梁 蒙，林 宇，黃日波，杜麗琴

(廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005)

β-木糖苷酶是木聚糖降解的關(guān)鍵酶之一，在半纖維素底物的轉(zhuǎn)化過程中具有十分重要的作用，可以廣泛應(yīng)用于食品、飼料、造紙和能源等行業(yè)。β-木糖苷酶對(duì)4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(4-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside，pNPX)具有高度的底物特異性。此外，研究發(fā)現(xiàn)有少數(shù)β-木糖苷酶對(duì)4-硝基苯基-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(4-nitrophenyl-α-L-arabinopyranoside，pNPA)或4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG)也具有一定的水解活力[1]。這些雙功能或者多功能的β-木糖苷酶，在底物識(shí)別以及木質(zhì)纖維素資源轉(zhuǎn)化方面都具有十分重要的應(yīng)用潛力。β-木糖苷酶來源十分廣泛，當(dāng)前以細(xì)菌和真菌類來源的β-木糖苷酶報(bào)道最多。近年來，研究人員通過基因工程手段克隆和表達(dá)許多不同微生物來源的β-木糖苷酶基因，并從中發(fā)現(xiàn)一些具有轉(zhuǎn)糖苷功能或者水解功能的β-木糖苷酶。

β-木糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷功能是通過將供體如pNPX或者木二糖的木糖基轉(zhuǎn)移到單糖、木寡糖和一些短鏈醇類的受體上，形成長(zhǎng)鏈木寡糖和烷基木糖等含有木糖基的糖苷類化合物，這些糖基化的糖苷類化合物具有益生元、抗微生物、表面活性劑等作用，在食品、醫(yī)療和化妝品領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。而β-木糖苷酶的水解功能比較豐富，一方面，它可以和內(nèi)切木聚糖酶協(xié)同水解木聚糖，內(nèi)切木聚糖酶隨機(jī)作用于木聚糖內(nèi)部的糖苷鍵，產(chǎn)生短鏈木寡糖，而β-木糖苷酶隨后作用于這些短鏈木寡糖并產(chǎn)生大量的木糖，木糖被工業(yè)化酵母利用后可以產(chǎn)生具有高附加值的木糖醇和乙醇；另一方面，β-木糖苷酶還可以水解含有木糖基的化合物，如7-木糖-10-去乙酰紫杉醇、人參皂苷和三七皂苷等，產(chǎn)生在治療癌癥方面具有重要作用的生物活性物質(zhì)?；谄涔δ艿亩鄻有?，β-木糖苷酶在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥和環(huán)保方面已得到廣泛應(yīng)用，但總體還沒有達(dá)到大規(guī)模應(yīng)用的程度，主要原因在于酶自身性質(zhì)的不足，如不穩(wěn)定性、活力低和耐受性差等。因此，可通過分子改造技術(shù)定向地改造β-木糖苷酶，提升其性能，從而滿足各行各業(yè)的需求。當(dāng)前，越來越多家族的β-木糖苷酶晶體結(jié)構(gòu)陸續(xù)得到解析，這對(duì)于加深人們對(duì)β-木糖苷酶結(jié)構(gòu)方面的了解和后續(xù)的分子改造研究都具有十分重要的意義。

1 β-木糖苷酶的分類

迄今為止，碳水化合物活性酶(CAZy)數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)劃分172個(gè)糖基水解酶(Glycoside Hydrolases，GH)家族，基于保守型氨基酸序列的相似性，將β-木糖苷酶劃分為GH1、GH2、GH3、GH11、GH30、GH39、GH43、GH51、GH52、GH54、GH116和GH120家族，其中各家族的信息如表1所示。目前大部分報(bào)道的細(xì)菌和真菌來源的β-木糖苷酶主要集中在GH3、GH39、GH43和GH52家族，其中，細(xì)菌來源的β-木糖苷酶主要集中在GH39、GH43和GH52家族，而真菌來源的β-木糖苷酶主要集中在GH3和GH43家族[2-4]，絲狀真菌來源的β-木糖苷酶主要集中在GH3家族。

表1 β-木糖苷酶家族在CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中的分類

續(xù)表

2 β-木糖苷酶的性質(zhì)

β-木糖苷酶來源廣泛且性質(zhì)各異，β-木糖苷酶的最適pH值為5.0-7.0，真菌類β-木糖苷酶的最適pH偏弱酸性(表2)。β-木糖苷酶的最適反應(yīng)溫度一般在40-60℃，嗜熱且熱穩(wěn)定性良好的β-木糖苷酶也引起研究者們的關(guān)注。Rizzatti等[5]從Aspergillusphoenicis的發(fā)酵液中分離到一種具有熱穩(wěn)定性的β-木糖苷酶，該酶的最適反應(yīng)溫度為75℃。此外，Shi等[6]從嗜熱菌Thermotogathermarum中分離到一種β-木糖苷酶，該酶的最適反應(yīng)溫度為95℃，并且在85℃以下都具有較好的熱穩(wěn)定性。β-木糖苷酶的熱穩(wěn)定性在酶的儲(chǔ)存和工業(yè)化處理方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。底物特異性方面，β-木糖苷酶對(duì)pNPX具有高度的底物特異性，同時(shí)對(duì)pNPA也具有一定的催化活性。木糖耐受性是影響β-木糖苷酶商業(yè)化應(yīng)用的一個(gè)重要因素，GH3家族中β-木糖苷酶的木糖耐受性偏低，其Ki值為2-20 mmol/L，而GH39和GH43家族中的β-木糖苷酶具有較高的木糖耐受性，其Ki值為40-200 mmol/L，這些高耐受性木糖的β-木糖苷酶可以更好地水解木寡糖，有利于β-木糖苷酶和木聚糖酶發(fā)揮出更好的協(xié)同作用。

表2 不同來源的β-木糖苷酶的性質(zhì)

3 β-木糖苷酶的蛋白結(jié)構(gòu)

目前，β-木糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)已得到大量表征,但是關(guān)于β-木糖苷酶結(jié)構(gòu)方面的研究仍比較欠缺，只有來源于GH39、GH43、GH52和GH120家族的β-木糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)得到解析，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank，PDB)中的編號(hào)分別為4EKJ、5Z5H、4C1P和3VSV，不同GH家族的β-木糖苷酶在結(jié)構(gòu)上存在一定的差異性。

圖1 不同家族來源的β-木糖苷酶的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)

GH39家族被歸類為GH-A宗族，該宗族中的酶都有一個(gè)(β/α)8桶裝結(jié)構(gòu)域，并且由兩個(gè)保守的羧酸殘基分別作為親核試劑和質(zhì)子供體。由于這兩個(gè)殘基分別位于第4個(gè)和第7個(gè)β-折疊上，因此也被稱作“4/7超家族”[19]。來源于GH39家族的β-木糖苷酶蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)具有多樣性，含有單聚體、三聚體、四聚體和八聚體等多種類型的聚合體。GH43屬于GH-F宗族，該家族中β-木糖苷酶都有一個(gè)由5片槳葉組成的β-螺旋槳核心結(jié)構(gòu)域[20]。此外，在該家族已經(jīng)報(bào)道的β-木糖苷酶中，還具有一個(gè)α/β三明治結(jié)構(gòu)域[21]，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在底物催化上共同發(fā)揮作用。GH43家族中的β-木糖苷酶的四級(jí)結(jié)構(gòu)種類豐富，主要包含單聚體、二聚體和四聚體3種類型。與GH39和GH43家族相比，關(guān)于GH52和GH120家族的β-木糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)報(bào)道相對(duì)較少。GH52家族中β-木糖苷酶的第一種晶體結(jié)構(gòu)(PDB：4C1P)在2014年被Espina等[22]所報(bào)道，它的三級(jí)結(jié)構(gòu)是由N端折疊形成的β-三明治結(jié)構(gòu)域和C端的(α/α)6桶狀結(jié)構(gòu)域所組成，其四級(jí)結(jié)構(gòu)是一種單聚體。此外，GH52家族中還有一種來源于Bacillussp.的β-木糖苷酶的結(jié)構(gòu)被報(bào)道[23]。而GH120家族中僅有來源于ThermoanaerobacteriumsaccharolyticumJW/SL-YS485的β-木糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)(PDB：3VSV)被報(bào)道[24]。

4 β-木糖苷酶的催化機(jī)制

隨著對(duì)β-木糖苷酶的深入研究，其催化作用機(jī)制也相對(duì)明確。β-木糖苷酶催化反應(yīng)的實(shí)質(zhì)是親核試劑和質(zhì)子供體參與的酸堿催化反應(yīng)。迄今為止，β-木糖苷酶的作用機(jī)制分為保留型和反轉(zhuǎn)型兩種類型。反轉(zhuǎn)型的β-木糖苷酶通過一步單取代機(jī)制使產(chǎn)物的異頭碳構(gòu)象完全反轉(zhuǎn)，由原來的β型轉(zhuǎn)變?yōu)棣列?。而保留型的?木糖苷酶通過糖基化和去糖基化兩步雙取代機(jī)制參與催化，產(chǎn)物的異頭碳構(gòu)象不發(fā)生變化。目前已發(fā)現(xiàn)的β-木糖苷酶，只有GH43家族的β-木糖苷酶屬于反轉(zhuǎn)型機(jī)制，而分布相對(duì)集中的GH3、GH39、GH52家族的β-木糖苷酶均屬于保留型。研究人員發(fā)現(xiàn)，保留型的β-木糖苷酶可以催化水解和轉(zhuǎn)糖苷兩種反應(yīng)的進(jìn)行，而反轉(zhuǎn)型的β-木糖苷酶在催化水解反應(yīng)上更具有優(yōu)勢(shì)[25]。β-木糖苷酶催化的水解反應(yīng)和轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)，其區(qū)別在于去糖基化過程中進(jìn)入活性中心的是水分子還是底物分子，如果進(jìn)入活性中心的是水分子則發(fā)生的是水解反應(yīng)，反之則是轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)。因此，水解反應(yīng)和轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)是兩個(gè)可逆的過程[26]。

5 β-木糖苷酶的功能研究

5.1 β-木糖苷酶轉(zhuǎn)糖苷功能的研究

β-木糖苷酶可以催化糖苷鍵的合成，在供體和受體的參與下，可以產(chǎn)生在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力的糖苷化合物。木二糖、木寡糖和pNPX是最常見的供體，而受體主要為糖類和醇類化合物，供體和受體的變化都會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)產(chǎn)生顯著的影響。

目前，關(guān)于β-木糖苷酶轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)的報(bào)道中，常見的糖類受體主要是一些單糖(如木糖、葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖等)和木寡糖(木二糖和木三糖)。二糖類受體(蔗糖和麥芽糖)的報(bào)道較少且轉(zhuǎn)糖苷效率普遍低下。Kurakake等[27]發(fā)現(xiàn)β-木糖苷酶Xaw1以木二糖作為供體和受體，經(jīng)過轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)后能產(chǎn)生木三糖、木四糖和木五糖，且受體濃度對(duì)水解效率和轉(zhuǎn)糖苷效率具有顯著的影響，當(dāng)受體濃度較低時(shí)水解效率較高，隨著受體濃度的增加，水解效率下降而轉(zhuǎn)糖苷效率逐漸升高。此外，在β-木糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)中，醇類也是常見的受體，通過將pNPX或者木二糖中的木糖殘基轉(zhuǎn)移到醇類受體上，可以生成一些烷基糖苷類化合物，這些糖基化的糖苷化合物具有良好的抗微生物和表面活性劑作用[28]。醇類碳鏈的長(zhǎng)度會(huì)影響β-木糖苷酶對(duì)醇類的轉(zhuǎn)糖苷效率，隨著醇類碳鏈長(zhǎng)度的增加，轉(zhuǎn)糖苷的效率會(huì)呈明顯下降的趨勢(shì)，這可能與小分子醇類更容易進(jìn)入酶的活性中心有關(guān)。Muzard等[29]發(fā)現(xiàn)，β-木糖苷酶XylBH39以木三糖和木寡糖稀釋液為供體，以不同長(zhǎng)度碳鏈(C1-C8)的醇類為受體的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)中，碳鏈長(zhǎng)度在C1-C5內(nèi)的醇類適合為受體，而碳鏈長(zhǎng)度超過C5的醇類不適合為受體，并且還推斷對(duì)短鏈醇的偏好性可能與酶活性中心存在疏水性氨基酸有關(guān)。β-木糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)中，除糖類和醇類外，部分酚類化合物[30]和烷基糖苷類化合物[31,32]也可作為受體。此外，Boer等[33]發(fā)現(xiàn)，β-木糖苷酶rhGBA以4-甲基傘形酮-β-D-木糖苷為供體，分別以熒光和中性的膽固醇為受體，都有轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物的產(chǎn)生。

5.2 β-木糖苷酶水解功能的研究

除催化糖苷鍵的合成外，β-木糖苷酶還可以催化糖苷鍵的水解。自然界中許多化合物都含有β-木糖苷鍵，利用β-木糖苷酶的水解功能對(duì)糖苷化合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可以獲得具有更高生物活性或高附加值的物質(zhì)。目前，已報(bào)道的含有β-木糖苷鍵的化合物主要有木聚糖、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇、部分人參皂苷和三七皂苷等。

木聚糖主要分為硬木木聚糖和軟木木聚糖，其骨架是由多個(gè)木糖基通過β-1,4糖苷鍵相連而成，側(cè)鏈含有乙?；?、阿拉伯糖基、葡萄糖醛酸等多個(gè)取代基團(tuán)[34,35]。由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其完全被水解需要包括木聚糖酶和β-木糖苷酶在內(nèi)的多種木聚糖水解酶的參與。其中，木聚糖酶隨機(jī)作用于木聚糖內(nèi)部的糖苷鍵，產(chǎn)生短鏈的木寡糖，而β-木糖苷酶隨后作用于這些木寡糖的非還原性末端釋放出大量的木糖。β-木糖苷酶對(duì)木寡糖的水解減弱了木寡糖本身對(duì)木聚糖酶的反饋抑制作用，有利于木聚糖酶對(duì)木聚糖的徹底水解。目前對(duì)木聚糖水解的研究主要分為兩個(gè)方面，一方面是通過木聚糖酶的單獨(dú)水解作用，從而獲得一些具有益生元作用的木寡糖[36-39]；另一方面是通過木聚糖酶、β-木糖苷酶以及阿拉伯呋喃糖苷酶等多種木聚糖水解酶的協(xié)同水解作用，產(chǎn)生木糖和阿拉伯糖[40-43]。此外，隨著研究的深入，目前也有較多關(guān)于β-木糖苷酶可以單獨(dú)水解木聚糖的報(bào)道[44-46]，并且水解木聚糖的類型也比較豐富。Herrmann等[47]發(fā)現(xiàn)一個(gè)來源于TrichodermareeseiRUT C-30的β-木糖苷酶，該酶除了可以水解聚合度為2-7的木寡糖外，還可以水解山毛櫸木聚糖和4-O-甲基-葡糖醛酸木聚糖。Michelin等[48]從Aspergillusochraceus中得到一個(gè)胞外的β-木糖苷酶，該酶可以單獨(dú)水解樺木木聚糖、落葉松木聚糖、燕麥木聚糖和桉樹木聚糖。Zanphorlin等[49]發(fā)現(xiàn)，將一個(gè)假定的β-木糖苷酶的247位氨基酸Lys突變?yōu)镾er后，該酶同時(shí)具有β-木糖苷酶和木聚糖酶的活性。但這些報(bào)道的β-木糖苷酶水解木聚糖的活力比較微弱，而且尚未有結(jié)構(gòu)相關(guān)的文獻(xiàn)來解釋其機(jī)理，有待學(xué)者們進(jìn)一步研究。

β-木糖苷酶在水解7-木糖-10-去乙酰紫杉醇方面作用顯著，通過移除其C7位的木糖基團(tuán)可以生成具有高藥用價(jià)值的紫杉醇的藥物中間體10-去乙酰紫杉醇，后者可以進(jìn)一步酰化得到紫杉醇。紫杉醇主要從天然紅豆杉中提取，但在紅豆杉中的含量極低，而其衍生物7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的含量卻是紫杉醇的50倍左右。因此，β-木糖苷酶對(duì)于7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的水解作用在生物酶法合成紫杉醇的過程中占有十分重要的地位。目前已有多篇關(guān)于β-木糖苷酶水解底物7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的報(bào)道，當(dāng)?shù)孜餄舛仍? g/L時(shí)，中間產(chǎn)物10-去乙酰紫杉醇的轉(zhuǎn)化率為92%-98%[50-52]。Cheng等[53]發(fā)現(xiàn)，β-木糖苷酶LXYL-P1-2在7-木糖-10-去乙酰紫杉醇的底物濃度為0.625 g/L時(shí)轉(zhuǎn)化率能達(dá)到100%，當(dāng)?shù)孜餄舛忍岣叩?0 g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率也能達(dá)到85.6%。

β-木糖苷酶在水解人參皂苷方面也具有十分重要的作用，通過移除人參皂苷中含有的木糖基團(tuán)，可以將其轉(zhuǎn)化成具有藥用價(jià)值的稀有人參皂苷。目前已報(bào)道的含有木糖基團(tuán)的人參皂苷主要包括兩種類型，一種是原人參二醇(PPD)類型的人參皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb3，另一種是原人參三醇(PPT)類型的三七皂苷R1和R2。Shin等[54]發(fā)現(xiàn)，來源于BifidobacteriumbreveK-110的β-木糖苷酶可以水解人參皂苷Ra1和Ra2含有的木糖基團(tuán)，將其分別轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rb2和Rc。而Zhang等[55]利用來源于ThermotogapetrophilaDSM 13995的β-木糖苷酶Tpexyl3和一個(gè)熱穩(wěn)定的β-葡萄糖苷酶Tpebgl3將人參皂苷Rb2和Rc轉(zhuǎn)化為人參皂苷20(S)-Rg3，這種稀有皂苷對(duì)肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等多種癌癥的癌細(xì)胞具有抑制和抗轉(zhuǎn)移作用。此外，三七皂苷R1和R2分別含有一個(gè)木糖基，以β-1,2-糖苷鍵與葡萄糖基相連，通過β-木糖苷酶的水解作用可以將其分別轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rg1和Rh1，這兩種皂苷都具有抗炎、抗氧化和預(yù)防癌癥的作用[56,57]。目前已有超過180種人參皂苷被鑒定出來，不同種類的人參皂苷含有糖苷鍵的種類、數(shù)量和位置都有所不同，常見的糖苷鍵主要由β-木糖苷鍵、β-葡萄糖苷鍵、α-阿拉伯呋喃糖苷鍵等組成，因此β-木糖苷酶對(duì)人參皂苷的水解，也需要包括β-葡萄糖苷酶和α-阿拉伯呋喃糖苷酶等在內(nèi)的多種酶的參與和協(xié)同。

6 β-木糖苷酶的分子改造

β-木糖苷酶在自然界中的存在十分廣泛，常見于細(xì)菌和真菌類微生物。目前報(bào)道的多數(shù)細(xì)菌和真菌類的β-木糖苷酶都來源于溫和的環(huán)境，不能滿足農(nóng)業(yè)和工業(yè)催化過程中所需要的多種條件。酶的分子改造主要是通過定向進(jìn)化、理性設(shè)計(jì)和半理性設(shè)計(jì)的手段來實(shí)現(xiàn)，改造后的酶分子性能通常得到極大的改善。因此，通過對(duì)其定向地進(jìn)行分子改造，從而獲得在酶活力、木糖耐受性和穩(wěn)定性方面更具優(yōu)勢(shì)且滿足工藝需求的β-木糖苷酶已成為一種常規(guī)的手段。

酶活力是β-木糖苷酶理化性質(zhì)中的一個(gè)重要參數(shù)，與底物的催化效率密切相關(guān)。酶活力的提高可以極大地減少酶量的使用和反應(yīng)所需的時(shí)間，這對(duì)于節(jié)約工業(yè)生產(chǎn)中所需要的成本具有十分重要的意義。因此，通過分子改造對(duì)β-木糖苷酶進(jìn)行突變，從而提高其酶活力是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。李琦等[58]從嗜熱菌Dictyoglomusthermophilum中克隆并異源表達(dá)了β-木糖苷酶Xln-DT，通過定點(diǎn)突變?cè)?02位氨基酸處引入苯丙氨酸PHE和亮氨酸LEU，獲得突變體Xln-DT-202PHE和突變體Xln-DT-202LEU，其酶活力比原來分別提高3.28倍和2.97倍。Hartanti等[59]將來源于GeobacillusthermoleovoransIT-08的β-木糖苷酶GbtXyl43A的121位Asp分別突變成Val、Asn和Glu，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Asp121突變?yōu)閂al121和Asn121后，這兩個(gè)突變體的最適pH值比原來提高3.0個(gè)單位，并且在40℃時(shí)，所有突變體的酶活力都得到極大的提高。

熱穩(wěn)定性是β-木糖苷酶理化性質(zhì)中的另一個(gè)重要參數(shù)，對(duì)于酶的貯存和工業(yè)化的應(yīng)用都具有十分重要的意義。傳統(tǒng)篩選方法得到的β-木糖苷酶熱穩(wěn)定性相對(duì)較差，不能滿足工藝生產(chǎn)的需求。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)對(duì)β-木糖苷酶中某些重要的氨基酸進(jìn)行突變改造后，其原有的熱穩(wěn)定性得到極大的改善。Dehnavi等[60]對(duì)β-木糖苷酶SXA進(jìn)行定點(diǎn)突變獲得兩個(gè)突變體C101V和C286V，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)突變體在55℃和60℃時(shí)的熱穩(wěn)定性顯著增加。Singh等[61]利用DNA改組技術(shù)對(duì)β-木糖苷酶XylBH43進(jìn)行突變，得到熱穩(wěn)定性明顯改善的突變體R45K、M69P、L186Y和L186K，尤其以突變體L186K的熱穩(wěn)定性改善最明顯，其Kt0.5值增加8.1。

此外，對(duì)β-木糖苷酶進(jìn)行分子改造在揭示水解及轉(zhuǎn)糖苷過程中參與催化的關(guān)鍵氨基酸方面具有十分重要的作用。Huang等[62]將來源于Geobacillusstearothermophilus的β-木糖苷酶GSxyn的509位酪氨酸突變?yōu)楣劝彼岷螅?木糖苷酶GSxyn同時(shí)具有β-木糖苷酶和外切木聚糖酶的活性。Ochs等[63]對(duì)β-木糖苷酶BhXyl39參與以pNPX為供體、辛醇為受體的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)中的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行研究，通過定點(diǎn)突變將F166、F167和Y284分別突變?yōu)?A166和S166)(A167和S167)(A284和S284)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Y284在識(shí)別和結(jié)合pNPX的過程中具有重要的作用，F(xiàn)166突變?yōu)锳166后減小了辛醇進(jìn)入受體結(jié)合位點(diǎn)中的空間位阻，進(jìn)而促進(jìn)了突變體A166對(duì)辛醇轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)的進(jìn)行。

酶分子在生物進(jìn)化過程中遠(yuǎn)未達(dá)到完美的程度，通過分子改造技術(shù)，使β-木糖苷酶原有的性能得到顯著的改善，獲得大量具有優(yōu)異性能的β-木糖苷酶，極大地豐富了農(nóng)業(yè)和工業(yè)化用酶的選擇。

7 展望

近年來，隨著對(duì)木聚糖水解酶系的深入研究，關(guān)于β-木糖苷酶的篩選及其轉(zhuǎn)化半纖維素類木聚糖的研究也取得較大的進(jìn)展。當(dāng)前，對(duì)于β-木糖苷酶的研究主要集中在β-木糖苷酶的篩選、分子克隆與表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)表征以及協(xié)同木聚糖酶轉(zhuǎn)化利用半纖維類木聚糖等方面。酶活力、熱穩(wěn)定性和木糖耐受性是影響β-木糖苷酶工業(yè)化應(yīng)用的重要因素，而目前報(bào)道的細(xì)菌和真菌來源的β-木糖苷酶在這些方面各有優(yōu)劣，極大地限制了β-木糖苷酶的進(jìn)一步開發(fā)和利用。此外，當(dāng)前并沒有高通量篩選β-木糖苷酶的有效方法，因此篩選一些酶活力高、木糖耐受性和熱穩(wěn)定性好的β-木糖苷酶仍是一個(gè)長(zhǎng)期且艱巨的任務(wù)。

β-木糖苷酶是木聚糖水解的關(guān)鍵酶之一，對(duì)于木聚糖水解，當(dāng)前的研究主要集中在β-木糖苷酶和木聚糖酶兩者協(xié)同作用的方面，而關(guān)于它們和α-阿拉伯呋喃糖苷酶以及阿魏酸酯酶之間協(xié)同作用的研究還很欠缺。目前已發(fā)現(xiàn)一些具有α-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活力的雙功能或者多功能的β-木糖苷酶，打破了β-木糖苷酶對(duì)底物高度特異性的傳統(tǒng)認(rèn)知，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。此外，β-木糖苷酶在生物活性物質(zhì)轉(zhuǎn)化方面的研究也很欠缺，當(dāng)前報(bào)道的可以被β-木糖苷酶轉(zhuǎn)化成具有生物活性物質(zhì)的底物相對(duì)較少，主要包括7-木糖-10-去乙酰紫杉醇、部分人參皂苷和三七皂苷類化合物，后續(xù)可以利用一些化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)如ZINC (https://zinc.docking.org/)和PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)去篩選含有木糖基的化合物，進(jìn)而將其轉(zhuǎn)化成具有生物活性或者高附加值的物質(zhì)。

目前已有較多關(guān)于β-木糖苷酶理化性質(zhì)和功能性研究方面的報(bào)道，但是關(guān)于其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面的研究仍較少，只有部分GH39、GH43、GH52和GH120家族的β-木糖苷酶蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)得到解析，而對(duì)于β-木糖苷酶分布比較集中的GH3家族，目前還沒有關(guān)于該家族蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面的報(bào)道。因此，后續(xù)可以加大對(duì)β-木糖苷酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面的研究，通過基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)β-木糖苷酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定向改造，進(jìn)而獲得一些具有優(yōu)良性能或者工業(yè)應(yīng)用潛力的β-木糖苷酶。