劉少玲，謝梅娟，譚雪群，嚴(yán)冰鳳，徐國(guó)良

（佛山市高明區(qū)中醫(yī)院康復(fù)科1，內(nèi)二科2，藥學(xué)部3，廣東 佛山 528500）

消化性潰瘍（peptic ulcer，PU）是一種粘膜發(fā)生壞死性病變和炎癥反應(yīng)，病變范圍可至粘膜肌層的疾病，是臨床上最常見的消化系統(tǒng)疾病之一。研究表明[1]，全球人群中約有10%的人一生中曾患過PU。我國(guó)PU 患者占10.3%～32.6%。PU 患者典型臨床癥狀為中上腹反復(fù)發(fā)作的節(jié)律性疼痛，亦有部分患者以上腹脹滿、厭食、反酸等胃腸道癥狀為主，嚴(yán)重者可發(fā)生穿孔、消化道出血等并發(fā)癥。隨著工作節(jié)奏加快和飲食習(xí)慣改變，PU 的發(fā)病率日益增高，給患者的身心健康和生活質(zhì)量帶來了嚴(yán)重負(fù)面影響[2]。1983年澳大利亞學(xué)者Warren 和Marshall 證實(shí)幽門螺桿菌（Helico-bacter pylori，Hp）與PU 的發(fā)生、發(fā)展以及復(fù)發(fā)關(guān)系密切，以?shī)W美拉唑、阿莫西林膠囊、克拉霉素、枸櫞酸鉍鉀膠囊四聯(lián)療法是當(dāng)前治療Hp 相關(guān)性PU 的基本手段。但國(guó)內(nèi)Hp 對(duì)甲硝唑、克拉霉素，左氧氟沙星等抗生素的耐藥率逐年上升，導(dǎo)致四聯(lián)療法對(duì)Hp 相關(guān)性PU 的臨床療效日漸下降[3]。因此，挖掘Hp 相關(guān)性PU 的中醫(yī)藥療法成為當(dāng)前消化內(nèi)科研究的熱點(diǎn)之一。PU 可歸屬于“胃脘痛”“痞滿”“吞酸”“嘈雜”等范疇，病位在胃，與肝脾關(guān)系密切。臨床上肝胃不和是本病較為常見的證型，脾升清胃降濁，依賴肝木疏泄，疏泄功能正常才可以升清降濁。肝主疏泄喜調(diào)達(dá)，情緒失暢則肝脾俱損，疏泄失常，肝氣郁滯，橫逆?zhèn)竸t胃氣滯塞，不通則痛。本病肝胃不和證型的代表方劑是柴胡疏肝散（Chaihu Shugan Powder，CSP），具有疏肝解郁，理氣止痛的功用。據(jù)目前相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[4]，CSP 抗PU 的臨床作用顯著。近年來新興學(xué)科網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從系統(tǒng)、整體的角度將藥物和疾病聯(lián)系起來，其多成分-多靶點(diǎn)-多途徑的研究方式與中醫(yī)學(xué)整體觀診療疾病的特點(diǎn)十分吻合，因而該學(xué)科十分適合用于中藥方劑作用機(jī)制的研究當(dāng)中。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)CSP 抗PU 的作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)性分析，為其進(jìn)一步研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 CSP 藥物活性成分篩選 將CSP 中藥物名稱（陳皮、柴胡、川芎、香附、枳殼、芍藥、甘草）輸入到中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/）“Herb name”搜索欄里，設(shè)定篩選條件為“口服生物利用度（oral bioavailability，OB 值）＞30%和藥物相似性（drug-likeness，DL 值）＞0.18”，最終得到CSP 活性成分。

1.2 CSP 藥物活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將CSP 全部活性成分輸入到PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），得到化合物的“Canonical SMILES”，然后將每個(gè)活性成分的“Canonical SMILES”輸入SwissTargetPrediction 平臺(tái)（http://www.swisstargetprediction.ch/），物種選擇“人類（Homo sapiens）”，預(yù)測(cè)CSP 活性成分的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 CSP 抗PU 的相關(guān)作用靶點(diǎn)收集 通過TTD（http://bidd.nus.edu.sg/BIDDDatabases/TTD/TTD.asp）、OMIM（http://www.omim.org/）、DiGSeE（http://210.107.182.61/geneSearch/）、Drug Bank（https://www.drugbank.ca/）及Human Phenotype Ontology（HPO、https://hpo.jax.org/app/）5 個(gè)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，以關(guān)鍵詞“Peptic Ulcer”進(jìn)行檢索，獲得PU 相關(guān)的疾病靶點(diǎn)基因，去除重復(fù)基因。將獲得的疾病靶點(diǎn)與上一步得到的活性成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，最后收集到CSP 抗PU 潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 CSP 抗PU 的靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 打開Sring 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），輸入CSP 抗PU的靶蛋白，物種設(shè)置為“人類（Homo sapiens）”，最低相互作用閾值為中等置信度（medium confidence），其余參數(shù)保持默認(rèn)不變，獲取靶蛋白相互作用數(shù)據(jù)，通過Cytoscape 3.2.1 軟件建立PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.5 CSP 抗PU 相關(guān)靶點(diǎn)的KEGG 通路富集分析 通過Metascape 平臺(tái)，導(dǎo)入CSP 抗PU 相關(guān)靶點(diǎn)，參數(shù)“Input as species”和“Analysis as species”均選擇“人類（Homo sapiens）”，P值設(shè)置為＜0.01，對(duì)CSP 抗PU相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，根據(jù)每條通路P值，從小到大進(jìn)行排序，篩選出前10 條通路，并使用OmicShare 網(wǎng)站（http://www.omicshare.com/）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。

1.6 CSP 抗PU“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 基于CPS 抗PU 的藥物活性成分、作用靶點(diǎn)及KEGG 通路數(shù)據(jù)，采用CytoScape 3.2.1 軟件繪制“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 CSP 藥物活性成分收集 基于OB＞30%，DL＞0.18 的限定條件，共收集102 個(gè)藥物活性成分，其中柴胡14 個(gè)，陳皮4 個(gè)，川芎5 個(gè)，香附15 個(gè)，枳殼4 個(gè)，白芍4 個(gè)，甘草73 個(gè)，藥物成分詳細(xì)信息見表1。

表1 CSP 藥物成分基本信息

表1（續(xù)）

2.2 CSP 抗PU 相關(guān)靶點(diǎn) 通過Swiss Target Prediction 平臺(tái)，并進(jìn)行重復(fù)靶點(diǎn)刪除后，共收集到363 個(gè)藥物活性成分靶點(diǎn)，與OMIM、TTD、DiGSeE、Drug Bank 及Human Phenotype Ontology（HPO）5 個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)收集到的PU 疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，取出重合靶點(diǎn)，得到43 個(gè)CSP 抗PU 相關(guān)靶點(diǎn)，詳細(xì)信息見表2。

表2 CSP 抗PU 的43 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)

2.3 CSP 抗PU 相關(guān)靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 將43 個(gè)CSP 抗PU 相關(guān)靶點(diǎn)錄入到Sring 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得其相互作用數(shù)據(jù)，并使用CytoScape 3.2.1 進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。網(wǎng)絡(luò)中Degree 值排名前10 的靶點(diǎn)分別為VEGFA、EGFR、PTGS2、MMP9、TNF、SRC、MMP2、KDR、NOS3、TLR4。

圖1 CSP 抗PU 相關(guān)靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.4 KEGG 通路富集分析 通過MetaScape 平臺(tái)對(duì)CSP 抗PU 的43 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，篩選前10 條通路，并通過OmicShare 網(wǎng)站對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理，主要涉及癌癥通路、HIF-1 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等，見圖2。

圖2 CSP 抗PU 相關(guān)靶點(diǎn)的KEGG 通路富集分析

2.5 CSP 抗PU 作用機(jī)制的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將CSP 抗PU 相關(guān)的作用靶點(diǎn)和KEGG 通路信息導(dǎo)入CytoScape 3.2.1 軟件中構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖3。

圖3 CSP 抗PU“成分-靶點(diǎn)-KEGG 通路”網(wǎng)絡(luò)

3 討論

3.1 CSP 抗PU 涉及的重要藥物成分“CSP 藥物活性成分收集”結(jié)果表明黃芩苷（Baicalin）、異鼠李素（Isorhamnetin）、槲皮素（Quercetin）、β-谷甾醇（beta-Sitosterol），豆甾醇（Stigmasterol）等是CSP 關(guān)鍵藥物活性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[5]，黃芩苷具有明顯抗炎和廣泛抑菌的作用，尤其是針對(duì)在PU 發(fā)病過程中扮演重要角色的Hp。槲皮素廣泛存在于植物花、葉、果實(shí)和種子，是一種具有多種生物活性的黃酮類化學(xué)成分，其藥理學(xué)作用極為廣泛，具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗菌等作用[6]。有研究發(fā)現(xiàn)[7]，槲皮素可以通過下調(diào)中性粒細(xì)胞白介素-6（IL-6）的表達(dá)，抑制中性粒細(xì)胞的黏附、聚集、脫顆粒等過程，進(jìn)而發(fā)揮明顯的抗炎作用。異鼠李素在消化系統(tǒng)中抗炎作用明顯，Liu G 等[8]研究顯示，異鼠李素可以下調(diào)TNF-α、IL-6、IL-8 等炎癥因子的表達(dá)，阻斷p38MAPK 和NF-κB 信號(hào)通路，提高血紅素加氧酶-1（HO-1）活性，從而減輕反流性食管炎對(duì)大鼠食管粘膜的損傷。

3.2 CSP 抗PU 涉及的重要作用靶點(diǎn)“CSP 抗PU 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析”結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)中Degree 值排在前10 位的靶點(diǎn)分別為VEGFA、EGFR、PTGS2、MMP9、TNF、SRC、MMP2、KDR、NOS3、TLR4，提示這10 個(gè)靶點(diǎn)很可能在CSP 抗PU 中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。VEGFA 存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可通過調(diào)節(jié)消化道黏膜保護(hù)因子和破壞因子之間的平衡來修復(fù)受損粘膜，在消化道粘膜保護(hù)和受損粘膜愈合過程中起到雙重作用，其過程主要涉及提高血管通透性，促進(jìn)纖維蛋白滲出，促進(jìn)血管再生，刺激上皮細(xì)胞和肉芽組織增生等[9]。有研究表明[10]，消化性潰瘍粘膜愈合與EGF 和EGFR 表達(dá)密切相關(guān)，EGF 和EGFR 表達(dá)水平的上升，可促進(jìn)受損粘膜邊緣上皮細(xì)胞的遷移和受損部位上皮細(xì)胞的增殖，進(jìn)而改善潰瘍面的愈合。PTGS2 是體內(nèi)生成前列腺素E2（PGE2）過程中的重要催化酶，而PGE2可減少胃酸分泌，增加胃黏膜粘液分泌及胃黏膜血流等，是公認(rèn)的胃粘膜保護(hù)因子，與胃潰瘍愈合過程關(guān)系密切[11]。許立拔等[12]研究發(fā)現(xiàn)，胃樂膠囊能增加乙酸型慢性胃潰瘍大鼠體內(nèi)PGE2含量，顯著減輕胃組織病理組織損傷。

3.3 CSP 抗PU 涉及的重要生物通路 KEGG 通路分析結(jié)果顯示，CSP 抗PU 作用機(jī)制涉及癌癥通路、HIF-1 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等。PI3K-Akt 信號(hào)通路調(diào)控著胃黏膜上皮細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)，增殖等過程，該通路的激活有利于胃黏膜微環(huán)境的改善，修復(fù)潰瘍處的胃粘膜[13]。彭雪靖等[14]研究顯示，半夏瀉心湯可通過激活PI3K-Akt 信號(hào)通路，上調(diào)胃黏膜上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)水平，保持粘膜的完整性，促進(jìn)受損粘膜的愈合和修復(fù)。Eliakim R 等[15]研究結(jié)果顯示，妊娠中女性胃潰瘍發(fā)病率明顯低于同齡男性，而在絕經(jīng)后該發(fā)病率相對(duì)增高，提示雌激素可能與胃潰瘍發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Tuo B 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，女性罹患十二指腸潰瘍幾率明顯小于同齡男性，該特點(diǎn)在20～49 歲年齡階段女性中尤為明顯，其發(fā)生機(jī)制可能與雌激素參與調(diào)控粘膜上碳酸氫鹽的分泌有關(guān)，而碳酸氫鹽是防止消化道粘膜遭受蛋白酶侵襲的重要角色。消化性潰瘍與微循環(huán)障礙密切相關(guān)，缺氧的微環(huán)境可激活組織細(xì)胞內(nèi)低氧誘導(dǎo)因子-lα（HIF-1α），后者可通過增加缺氧組織氧供與減少組織耗氧量，使?jié)兲幍慕M織細(xì)胞對(duì)周圍缺氧微環(huán)境產(chǎn)生耐受和適應(yīng)，進(jìn)而有利于潰瘍愈合[17]，其具體機(jī)制為HIF-1α 可增強(qiáng)VEGF 和iNOS 的表達(dá)，VEGF通過調(diào)節(jié)消化道粘膜破壞因素和保護(hù)因素之間的關(guān)系來促進(jìn)消化性潰瘍愈合，而iNOS 則能夠誘導(dǎo)機(jī)體合成NO，一定濃度的NO 具有擴(kuò)張消化道血管，增加血流量，促進(jìn)消化道潰瘍愈合的作用[18-20]。

綜上所述，CSP 抗PU 作用機(jī)制具有“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的特點(diǎn)，與具有系統(tǒng)性和整體性的中醫(yī)藥理論相符，此研究結(jié)果可作為CSP 抗PU 作用機(jī)制的初步預(yù)測(cè)探討，為下一步實(shí)驗(yàn)研究思路提供一定參考依據(jù)。