梁庚云，唐健民，谷 睿，鄒 蓉，秦惠珍，韋 霄

(1.廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所，廣西桂林 541006；2.桂林理工大學旅游與風景園林學院，廣西桂林 541006)

石山蘇鐵(CycasmiqueliiO.Warburg)是蘇鐵科(Cycadaceae Pers.)蘇鐵屬(CycasL.)植物，樹干矮小，基部膨大成卵狀莖或盤狀莖，一般高30-180 cm，直徑10-60 cm,又名山菠蘿、少刺蘇鐵、神仙米等，是中國國家一級保護植物[1]，是《世界自然保護聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》的近危(NT)種，也是地球上現(xiàn)存的古老孑遺植物，具有極高的科學、生態(tài)[2]和觀賞價值[3]。石山蘇鐵零星分布于云南、廣東和廣西西南部、西部[4],常生長于低海拔的石灰?guī)r山地或石灰?guī)r縫隙，呈團狀或小片狀分布，其生命力極強，可在峭壁或石縫、石穴中正常生長。石山蘇鐵的球形莖富含淀粉，可做粑餅或煮粥，味美可口，營養(yǎng)豐富，其根、莖、葉、花、種子均可入藥。根能祛風活絡(luò)、補腎、治腸炎和痢疾，種子平肝、降血壓，花能止血、益腎、固精[5]。

由于生境的嚴重破壞和長期大批量的盜挖，石山蘇鐵的居群數(shù)量急劇減少，當前已難找到成片的石山蘇鐵居群,且每個居群中處于開花年齡的石山蘇鐵雌雄植株不多(僅2-3株)。此外，因受到各種因素的影響，處于開花年齡的植株中僅少數(shù)植株能每年開花結(jié)種子，結(jié)實率很低[6,7]。因此，加強石山蘇鐵的人工繁育技術(shù)研究，建立其種子庫和基因資源庫對保護石山蘇鐵野生資源具有重要意義[8]。目前相關(guān)科研人員對石山蘇鐵開展的全面性研究并不多，且主要集中在無性繁殖技術(shù)[8]、雜交育種[9]、羽片解剖學[10]、孢子特征[11]、染色體數(shù)目及核型[12]、種間親緣關(guān)系及分類學研究[13,14]等方面，針對石山蘇鐵種子的萌發(fā)等研究鮮見報道。

鑒于此，本研究從可能影響石山蘇鐵種子萌發(fā)特性的種子帶皮情況、溫度、基質(zhì)、光照、埋深、土壤含水量等因素出發(fā)，研究其萌發(fā)規(guī)律，旨在探討珍稀瀕危植物石山蘇鐵種子萌發(fā)的最佳條件，探尋種子萌發(fā)的限制因素，以期為石山蘇鐵的保護、引種馴化和擴大種苗繁育等提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

于2020年11月采集廣西崇左市江州區(qū)(107°21′14.54″ E，22°37′19.06″ N)天然種群成熟的石山蘇鐵種子，將其浸泡在50℃的水中1 d。然后用稀硫酸溶液浸泡10-15 min，用清水沖洗干凈，再用清水浸泡。每隔一天換一次清水，直至外種皮完全吸水膨脹變軟厚，將外種皮剝?nèi)ィ们逅疀_洗，淘凈果皮和發(fā)育不飽滿的種子備用。

1.2 種子形態(tài)特性觀測及百粒重測定

將自然干燥的種子混合隨機取樣，用游標卡尺準確測量種子的種球莖，取平均值；百粒重測定用百粒法，重復(fù)3次，取平均值，計算百粒重。

1.3 種子萌發(fā)特性測定

選取無病蟲害的備用種子于11月末播種，播種前種子經(jīng)0.1% K2MnO4溶液消毒30 min，清水洗凈。播種容器為17.2 cm×11.7 cm×7 cm，容量1 000 mL的塑料盒。使用單因素法依次探究種皮、溫度、基質(zhì)、光照、土壤含水量和播種深度等因素對種子萌發(fā)的影響。初始基本萌發(fā)條件的各影響因素參數(shù)設(shè)置如下：鋪以6 cm經(jīng)消毒的基質(zhì)，播種深度為3 cm，每盒播10粒，30℃溫度、周期性光照(3 000 lx，12 h·d-1)、混合土(腐殖土∶黃土∶珍珠巖=1∶1∶1)為萌發(fā)基質(zhì)，保持基質(zhì)濕潤。試驗結(jié)束后每個處理取長勢一致的幼苗5株，進行3次重復(fù)，共取15株，測量其苗長和根長。特別地，優(yōu)化當前影響因素時，設(shè)置不同水平替代基本萌發(fā)條件中相應(yīng)因素的參數(shù)，其他因素的參數(shù)設(shè)置不變，各影響因素及其設(shè)置的水平具體如下。

(1)種皮。

已成熟的石山蘇鐵種子有3層種皮，分別為外種皮、中種皮和內(nèi)種皮。以去除外種皮、中種皮種子(用刀片劃開剝除種皮)為試驗材料[15]，同時置于播種容器進行對比試驗。

(2)溫度。

分別設(shè)置培養(yǎng)箱溫度為25℃、30℃、35℃以及放置在室溫環(huán)境(RT，夏季26-32℃，冬季8-15℃) 4個溫度處理做萌發(fā)試驗[16]。

(3)基質(zhì)。

分別以經(jīng)消毒后的沙土、黃土、腐殖土、珍珠巖和混合土(腐殖土∶黃土∶珍珠巖=1∶1∶1) 5種材料作為基質(zhì)進行萌發(fā)試驗。沙土、黃土、混合土取自廣西植物研究所，腐殖土、珍珠巖均采購市場上。

(4)光照。

設(shè)置持續(xù)光照(3 000 lx，24 h·d-1)、持續(xù)黑暗(24 h·d-1)和周期性光照(3 000 lx，12 h·d-1) 3 種光照模式進行萌發(fā)試驗[16]。

(5)土壤含水量。

以烘干至恒重的400 g混合土(腐殖土∶黃土∶珍珠巖=1∶1∶1)為基質(zhì)，加入蒸餾水，使其土壤含水量分別為20%、40%和80%做萌發(fā)試驗[16]。

(6)播種深度。

設(shè)置播種深度分別為1 cm、3 cm、5 cm進行試驗[16]。

1.4 萌發(fā)指標的計算

選用萌發(fā)時滯(Germination Time Lag，GTL)、發(fā)芽勢(Germination Energy，GE)、萌發(fā)率(Germination Percentage，GP)評價種子活力。以芽頂出為種子萌發(fā)標準，觀察到第1粒種子萌發(fā)后，每7 d統(tǒng)計1次萌發(fā)數(shù)，參考王莉芳等[15]提出的公式計算發(fā)芽勢，至發(fā)芽后90 d結(jié)束試驗。

萌發(fā)率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%,

發(fā)芽勢(%)=發(fā)芽高峰日發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)水分變化給種子補充蒸餾水，以防干燥。每天定時觀察發(fā)芽情況并計數(shù)，視芽頂出為種子萌發(fā)。采用Microsoft Excel 2019軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行不同處理間的多重比較分析。統(tǒng)計值以平均值±標準誤(Mean±SE)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子形態(tài)特征及測定結(jié)果

石山蘇鐵種子卵圓形，平滑，有光澤。成熟時外種皮為黃色肉質(zhì)，易與中種皮分離;中種皮為淺棕色硬質(zhì)，內(nèi)種皮棕色膜質(zhì)，與中種皮結(jié)合在一起不易分離。不剝除外種皮時種球莖均值為18.61 mm，百粒重408.9 g；剝除外種皮后種球莖均值為13.52 mm，百粒重321.3 g。

2.2 帶種皮情況對種子萌發(fā)的影響

從表1可以看出，去除外種皮處理的種子在50 d左右萌發(fā)，而去除中種皮處理使萌發(fā)時間縮短為33 d左右，且GP和GE明顯高于去除外種皮處理。因此，去除中種皮的處理方式較適合石山蘇鐵種子萌發(fā)與生長。但是，去除中種皮較去除外種皮處理的芽長、主根均無明顯差異(圖1)。

表1 帶種皮與去種皮試驗種子萌發(fā)情況

圖1 帶皮情況對石山蘇鐵幼苗生長的影響

2.3 溫度對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

由表2可知，25℃條件下，石山蘇鐵種子無萌發(fā)跡象，冬季室溫(8-15℃)下也無種子萌發(fā)。隨著溫度的升高，種子的發(fā)芽率呈上升趨勢，35℃條件下萌發(fā)率達到53.33%。30℃時種子的GTL比35℃時滯后2 d，無顯著性差異(P>0.05)。35℃條件下，種子的GE達23.33%,比30℃高，但無顯著差異(P>0.05)。GP在30℃、35℃條件下無顯著性差異(P>0.05)。溫度控制在30-35℃都較適合石山蘇鐵種子萌發(fā)。如圖2所示，90 d后石山蘇鐵種子萌發(fā)在35℃下的芽長顯著大于30℃條件處理(P<0.05)，主根也略長，表明在35℃條件下能加快石山蘇鐵幼苗生長速度。

表2 不同溫度下種子萌發(fā)情況

不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)

2.4 基質(zhì)對種子萌發(fā)和幼苗早期生長的影響

由表3可知，5種不同基質(zhì)下GTL為沙土>黃土>混合土>珍珠巖>腐殖土，沙土的GTL顯著長于除黃土之外的其他3種基質(zhì)(P<0.05)。以腐殖土為基質(zhì)種子的GE與沙土、珍珠巖、混合土為基質(zhì)相比差異顯著(P<0.05)。不同基質(zhì)條件下的GP為腐殖土>黃土>珍珠巖>混合土>沙土。因此，腐殖土較適合石山蘇鐵種子的萌發(fā)。如圖3所示，在腐殖土和黃土中，石山蘇鐵幼苗芽顯著長于其他基質(zhì)栽培的芽，但石山蘇鐵幼苗在各基質(zhì)中的主根長無顯著差異(P>0.05)。

表3 不同基質(zhì)中種子萌發(fā)情況

不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)

2.5 光照對種子萌發(fā)的影響

由表4可知，周期性光照、持續(xù)光照、持續(xù)黑暗3種處理獲得的種子萌發(fā)率差異不顯著(P>0.05)。周期性光照的GTL相比持續(xù)光照、持續(xù)黑暗處理分別提前16 d和18 d，具有顯著差異(P<0.05);其GP、GE相比持續(xù)光照、持續(xù)黑暗處理均有提升，但無顯著差異(P>0.05)。如圖4所示，石山蘇鐵種子萌發(fā)在3種光照處理下的芽長無顯著差異(P>0.05)，但持續(xù)黑暗的主根長顯著低于周期性光照和持續(xù)光照條件處理(P<0.05)。幼苗在周期性光照條件下長勢良好，成熟葉片深綠有光澤，持續(xù)光照條件下葉片發(fā)黃。因此，石山蘇鐵幼苗最適宜在周期性光照條件下萌發(fā)與生長。

表4 不同光照種子萌發(fā)情況

不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)

2.6 播種深度對種子萌發(fā)的影響

在混合土基質(zhì)中，隨著播種埋深的增加,GTL呈現(xiàn)增加趨勢，埋深5 cm與埋深1 cm、3 cm均存在顯著差異 (P<0.05)，且埋深5 cm的發(fā)芽周期較長，萌發(fā)不整齊。埋深1 cm與埋深3 cm的GTL、GP、GE均無顯著差異(P>0.05)，但埋深3 cm的GP、GE略高于埋深1 cm處理(表5)。由圖5可知，90 d后，不同埋深處理石山蘇鐵幼苗芽長無顯著差異(P>0.05)，但5 cm條件處理下主根長相比1 cm、3 cm處理短，存在顯著差異(P<0.05)。因此，1 cm、3 cm的埋深處理都較適合石山蘇鐵幼苗生長。

表5 不同播種深度種子萌發(fā)情況

不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)

2.7 土壤含水量對種子萌發(fā)的影響

石山蘇鐵種子在土壤含水量為80%時，無萌發(fā)跡象，且種子腐壞明顯。在土壤含水量40%與20%的處理中，GP與GE均無顯著差異 (P>0.05)，GTL存在顯著差異(P<0.05)，40%土壤含水量處理GTL更短，可知40%的含水量較適宜石山蘇鐵種子萌發(fā)(表6)。由圖6可知，40%土壤含水量的石山蘇鐵幼苗芽長、主根長與20%的處理均存在顯著差異(P<0.05)，前者對于幼苗生長更好。

表6 不同土壤含水量種子萌發(fā)情況

不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)

3 討論

3.1 石山蘇鐵種子萌發(fā)的適宜條件

石山蘇鐵種子在自然狀態(tài)下萌發(fā)，會受種子周邊土壤pH、土壤含水量、空氣濕度等綜合因素及種子交互影響。種皮是影響蘇鐵種子休眠的一個因素[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與去除中種皮的種子相比，只去除外種皮的種子萌發(fā)緩慢，且萌發(fā)率差異也較大。石山蘇鐵種子中種皮厚且硬，結(jié)構(gòu)致密，可能是其在不良環(huán)境下防止水分快速丟失和病原菌入侵的保護機制[16]，去除中種皮后種子萌發(fā)速度較快，萌發(fā)率也較高，說明中種皮對種子萌發(fā)造成機械阻礙或限制水分、氧氣的供應(yīng)，延緩種子的萌發(fā)。

適宜的溫度促進種子的吸水速度，可加強酶促過程和呼吸作用，加速儲藏物轉(zhuǎn)化，加速種皮機械變化，從而促進萌發(fā)[18]。本次試驗石山蘇鐵種子萌發(fā)對溫度的適應(yīng)范圍較窄，25℃和冬季室溫(8-15℃)下不能萌發(fā)，30℃、35℃溫度下種子能萌發(fā)，發(fā)芽時滯、萌芽率、萌發(fā)勢無明顯差異，但在35℃下石山蘇鐵幼苗生長更好，這與石山蘇鐵所處的亞熱帶地區(qū)石灰?guī)r山地或石灰?guī)r縫隙的生境吻合。種子適宜萌發(fā)的溫度范圍窄是一些瀕危植物的共同特點，如海南龍血樹對溫度極為敏感,25℃是其種子萌發(fā)的適宜溫度,低于15℃或高于30℃均不能萌發(fā)[19]；合柱金蓮木萌發(fā)的適宜溫度為25℃,萌發(fā)率為56.67%,在15℃條件下萌發(fā)受到抑制,在30℃條件下,幼苗不能正常生長[20]。根據(jù)種子萌發(fā)對光照的需求，可將種子分為需光種子、忌光種子和光中性種子。石山蘇鐵種子在有無光照條件下均能萌發(fā)，雖萌發(fā)速度不同，但最終萌發(fā)率無顯著差異，說明光照不是其萌發(fā)的必要條件，這與較多瀕危植物如崖柏[21]、多毛坡壘[22]、云南藍果樹[23]種子的光照條件相同。石山蘇鐵的生境為低海拔的石灰?guī)r山地，光強多變且其較長時間處于溫度較高環(huán)境中，因此其具有較好的耐光氧化特性，對脅迫環(huán)境因子的適應(yīng)性強[24]，所以石山蘇鐵種子萌發(fā)對光照要求不嚴，適應(yīng)高溫環(huán)境也是其適應(yīng)環(huán)境的生態(tài)對策。

在5種基質(zhì)中，石山蘇鐵種子在腐殖土中的萌發(fā)率最高，在珍珠巖、黃土、混合土中萌發(fā)率差異不顯著，沙土不利于種子萌發(fā)，且萌發(fā)時滯較長。腐殖土、珍珠巖、黃土和混合土的營養(yǎng)成分、保濕保肥效果較沙土好。可知石山蘇鐵種子對透氣性要求不高，在營養(yǎng)成分高的土壤中萌發(fā)更好，因此即使在黃土、混合土等透氣性不強的基質(zhì)中，幼苗長勢均較好。不同埋深下以混合土為基質(zhì)的種子發(fā)芽勢和萌發(fā)率差異性不顯著，透氣性要求與不同基質(zhì)萌發(fā)試驗結(jié)論一致。石山蘇鐵種子在含水量80%的混合土中不能萌發(fā)，萌發(fā)以40%的含水量為宜，20%的含水量較40%處理的萌發(fā)率雖無顯著差異，但幼苗的生長情況弱于40%含水量處理。綜合石山蘇鐵種子在不同水分、基質(zhì)、埋深下的萌發(fā)情況，認為其萌發(fā)對基質(zhì)通氣透水性反應(yīng)不敏感，保持較好的肥力條件下，種子萌發(fā)情況較好。

石山蘇鐵種子萌發(fā)對溫度的適應(yīng)范圍較窄，對基質(zhì)的通氣透水性反應(yīng)不敏感，對土壤營養(yǎng)有要求，種子的萌發(fā)過程較短，利于種群空間資源的迅速占據(jù)，種子萌發(fā)對基質(zhì)、溫度、含水量要求較高是導致其種群衰落、淪為瀕危的重要原因。此外，本研究主要考慮了種子帶皮情況、溫度、基質(zhì)、光照、埋深、土壤含水量對石山蘇鐵萌芽效果的影響，而貯藏方式、浸種方法與時間、種子大小等因素間的相關(guān)作用，各因子間的交互作用對種子萌發(fā)的影響有待進一步研究。

3.2 石山蘇鐵種子的萌發(fā)與蘇鐵屬其他植物的比較

石山蘇鐵先使用稀硫酸浸泡10-15 min，再用清水浸泡直至外種皮完全吸水膨脹變軟厚。去除中種皮處理33 d后萌發(fā)，萌發(fā)率為63.33%，去除外種皮處理在50 d后萌發(fā)，萌發(fā)率為43.33%。在最有效萌發(fā)溫度35℃下，萌發(fā)率達到53.33%。仙湖蘇鐵經(jīng)濃流酸處理打破種子休眠,種子的萌發(fā)率可達60%左右[25]。德保蘇鐵在最有效萌發(fā)溫度30℃下，發(fā)芽時間顯著提前于20℃、25℃、20-35℃變溫，萌發(fā)率達93.33%;去皮后25 d開始萌發(fā)，不去皮則45 d后開始萌發(fā)，且去皮處理萌發(fā)率、萌發(fā)勢都較不去皮處理高[15]。葫蘆蘇鐵去皮后8 d開始萌發(fā)，萌發(fā)率為80%，萌發(fā)勢為80%;不去皮則55 d后開始萌發(fā)，萌發(fā)率為73.3%，萌發(fā)勢為50%，萌發(fā)率差異不大，但萌發(fā)勢差異較大[26]。蘇鐵種子經(jīng)濃硫酸浸種6 h，其發(fā)芽率達到88.3%，較不浸種處理的發(fā)芽率(63.3%)高；完全去除蘇鐵種子的種皮，發(fā)芽率達到89.3%，較完整種子的發(fā)芽率(64.9%)高[27]。說明蘇鐵屬植物種子都需要浸種處理，且萌發(fā)時間都不長，而去掉種皮能顯著提高石山蘇鐵、德保蘇鐵、葫蘆蘇鐵、蘇鐵種子的吸水性，縮短萌發(fā)時間，提高萌發(fā)率。石山蘇鐵的種皮被剝離后，其萌發(fā)率與仙湖蘇鐵差異不大，但與德保蘇鐵、葫蘆蘇鐵等的萌發(fā)率存在較大的差別；最適宜溫度下其與德保蘇鐵的萌發(fā)率也存在較大差別，說明蘇鐵屬植物種皮的結(jié)構(gòu)、密度等可能有較大區(qū)別。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，人工培育石山蘇鐵應(yīng)于成熟期采收種子，用稀硫酸溶液浸泡10-15 min后用清水浸泡除去外種皮，種子發(fā)芽的基本條件：30-35℃、去中種皮處理、使用腐殖土等營養(yǎng)成分較好的基質(zhì)，并保持40%的土壤含水量。光照和埋深不是種子萌發(fā)的必要條件。待種子萌發(fā)移栽后，保持35℃左右的較高溫、腐殖土或黃土為基質(zhì)、周期性光照、40%的土壤含水量、1-3 cm的埋深有利于其幼苗的生長。