程昊,劉波，李妍,劉娜,牟艷玲

(1.山東第一醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)與制藥科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250117;2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，山東 濟(jì)南 250062;3.國家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250062;4.山東省罕少見病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250062)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種以肝臟脂肪異位、脂肪變性為主要特征的肝臟疾病，伴隨有炎癥及肝細(xì)胞損傷的脂肪變性現(xiàn)象，主要表現(xiàn)在無酗酒人群肝臟內(nèi)的脂肪蓄積[1]。NAFLD包括一系列肝臟疾病，像非酒精性單純性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)及與NASH相關(guān)的脂肪肝、肝臟纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)等。在100名NAFLD患者中，約有20名患者將發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎，進(jìn)一步發(fā)展會導(dǎo)致炎癥和纖維化，部分患者最終會發(fā)展成肝硬化甚至肝細(xì)胞癌[2]。隨著肥胖和糖尿病患者的增加，全球NAFLD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，有研究報(bào)道[3]，NAFLD的全球患病率估計(jì)值為總?cè)丝跀?shù)的24%～25%，預(yù)計(jì)2030年NAFLD的全球患病率將達(dá)到28.4%。

甲狀腺激素受體激動(dòng)劑(包括T3和T4)，作為一種治療靶點(diǎn)，目前認(rèn)為，包括α受體(THRα)和β受體(THRβ)兩種亞型。THRα在骨骼肌和心臟中高度表達(dá)，主要調(diào)節(jié)心率，而THRβ高度表達(dá)肝臟、腎臟和腦垂體，主要調(diào)節(jié)促甲狀腺激素的釋放[4]。由于THRα的心臟副作用，我們選擇THRβ進(jìn)行一系列研究。臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[5]，以THRβ為靶向的藥物具有良好的降脂特性，并表現(xiàn)出肝臟特異性分布，具有良好的安全性，是治療NASH的一種有前景的靶點(diǎn)[6]，對以THRβ為靶點(diǎn)合成出的噠嗪酮類化合物(YWS01125，見圖1)進(jìn)行非酒精性脂肪肝的治療作用研究，對治療NASH的創(chuàng)新藥物具有較好的社會意義。

圖1 YWS01125化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性C57BL/6J小鼠，150只，體質(zhì)量22～24 g，均購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，SPF級,動(dòng)物合格證號:SCXK(魯)20190003，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK(魯)20170015。飼養(yǎng)于山東第一醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，小鼠分籠飼養(yǎng)，10只/盒分配于SPF級屏障系統(tǒng)中，環(huán)境溫度(23±2)℃，濕度50%～65%，光照明暗交替各12 h，動(dòng)物自由飲水?dāng)z食，良好通風(fēng)，適應(yīng)環(huán)境7 d 后方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》要求，經(jīng)我所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會審核通過(倫理號：2021035)。

1.2 藥品與試劑 YWS01125(分子量：446.24，純度≥99%)，由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所合成室提供；MGL-3196、T3購自Selleck公司；CCK-8試劑盒購于日本同仁；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒(Maccura Biotechnology Co.,Ltd.,1220091)；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒(Maccura Biotechnology Co.,Ltd.,1020071)；甘油三酯試劑盒(Maccura Biotechnology Co.,Ltd.,0420061)；總膽固醇試劑盒(Maccura Biotechnology Co.,Ltd.,0620061)；高密度脂蛋白膽固醇試劑盒(Maccura Biotechnology Co.,Ltd.,0321011)；低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(Maccura Biotechnology Co.,Ltd.,1220092)；游離脂肪酸試劑盒 (Medicalsystem Biotechnology Co.,Ltd.,210506101)；CCl4試劑(煙臺遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司)。

1.3 儀器設(shè)備 Synergy H1(美國)；7180全自動(dòng)生化分析儀(日本日立)；Vevo 3100超高分辨小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)(加拿大)。

1.4 飼料 輻照高脂飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，高脂飼料配方如下：67%基礎(chǔ)飼料，10%豬油，10%蛋黃粉，1%膽固醇和0.2%膽酸鈉。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 THRβ/RXR/GRIP1輔激活因子多肽募集實(shí)驗(yàn) 用buffer 1(50 mmol·L-1Hepes,pH 7.0,1 mmol·L-1DTT,0.05% NP40,0.2 mg·mL-1BSA)制備THRα(125 nmol·L-1)或THRβ(50 nmol·L-1)溶液，將5 μL GST-THRα(Invitrogen，PV4762)或THRβ(Invitrogen，PV4764)與等量的EE-RxRα(50 nmol·L-1)加入384黑色微孔板中。向微孔板中分別加入2.5 μL T3(0～6 μmol·L-1)或試驗(yàn)化合物(0～0.48 mmol·L-1)的DMSO溶液，并在37 ℃下培養(yǎng)溶液30 min。向每孔中加入2.5 μL生物素-GRIP1肽[生物素-ACAHGTSLKEKHKILHRLLQDSSPVDL-CONH2， 100 nmol·L-1，溶于buffer 1中并加入5%的二甲基亞砜，GL Biochem (Shanghai) LTD合成]，于 37 ℃下培養(yǎng)30 min。每孔中加入5 μL含有Eu-anti-GST(Cisbio，61GSTKLA)和streptavidin-d2(Cisbio，610 SADLA)的混合液(用緩沖液：50 mmol·L-1Tris，pH 7.4，100 mmol·L-1NaCl， 0.2 mg·mL-1BSA稀釋)，在4 ℃下孵育過夜。在Synergy H1上讀取665 nm和615 nm熒光信號值，并計(jì)算Ratio 665 nm/615 nm。

1.5.2 細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn) 將小鼠成纖維細(xì)胞L929濃度調(diào)整至5×104個(gè)/mL，接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，設(shè)立空白孔，培養(yǎng)過夜至細(xì)胞貼壁。吸出96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清，加入不同濃度(0.1、1、10、100 μmol·L-1)的化合物YWS01225 200 μL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立對照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。吸出96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清，加入含有10% CCK-8的新鮮培養(yǎng)基，避光孵育約2～3 h后，測量450 nm處吸光度，并計(jì)算細(xì)胞存活率：存活率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度-空白組吸光度)/(對照組吸光度-空白組吸光度)×100%。

1.5.3 NASH模型制備 選取雄性健康 C57BL/6J 小鼠 150只，22～24 g，按體重均衡的原則隨機(jī)分為兩組：空白對照組20只，造模組130只，分別飼喂基礎(chǔ)飼料和高脂飼料，自由飲水，當(dāng)模型組小鼠與正常組小鼠相比ALT、AST水平顯著升高時(shí)，隨后采用皮下注射CCl4，具體操作如下：皮下注射共 8 次，第一次劑量為0.05 mL·kg-1，皮下注射，剩余7次劑量為0.1 mL·kg-1[7]。在末次CCl4注射結(jié)束后，隨機(jī)抽取造模組小鼠進(jìn)行B超檢測、生化各參數(shù)及肝組織病理學(xué)的檢查，確認(rèn)NASH小鼠造模是否成功。

1.5.4 分組與給藥 當(dāng)造模組小鼠B超檢測出現(xiàn)肝腎比值大于1；血生化檢測造模組ALT、AST 指標(biāo)較空白對照組明顯升高；病理切片示小鼠肝組織見大油滴和微小脂滴，肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)易見脂肪空泡，肝細(xì)胞呈明顯炎性改變，說明NASH模型造模成功。將造模成功小鼠隨機(jī)分成模型組、YWS01125(10、20、40 mg·kg-1)及陽性藥MGL-3196(40 mg·kg-1)組[8]，每組各10只，各組灌胃給予相應(yīng)濃度的藥物溶液，給藥體積20 mL·kg-1，連續(xù)給藥30 d，空白對照及造模組給予等體積蒸餾水，給藥期間觀察小鼠一般情況，每周稱量體重一次。

1.5.5 標(biāo)本采集及處理 末次給藥后24 h，采用腹部超聲觀察肝臟病變，將小鼠仰臥位置于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺上，固定四肢，脫毛后暴露胸腹部，吸入2%異氟醚和98% O2誘導(dǎo)輕麻醉，以0.5%～1%異氟醚維持麻醉，使用22～55 MHz線性陣列傳感器觀察肝臟與腎臟情況，拍取B超照片；隨后將小鼠眼眶靜脈叢取血，將血漿于37 ℃孵箱靜置半小時(shí)后，3 000 r·min-1，離心15 min，吸取血清，置于自動(dòng)生化儀中檢測測定所取得小鼠血清中ALT、AST、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平；摘眼球取血后處死小鼠，稱取體質(zhì)量，解剖取其肝臟，用0.9%氯化鈉注射液沖洗，濾紙吸干后稱其肝臟質(zhì)量，測量計(jì)算肝指數(shù)(肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)，然后將肝臟置于10% 中性緩沖福爾馬林溶液固定24 h后取材,進(jìn)行病理組織切片，顯微鏡觀察HE染色結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 THRβ/RXR/GRIP1輔激活因子多肽募集實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明(見表1)，對照組MGL-3196對THRβ的選擇性是THRα的4.34倍，而YWS01125對THRβ的選擇性是THRα的6.23倍，說明了YWS01125對THRβ的選擇性優(yōu)于陽性對照MGL-3196。

表1 YWS01125對THR兩種受體激活的選擇性

2.2 細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn) 如圖2所示，YWS01125和T3對L929細(xì)胞株的存活率均無顯著影響。在100 μmol·L-1劑量下，YWS01125和T3的存活率分別為110.30%±11.50%和100.00%±6.20%，說明YWS01125對L929細(xì)胞系無毒性作用。

圖2 YWS01125對L929細(xì)胞系存活能力的影響，數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值

2.3 小鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)過程中各組小鼠狀態(tài)均良好，體重正常增長。正常組小鼠皮毛光滑，活動(dòng)正常，性情相對溫順。模型組、陽性藥對照組及YWS01125劑量組小鼠體質(zhì)量均大于正常組小鼠，毛發(fā)粗糙，偶有出現(xiàn)斑禿現(xiàn)象，性情躁動(dòng)，不喜動(dòng)。

2.4 腹部超聲觀察YWS01125對模型小鼠的影響 與空白對照組相比，造模組肝臟回聲明顯升高，肝腎比值為1.33，可判斷肝臟出現(xiàn)炎癥性損傷。陽性藥MGL-3196對照組以及YWS01125低、中、高治療組肝腎比值分別為0.62、1.06、0.90、0.71，均能不同程度改善肝臟病變，且肝腎比值成劑量依賴性降低。圖3 A～F分別為空白對照組、造模組、陽性藥(MGL-3196)對照組以及YWS01125三劑量治療組腹部超聲圖片。

圖3 不同治療組小鼠肝臟B超圖片

2.5 YWS01125對模型小鼠血清ALT、AST的影響 與空白對照組相比較，模型建立后C57BL/6J 小鼠的ALT、AST血生化指標(biāo)有顯著增高趨勢，說明高脂飼料飲食結(jié)合CCl4注射使造模組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)炎性損傷，證明慢性肝損傷小鼠模型建造成功。如圖4，與模型組相比較，陽性藥(MGL-3196)對照組和YWS01125治療組小鼠的ALT、AST活性呈現(xiàn)顯著降低趨勢(P<0.01)，說明MGL-3196組和YWS01125治療組具有降低轉(zhuǎn)氨酶作用，能有效減輕模型對小鼠肝細(xì)胞造成的損傷，保護(hù)肝臟細(xì)胞膜，明顯減輕炎性反應(yīng)，以上結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 不同治療組小鼠ALT、AST生化指標(biāo)的變化 注：與空白對照組比較，###P<0.0001；與模型組比較，*P<0.01，**P<0.001，***P<0.0001

2.6 YWS01125對肝臟組織病理學(xué)改變的影響 空白對照組(見圖5A)其肝細(xì)胞索間界限清晰，胞漿界限明顯，肝小葉、肝血竇結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈放射狀排列，未見炎癥細(xì)胞浸潤,無病變情況。

造模組(見圖5B)，其病變情況除肝小葉結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)了不同程度彌漫性肝細(xì)胞腫脹，胞漿疏松，還伴有肝竇略狹窄以及局灶性少量肝細(xì)胞壞死伴炎癥細(xì)胞浸潤的病變狀況出現(xiàn)。造模組肝臟切片呈現(xiàn)的情況，表明了造模干預(yù)使小鼠肝臟產(chǎn)生了明顯炎癥、出現(xiàn)損傷。

陽性藥對照組(見圖5C)和YWS01125三個(gè)劑量治療組(見圖5D～F)與造模組相比較，小鼠肝細(xì)胞腫脹、壞死和炎癥程度均有不同程度的改善。肝臟細(xì)胞的顏色和形態(tài)均較為正常：顏色沒有明顯變化，形態(tài)也比較正常，肝臟細(xì)胞偶見有炎性壞死細(xì)胞。結(jié)果表明噠嗪酮類化合物(YWS01125)對高脂飼料及CCl4所致的慢性肝損傷小鼠模型有一定的治療作用(圖5A～F均為光學(xué)顯微鏡下放大200倍的圖片)。

圖5 不同治療組小鼠肝臟HE染色圖片

2.7 對臟器指數(shù)影響 與空白對照組相比，模型組小鼠的肝臟指數(shù)明顯增加(P<0.001)，模型組小鼠的肝臟出現(xiàn)腫脹、炎癥等病變狀況，結(jié)果表明干預(yù)對小鼠肝臟造成明顯損傷。與模型組相比，陽性藥對照組和YWS01125三個(gè)劑量治療組小鼠肝臟指數(shù)均有所減小(P<0.01)，表明噠嗪酮化合物YWS01125(10、20、40 mg·kg-1)對慢性肝損傷小鼠模型具有一定的治療作用(見表2)。

表2 YWS01125 對各組小鼠肝臟指數(shù)的影響

3 討論

近年來，非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型的建立主要分為三類：營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝模型、化學(xué)誘導(dǎo)與飼料組合模型和基因敲除或基因突變性模型[9]。理想的動(dòng)物模型應(yīng)該具備與人類疾病特征盡可能相似，同人類 NAFLD疾病進(jìn)程一樣，成模率高，對動(dòng)物傷害小，死亡率低，具有一定的可重復(fù)性等。作為國內(nèi)外研究NASH的最佳模型之一，化學(xué)誘導(dǎo)與飼料組合操作方法簡便、費(fèi)用較低、重復(fù)性好、死亡率低，且建立成功的模型與人類患病的病理生理方面較為相似，缺點(diǎn)是造模周期較長。在 NASH的發(fā)病過程中，HFD飲食引起脂肪細(xì)胞增生肥大，釋放大量FFA，其可與 Toll樣受體4結(jié)合激活固有免疫通路，進(jìn)而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。本文C57BL/6J小鼠喂養(yǎng)高脂飼料產(chǎn)生脂肪肝然后使用CCl4加速劑干預(yù)8次促使肝臟產(chǎn)生炎癥，結(jié)果表明高脂飼料加CCl4干預(yù)喂養(yǎng)至第20周時(shí)小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的脂肪變性，肝組織有所損傷，出現(xiàn)炎癥，可作為NASH治療模型的制備提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

THR-多選擇性激動(dòng)劑作為一種降低脂毒性負(fù)荷的方法，臨床試驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)其是通過脂肪酸的分解和促進(jìn)線粒體生物合成來降低脂肪毒性，改善健康人體的脂質(zhì)循環(huán)并快速去除肝臟脂肪從而達(dá)到改善肝功能的作用，還可有效緩解肥胖及降低低密度脂蛋白水平，以THR為靶點(diǎn)的藥物在動(dòng)物和小型臨床試驗(yàn)中均表現(xiàn)出較好的降脂性能[10]。THRβ由位于3號染色體上THRβ基因編碼，主要在肝臟、腦和腎臟中表達(dá)。在多項(xiàng)研究中，顯示肝臟特異性表達(dá)的THRβ在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用，可有效抑制肝臟甘油三酯合成，增加肝臟膽固醇清除，減少脂質(zhì)沉積，同時(shí)部分增加胰島素敏感性，促進(jìn)糖代謝，改善炎癥，成為治療非酒精性脂肪性肝病極具潛力的治療藥物。隨著甲狀腺素類藥物的發(fā)展，針對不同組織所存在的不同THR進(jìn)行個(gè)體化治療已成為當(dāng)今治療趨勢。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，YWS01125三個(gè)劑量組均可以有效降低血清中ALT、AST水平，減輕發(fā)生病變肝臟的炎癥反應(yīng)，表明了YWS01125對慢性肝損傷小鼠模型具有一定的治療作用，為NASH疾病的藥物開發(fā)提供了一些可行性依據(jù)，但其確切作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。