鄒 蓉，孫菲菲,2，邱德全,3，蔣運生**，蒙美清,3，梁敏玲,3

(1.廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所，廣西植物功能物質與資源持續(xù)利用重點實驗室，廣西桂林 541006；2.桂林醫(yī)學院藥學院，廣西桂林 541199；3.百色學院農業(yè)與食品工程學院，廣西百色 533000)

通脫木Tetrapanaxpapyrifer，又名通草、木通樹、天麻子等[1]，因其莖髓經干燥后呈白色而被稱為“白通草”，經加工切成薄片后又被稱為“通草紙”[2]。通脫木屬常綠灌木或小喬木植物，主要生長在2 800 m以下向陽肥沃的土壤上，在我國主要分布于陜西、廣東、廣西、云南、四川、貴州、湖南、湖北、江西等地[3]。

隨著生活水平的提高，人們越來越關注身體健康，對保健食品的需求也日益增長，因而通脫木藥用價值的開發(fā)也越來越受到重視。目前通脫木的藥用功能主要有清熱解毒、利尿、益氣、通乳等[4]。通脫木全身都是寶，其花、葉、果實含有豐富的三萜類化合物、三萜皂苷類化合物、甾類化合物和神經酰胺類等物質[5]，對炎癥、癌癥、脂肪肝以及艾滋病等有一定的治療作用[6-9]。此外，通脫木中還富含黃酮化合物。因分子結構特殊，黃酮化合物具有很多藥用價值[10，11]，已被廣泛應用于臨床制藥和保健食品等領域[12]。目前有不少文獻報道了分心木、異葉梁王茶、黃花倒水蓮、黃根等植物體內黃酮提取及其抗氧化活性研究[13-16]，但未見相關的通脫木黃酮提取報道，且從通脫木中提取黃酮類化合物的工藝條件尚未明確。因此，探討通脫木黃酮的提取工藝具有重要的研究意義。

本研究采用單因素試驗方法分析提取時間、提取溫度和乙醇濃度等因素對通脫木黃酮提取率的影響，再利用響應面法優(yōu)化通脫木黃酮提取的最佳工藝條件，然后測定通脫木莖髓、葉中的黃酮含量，同時分析其體外抗氧化活性，比較通脫木莖髓、葉中黃酮含量的差異，為通脫木中黃酮的開發(fā)和利用提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

通脫木分別采自廣西壯族自治區(qū)百色市樂業(yè)縣拉雅(24°49′20″ N，106°16′59″ E)、拉雅二溝(24°55′33″ N，106°33′42″ E)和河池市南丹縣峨嵋村(24°57′1.88″ N，107°29′48.30″ E) 3個地區(qū)。3個地區(qū)都屬于中亞熱帶季風氣候區(qū)，地處云貴高原向廣西丘陵過渡的山原地帶。每個地區(qū)選取不同年份(一年生、兩年生、三年生)健壯樹苗各10株。試驗所使用的葉片、莖髓(莖中的白色髓)需烘干粉碎，過60目篩。

1.1.2 試劑

蘆丁標準品(批號：Y16M9S61523，上海源葉生物科技有限公司)，蒸餾水，乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、Vc、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、鄰二氮菲、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、硫酸亞鐵、H2O2、氯化鐵、鐵氰化鉀、磷酸鹽緩沖液、三氯乙酸均為分析純試劑，均購自桂林卓一生物有限公司。

1.1.3 試驗儀器

TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，KQ-300E型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)，HN-8型數顯恒溫水浴鍋(上海力辰邦西儀器科技有限公司)，電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 黃酮標準曲線的制作

稱量經真空干燥至恒重的蘆丁標準品13.2 mg，用60%乙醇溶解并定容至25 mL容量瓶作為標準溶液(0.528 mg/mL)[14]。分別準確吸取0 mL，0.4 mL，0.8 mL，1.2 mL，1.6 mL，2.0 mL的蘆丁標準品溶液置于25 mL的容量瓶內，分別加入2.0 mL，1.6 mL，0.8 mL，0.4 mL，0 mL的60%乙醇溶液，再加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，混勻靜置6 min；隨后加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL，靜置6 min；最后加入4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，用60%乙醇定容至刻度，搖勻后靜置15 min；在510 nm的波長下測定吸光度，繪制回歸曲線，回歸方程為Y=12.029x+0.0095，R2=0.999 2，蘆丁標準溶液在0-0.06 mg/mL時與吸光度呈現出良好的線性關系。

1.2.2 供試品溶液的配制

按照通脫木粉末與乙醇的質量體積比1∶50，稱取0.5 g樣品通脫木粉末與20%乙醇混合，在70℃條件下水浴70 min。然后用功率300 W、頻率40 kHz的超聲波輔助提取，過濾溶液，再用20%乙醇定容至50 mL，即得供試品溶液。

1.2.3 通脫木黃酮提取工藝的優(yōu)化試驗

①單因素試驗。

稱取通脫木樣品粉末0.5 g，進行黃酮提取工藝的單因素試驗，分別考察溫度(40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)、溶劑(乙醇)濃度(20%、40%、60%、80%、100%)、料液比(樣品∶乙醇，1∶30 g/mL，1∶40 g/mL，1∶50 g/mL，1∶60 g/mL，1∶70 g/mL)、超聲提取時間(10 min、30 min、50 min、70 min、90 min)對通脫木黃酮提取效果的影響。設置通脫木黃酮提取的基本條件：提取溫度60℃、溶劑(乙醇)濃度60%(V∶V)、料液比1∶30(g/mL)、超聲提取時間30 min、超聲功率300 W、超聲波頻率40 kHz。優(yōu)化當前影響因素時，以不同水平替代基本條件中相應因素的參數，其他因素的參數設置不變。待提取結束后，對漿液進行過濾，留取上清液，定容至50 mL，按照蘆丁標準曲線的步驟進行加樣，測定吸光度，按公式(1)[16]計算通脫木黃酮提取率。每個處理進行5個重復。

(1)

式中,C為提取液中黃酮的含量，mg/mL；V為提取液的體積，mL；M為樣品的粉末質量，mg。

②響應面優(yōu)化。

根據單因素試驗結果，以提取溫度、提取時間及料液比3個因素為考察因子，黃酮提取率(Y)為響應值，采用Design Expert 11軟件的Box-Benhnken中心組合設計三因素三水平試驗方案(表1)[17-20]，考察通脫木黃酮提取率。

表1 響應面試驗的因素與水平表

1.2.4 通脫木黃酮的體外抗氧化試驗

①通脫木黃酮對·OH的清除作用。

向試管內先加入1 mL 0.75 mol/L的鄰二氮菲和2 mL pH值為7.45的磷酸鹽緩沖液(PBS)、1 mL蒸餾水、1 mL 0.75 mol/L FeSO4溶液和1 mL 0.01% H2O2，攪拌均勻后置于37℃恒溫水浴鍋中水浴1 h。用蒸餾水作為參比，利用紫外分光光度計在536 nm處測定吸光度，記為Ap；用等體積的蒸餾水代替0.01% H2O2，測定在同波長下的吸光度，記為Ab；換等體積的樣液替代蒸餾水，測其吸光度，記為As。每組試驗設置3次平行?！H清除率(%)按公式(2)[21]計算，用Vc作對照。

(2)

②通脫木黃酮對DPPH·的清除作用。

取不同產地的黃酮粗提液分別與0.1 mmol/L的DPPH·溶液進行等體積混合，放置30 min后用無水乙醇作為參比，利用紫外分光光度計在517 nm處測定吸光度A1。使用同樣方法測定不同產地的黃酮粗提液與無水乙醇等體積混合液的吸光度A2，DPPH·溶液與無水乙醇等體積混合液的吸光度Ad，每組試驗設置3次平行。根據公式(3)[22]計算樣液對DPPH的清除率(%)，用Vc作對照。

(3)

(4)

④通脫木黃酮總還原力的測定。

取1.0 mL的黃酮粗提液，加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液和2.5 mL 0.22 mol/L磷酸鹽緩沖液，混勻后置于50℃水浴鍋中反應30 min，迅速冷卻并加入2.5 mL 10%三氯乙酸，在4 000 r/min的條件下離心10 min，取2.5 mL的上清液，加入2.5 mL蒸餾水和2.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混合后靜置10 min，以蒸餾水作參比，利用紫外分光光度計測定其在700 nm處的吸光度。吸光值越高，還原力越大[23]。用Vc作對照。

1.2.5 數據分析

應用Excel對試驗數據進行統(tǒng)計預處理，然后用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對相關數據進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

當提取溫度為70℃時，通脫木黃酮的提取率達到最高值1.25%，但繼續(xù)升高溫度，黃酮提取率降低，這可能是由于溫度過高導致雜質溶出，同時高溫極易使黃酮結構發(fā)生改變，因此黃酮的提取率降低[圖1(a)]。隨著乙醇濃度的提升，黃酮提取率變化不明顯，表明乙醇濃度對黃酮提取率影響不大，因此以20%乙醇作為提取溶劑，同時不再將乙醇濃度作為下一步優(yōu)化試驗的影響因素[圖1(b)]。當料液比為1∶50 (g/mL)時，黃酮提取率達到最大，但繼續(xù)提高料液比反而使提取率呈下降趨勢，這可能是因為料液比過高時，溶劑(乙醇)吸收了較多的超聲波能量，使通脫木粉末吸收的超聲波能量減少，導致黃酮提取率降低[圖1(c)]。當提取時間為70 min時，黃酮提取率最高，但提取時間大于70 min時，黃酮提取率呈現下降趨勢，這是因為超聲波的空化效應和熱效應破壞了黃酮結構，從而降低了黃酮提取率[圖1(d)]。

圖1 提取溫度(a)、乙醇濃度(b)、料液比(c)和提取時間(d)對黃酮提取率的影響

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面試驗結果

表2為17個試驗組合的通脫木黃酮提取率結果。當提取溫度為70℃、提取時間為70 min，料液比為1∶50 (g/mL)時，獲得最大通脫木黃酮提取率為1.62%(試驗13)。利用實驗數據建立黃酮提取率的響應面最佳擬合模型，二次回歸方程為

表2 響應面的設計與結果

Y=1.56+0.00525A-0.002B+0.056C+0.076AB-0.019AC+0.12BC-0.24A2-0.14B2-0.082C2，

式中，Y為預測的通脫木黃酮提取率(%)，A為提取溫度(℃)、B為提取時間(min)、C為料液比(g/mL)。模型相關系數R2=0.965 7，校正的決定系數AdjR2=0.908 4，說明模型的預測值和實際值在試驗中擬合度較好，試驗結果可靠。方差分析表明(表3)，回歸方程中F=130.76，P<0.000 1，表明回歸模型極顯著；失擬誤差P=0.654 3>0.05，表明回歸模型能夠顯著擬合提取溫度(A)、提取時間(B)、料液比(C)對通脫木黃酮率的影響。因此，本研究所建立的回歸方程能對試驗結果進行準確的預測分析。

表3 響應面回歸模型分析

2.2.2 響應面分析

通過對模型系數的分析可得各影響因素的主效應關系為提取溫度(A)>料液比(C)>提取時間(B)，表明提取溫度對通脫木黃酮提取率的影響最大。該結論與宋越冬等[24]對蕎麥葉黃酮的研究結論(超聲時間>超聲溫度>乙醇體積分數)存在一定差異，這可能是不同材料之間的性質差異所致。

此外，交互項AB、AC、BC的P值分別為0.379 3,0.171 2,0.026 9，交互項AB、AC對提取率沒有顯著性影響(P>0.05)，BC交互作用顯著(P=0.026 9)，表明BC交互作用對通脫木中黃酮的提取率會產生顯著的影響。比較分析AB、AC、BC的交互作用，獲得響應曲面及等高線(圖2)。在AB交互作用中[圖2(a)]，固定B值，提取率隨A值增加呈上升的趨勢，當A接近70℃時，曲面達到頂點，有最大提取率；固定A值，提取率也隨著B值增加而增大，當B接近70 min時達到最高。因此，在A接近70℃、B接近70 min的區(qū)域有最大提取率。在AC交互作用中[圖2(b)]，固定A值，提取率隨著C值的升高而增大，當C值超過1∶50時，提取率增加不明顯；固定C值，提取率隨A值的增加而增大，A值接近70℃時提取率最大。因此，在A接近70℃、C接近1∶50的區(qū)域，模型預測有最大黃酮提取率。在BC的交互作用中[圖2(c)]，固定B值，提取率隨C的增加而增大，當C值接近1∶50時有最大提取率；固定C值，提取率隨B值的增加而增大，當B接近70 min時，提取率最大。因此，在B接近70 min、C接近1∶50的區(qū)域有最大提取率。進一步結合模型預測，可獲得通脫木黃酮的最佳提取條件為乙醇濃度20%(單因素優(yōu)化結果)、料液比1∶50.54 (g/mL)、提取溫度71.06℃、提取時間69.26 min，預測的最佳黃酮提取率為1.60%，與實際值(試驗13，提取率為1.62%)接近，進一步表明該預測模型的可靠性。但考慮到實際操作的簡便性以及結合單因素試驗分析的結果，本研究確定通脫木黃酮提取工藝條件為乙醇濃度20%、料液比1∶50 (g/mL)、提取溫度70℃、提取時間70 min。

圖2 提取溫度、提取時間、料液比3個因子的交互作用

2.3 不同地區(qū)通脫木不同部位的黃酮含量比較

利用響應面優(yōu)化后的提取工藝，分別對廣西百色市樂業(yè)縣拉雅(LY)、拉雅二溝(EG)和河池市南丹縣峨嵋村(EM) 3個地區(qū)不同年份(一年生、兩年生、三年生)的通脫木黃酮進行提取，并計算提取率，結果如表4所示。不同地區(qū)的通脫木黃酮提取率有所差別，其中以廣西百色市樂業(yè)縣拉雅二溝山脈的通脫木黃酮較多，無論是葉子還是莖髓的提取率都比其他兩個地區(qū)的高，表明拉雅二溝地區(qū)的生態(tài)環(huán)境比較適宜通脫木的生存。此外，所有地區(qū)莖髓中黃酮含量均高于其葉子的黃酮含量，且兩年生的莖髓黃酮含量更高，這可能是由于物質運輸在莖髓部位比葉片更易儲存。這一結果對開發(fā)利用通脫木不同植株部位的黃酮有一定的指導意義。

表4 不同地區(qū)、不同年份和不同部位的通脫木黃酮提取率(%)

2.4 不同地區(qū)通脫木莖髓中黃酮體外的抗氧化活性

EG表示拉雅二溝，LY表示拉雅，EM表示峨嵋

3 結論

本研究通過單因素試驗和響應面試驗獲得的通脫木黃酮最佳提取工藝為乙醇濃度20%，料液比1∶50 (g/mL)，提取溫度70℃，提取時間70 min，此工藝下通脫木黃酮提取率可達1.62%。此外，通脫木黃酮的體外抗氧化性較強，其最佳藥用部位為莖髓，且兩年生的莖髓黃酮含量更高。