梁 言，許梓楠，蔡明詳,3，劉湘寧,3

近年來，有關(guān)適配體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究迅速發(fā)展。適配體是一種通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)在DNA或RNA文庫中篩選得到單鏈DNA或RNA，能夠與小分子、蛋白質(zhì)和細(xì)胞等靶標(biāo)特異性結(jié)合[1]。疾病的早期診斷與治療是治愈疾病的關(guān)鍵，然而某些疾病可能表現(xiàn)出非特異性癥狀，導(dǎo)致假陰性延誤治療時機(jī)，增加治療失敗的風(fēng)險。此外，個性化的精準(zhǔn)治療對疾病治療至關(guān)重要。由于具有高特異性、低免疫原性和低成本等特點，適配體已在藥物遞送、疾病的診斷和治療等方面有了廣泛的應(yīng)用[2-4]。本文將就適配體的特點和其在口腔醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用作一綜述。

1 適配體的發(fā)展和特點

1.1 適配體的發(fā)現(xiàn)與篩選

自20世紀(jì)80年代Cech等[5]發(fā)現(xiàn)RNA具有催化作用以來，研究者們對核酸識別并作用于特定位點的功能探索也隨之興起。1990年，Tuerk在研究T4噬菌體DNA聚合酶(gp43)與編碼mRNA間的相互作用時發(fā)現(xiàn)，gp43在與該mRNA 5′端一個8個核苷酸的發(fā)夾結(jié)構(gòu)及Shine-Dalgarno序列結(jié)合時，可以抑制該mRNA轉(zhuǎn)錄的開始以進(jìn)行自我調(diào)節(jié)。為探究這一相互作用，Tuerk開發(fā)了SELEX技術(shù)，即通過構(gòu)建一個隨機(jī)的RNA文庫，利用硝酸纖維素膜篩選出與gp43有親和力的RNA序列，對其進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行下一輪篩選，如此往復(fù)，最終獲得2個能特異性結(jié)合gp43的RNA序列[6]。同年，Ellington等[7]通過類似方法，開發(fā)出能與對應(yīng)靶標(biāo)特異性結(jié)合的核酸片段，并將這種片段命名為“aptamer(適配體)”。

適配體在與靶標(biāo)結(jié)合時，會形成莖、環(huán)、發(fā)夾、突起、假結(jié)和G-四鏈體等結(jié)構(gòu)，通過氫鍵、范德華力、堿基堆積力、靜電作用和疏水相互作用等與靶標(biāo)形成一個穩(wěn)定的復(fù)合物結(jié)構(gòu)[8-9](圖1)。

A：經(jīng)過篩選的DNA或RNA序列；B：適配體在與靶標(biāo)結(jié)合時，會形成一些如莖環(huán)、扭結(jié)、內(nèi)環(huán)、突起等獨特的結(jié)構(gòu)；C：經(jīng)過構(gòu)型變化形成功能化適配體；D：適配體與相應(yīng)的靶標(biāo)結(jié)合

隨著技術(shù)進(jìn)步，SELEX技術(shù)也不斷得到革新和發(fā)展。在構(gòu)建核酸文庫時，有學(xué)者采用非天然核苷酸替代傳統(tǒng)的核苷酸。在篩選方式上，毛細(xì)管電泳SELEX技術(shù)(capillary electrophoresis-SELEX，CE-SELEX)、微流控芯片SELEX技術(shù)(chip-based microfluidic SELEX，M-SELEX)等改良技術(shù)提升了篩選的效率[10]。在結(jié)合對象上，免疫沉淀偶聯(lián)的SELEX技術(shù)(immunoprecipitation-coupled SELEX, IP-SELEX)被用以篩選與蛋白高特異性結(jié)合的適配體，而細(xì)胞SELEX技術(shù)(cell-SELEX)是將整個細(xì)胞作為結(jié)合的靶點進(jìn)行篩選[11]。

1.2 適配體的特點

1.2.1 合成加工簡單，重復(fù)性好 適配體通過SELEX的方法在體外獲得，不依賴細(xì)胞、動物等。生產(chǎn)成本較低、合成周期短，且結(jié)構(gòu)簡單，不同生產(chǎn)批次間的差異小，適合大規(guī)模生產(chǎn)[6]。適配體還可以進(jìn)行不同的修飾，如熒光標(biāo)記、藥物結(jié)合等，以適應(yīng)不同的需要。

1.2.2 親和力高、特異性強(qiáng)、靶標(biāo)范圍廣 適配體的親和力高，通過反向篩選，還可以減少甚至消除非特異性結(jié)合。適配體靶點范圍廣，包括小分子(如無機(jī)離子和小分子藥物等)、大分子(多肽和蛋白質(zhì)等)、細(xì)胞或組織[12]，可應(yīng)用于重金屬檢測、農(nóng)藥檢測、食品檢測、疾病診斷與治療等。

1.2.3 免疫原性低 適配體在體內(nèi)免疫原性低，目前認(rèn)為免疫系統(tǒng)不能直接識別適配體，適配體也沒有多余的Fc段，避免了與Fc受體結(jié)合導(dǎo)致的副作用[13-14]。

1.2.4 穩(wěn)定、保質(zhì)期長 適配體具有熱穩(wěn)定性，對溫度變化不敏感，更易存儲和運輸。

2 適配體在口腔領(lǐng)域的研究進(jìn)展

隨著對適配體認(rèn)識的不斷深入，越來越多的功能化適配體正在被開發(fā)出來。近年來，口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)于適配體的研究也正在興起。

2.1 疾病診斷

2.1.1 口腔疾病的診斷 變異鏈球菌是重要的致齲菌，由于各型變異鏈球菌之間具有同源性，可將變異鏈球菌視為“變異鏈球菌組”，進(jìn)一步將其分為倉鼠鏈球菌(S.cricetus)、鼠鏈球菌(S.rattus)、變異鏈球菌(S.mutans)、表兄鏈球菌(S.sobrinus)等，其中變異鏈球菌和表兄鏈球菌與齲病密切相關(guān)。研究各型鏈球菌之間的差異和聯(lián)系，對致齲菌的研究和齲病預(yù)防診斷具有重要意義。Cui等[15]通過SELEX技術(shù)篩選出適配體H19，可從低致齲性變異鏈球菌菌株中識別高致齲性菌株，為齲病的早期診斷提供了一種可能方案。

牙周炎病變呈靜止期和活動期交替出現(xiàn)，并且有部位特異性，因此對牙周炎活動性快速、精確和客觀地判斷在臨床診療中具有重要意義。當(dāng)前牙周炎唾液檢測標(biāo)記物主要有微生物來源、宿主來源標(biāo)記物，后者又分為反映牙周組織炎癥和反映牙周組織破壞的標(biāo)記物[16]。牙周炎齦溝液中的牙源性成釉細(xì)胞相關(guān)蛋白(odontogenic ameloblast-associated protein，ODAM)是牙周炎的代表性標(biāo)志物之一，連接牙齒表面與結(jié)合上皮，因附著喪失導(dǎo)致ODAM被釋放到齦溝液當(dāng)中[17]。Lee等[18]篩選出針對ODAM不同結(jié)合位點的一對特異性適配體OD64和OD35，并基于這對適配體開發(fā)出了夾心型側(cè)流生物傳感器，其能夠在緩沖液和唾液標(biāo)本中定量檢測ODAM蛋白，為牙周炎的診斷提供了新的思路。

2.1.2 與口腔相關(guān)全身疾病的診斷 近年來，唾液與全身疾病的關(guān)系越來越得到重視，隨著唾液組學(xué)的發(fā)展，唾液檢測全身疾病技術(shù)日趨成熟。

糖尿病與牙齦炎、牙周炎、齲齒及某些真菌感染的口腔疾病密切相關(guān)。Malathi等[19]發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者的唾液淀粉酶水平較健康人群顯著升高。人β-防御素(human β-defensins，HBD)水平與感染性、免疫性疾病和全身壓力等相關(guān)，是一種反映口腔免疫狀態(tài)、具有特異性的重要標(biāo)記物。García-Berrocoso等[20]的研究表明HBD可作為診斷中風(fēng)后早期神經(jīng)病變的潛在標(biāo)志物。Minagawa等[21-22]先后合成了能夠特異性識別唾液α-淀粉酶(salivary α-amylase,sAA)和HBD的適配體，可在唾液中檢測sAA和HBD的含量。這為糖尿病和腦卒中后早期神經(jīng)病變的診斷提供了潛在的方法。溶菌酶水平在白血病、肺結(jié)核、急性細(xì)菌感染和炎癥性腸病等疾病中升高，唾液溶菌酶的定性和定量測定已用于診斷、治療和監(jiān)測此類疾病，Zou等[23]研究證明了適配體檢測溶菌酶的可行性。唾液組氨素3(Histatin 3，H3)是唾液中一種具有抗真菌活性的多肽，檢測H3在唾液中的含量可以反映口腔中念珠菌感染的水平。蛋白印跡實驗無法檢測出H3，色譜法費力耗時且成本昂貴，Ojha等[24]篩選出能與H3特異性結(jié)合的適配體LI-H3-APT-3，并將其作為檢測唾液中H3水平的生物傳感器,靈敏且低成本。唾液中H3水平的測定有助于對口腔念珠菌病和艾滋病的診斷。

2.2 參與疾病治療

適配體主要通過兩種方式參與治療：①靶向遞送藥物；②作為拮抗劑抑制靶標(biāo)的功能。前者在口腔中的應(yīng)用目前尚未見報道。

2.2.1 關(guān)節(jié)炎的治療 Sun等[25]發(fā)現(xiàn)在由單側(cè)前牙反牙合(unilateral anterior crossbite，UAC)引起的顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型小鼠中，軟骨下骨的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)的microRNA-29b(miR-29b)表達(dá)水平顯著降低，進(jìn)而通過Wnt5a通路調(diào)節(jié)使其表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)破骨細(xì)胞的骨吸收作用。與BMSC特異性結(jié)合的適配體aptamer-agomiR-29b能上調(diào)miR-29b的表達(dá)水平，抑制軟骨下骨丟失、破骨細(xì)胞功能亢進(jìn)和軟骨降解；而適配體aptamer-antagomiR-29b作用于BMSC則表現(xiàn)出相反的效果，這為治療顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎提供了新思路。

2.2.2 癌癥治療 癌癥治療一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點，當(dāng)前大多數(shù)治療癌癥的藥物主要存在治療效果不盡如人意和對正常細(xì)胞毒性大兩個問題。適配體能夠靶向識別癌細(xì)胞，減少對正常細(xì)胞的損傷。

當(dāng)前已有3種適配體完成了臨床試驗。①AS1411：與核仁素外結(jié)合域結(jié)合，在肺癌、乳腺癌、腎癌和肝癌等臨床癌癥模型中，顯示出抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力；②NOX-A12：一種L型RNA適體，可以抑制核酸酶降解，同時也是趨化因子CXCL-12的拮抗劑，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、新血管形成和轉(zhuǎn)移；③AGRO100：可與核仁素結(jié)合，在腫瘤細(xì)胞中具有抗增殖作用[26]。

乙酰肝素酶是一種內(nèi)切糖苷酶，參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重建，與腫瘤轉(zhuǎn)移和組織侵襲有關(guān)，是癌癥治療的一個潛在靶點。Simmons等[27]研究發(fā)現(xiàn)，抗乙酰肝素酶適配體能夠抑制與口腔癌相關(guān)腫瘤細(xì)胞的組織侵襲，并證實這種作用是乙酰肝素酶受抑制的結(jié)果，而非適配體的潛在細(xì)胞毒性作用。Sathiyaseelan等[28]將適配體AS1411與5-氟尿嘧啶(5-FU)和阿霉素(Doxorubicin，Dox)結(jié)合，通過靶向遞送5-FU和Dox用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療，抑制腫瘤細(xì)胞的生長，然而還需要進(jìn)一步研究這種藥物遞送系統(tǒng)的有效性。

適配體通過靶向遞送或拮抗靶標(biāo)功能的方式，與癌細(xì)胞特異性結(jié)合，抑制癌細(xì)胞的生長，減少對正常組織細(xì)胞的損傷，具有廣闊的前景。但適配體用于癌癥治療的研究尚處于起步階段，如何保持適配體在體內(nèi)穩(wěn)定發(fā)揮作用和保證其安全性等問題仍待解決。

2.3 口腔組織再生

口腔頜面部的骨缺損是口腔外傷常見的并發(fā)癥，實現(xiàn)頜面部的骨組織再生也是研究的熱點之一。Son等[29]在羥基磷灰石(HA)支架表面偶聯(lián)適配體3R02，開發(fā)出Apt-HA這一支架材料，發(fā)現(xiàn)其可以通過捕獲更多血管內(nèi)皮生長因子蛋白促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長，最終促進(jìn)骨再生和血管生成，是一種有前景的骨移植材料。Ardjomandi等[30-31]開發(fā)了一種以人類頜骨骨膜細(xì)胞(human jaw periosteal cells，JPC)為靶標(biāo)的適配體Aptamer 74。Aptamer 74能夠提高JPC的增殖能力以及成骨潛力，將Aptamer 74修飾到β-三磷酸鈣支架上發(fā)現(xiàn)，該支架能夠促進(jìn)細(xì)胞的粘附和成骨分化，并且不影響JPC的長期增殖，在口腔頜面外科的組織工程中具有重要作用。

3 總結(jié)與展望

適配體近年來廣泛應(yīng)用于疾病診斷、藥物治療、靶向遞送和組織再生等，是一種具有研究價值和應(yīng)用前景的生物因子。但在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)，相應(yīng)適配體的篩選與開發(fā)尚處于起步階段。

適配體對靶標(biāo)的高特異性意味著其在精準(zhǔn)診斷、精準(zhǔn)治療上具有很大應(yīng)用價值，可以精準(zhǔn)識別和結(jié)合癌細(xì)胞相應(yīng)靶點，減少毒副作用，在癌癥治療中具有巨大潛力。此外，適配體在組織再生領(lǐng)域的研究也有一定的成果[32-33]。期待更多研究者挖掘適配體在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的潛能，充分發(fā)揮適配體的優(yōu)勢，為口腔疾病的診治提供新的思路。