有機(jī)酸含量的更有利選擇。