朱宏星，高田毅，黃 楊，王 鑫，葛慶豐，王道營(yíng),*，孫 沖,*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

保水性是評(píng)價(jià)肉品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。肌球蛋白為鹽溶性蛋白，是肌肉中重要的蛋白成分也是形成凝膠的主要成分，對(duì)肉品的保水性起決定性作用[1]。肌球蛋白的分子形態(tài)為一個(gè)桿狀尾部和兩個(gè)球狀頭部，為不對(duì)稱結(jié)構(gòu)，形如“Y”狀，尾部主要由α-螺旋構(gòu)成。在凝膠形成過(guò)程中肌球蛋白會(huì)發(fā)生變性，結(jié)構(gòu)展開，蛋白聚合交聯(lián)形成有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。但是，凝膠形成過(guò)程極易受蛋白結(jié)構(gòu)變化影響，因此肌球蛋白結(jié)構(gòu)狀態(tài)與凝膠的保水性密切相關(guān)[2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)蛋白氧化也與肉品保水性相關(guān)[3]：適度氧化有利于蛋白凝膠形成穩(wěn)定的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)，改善凝膠的功能特性，從而改善肉品質(zhì)地，提高肉品保水性；蛋白的過(guò)度氧化則會(huì)形成不利的凝膠結(jié)構(gòu)，降低肉品的品質(zhì)。

肌紅蛋白（myoglobin，Mb）是肉品的主要呈色物質(zhì)，由血紅素輔基和珠蛋白組成。血紅素輔基與珠蛋白之間具有較強(qiáng)的親合力，能夠穩(wěn)定Mb結(jié)構(gòu)[4]。在肉品儲(chǔ)藏與加工過(guò)程中，pH值、溫度、內(nèi)源酶等因素的變化都會(huì)對(duì)血紅素輔基與珠蛋白的結(jié)合力產(chǎn)生影響，從而造成Mb構(gòu)象改變，血紅素輔基暴露甚至從Mb中脫落[5-9]，脫落的血紅素輔基會(huì)對(duì)肉品品質(zhì)造成影響。血紅素輔基是肉品中重要的促氧因子，能顯著促進(jìn)氧化的發(fā)生[10]。目前，關(guān)于血紅素輔基功能特性的研究大都集中在血紅素輔基對(duì)脂質(zhì)的氧化作用，關(guān)于血紅素輔基促脂質(zhì)氧化的具體機(jī)理，通過(guò)如下過(guò)程發(fā)生：一方面，亞鐵血紅素自動(dòng)氧化成高鐵血紅素，生成過(guò)氧羥自由基（HOO·）在其誘導(dǎo)脂質(zhì)氧化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11-12]；另一方面，血紅素輔基釋放后通過(guò)疏水作用力吸附在肌肉細(xì)胞的磷脂膜上，或者血紅素輔基環(huán)上帶正電荷的丙酸酯能通過(guò)靜電作用吸附在帶負(fù)電的磷脂頭部從而參與氧化反應(yīng)[13]。前期研究發(fā)現(xiàn)血紅素輔基處理可以使肌球蛋白氧化，蛋白羰基含量上升，巰基交聯(lián)形成二硫鍵，導(dǎo)致肌球蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[14]。目前針對(duì)血紅素輔基對(duì)蛋白氧化的影響，進(jìn)而與肉品品質(zhì)關(guān)聯(lián)性的研究尚未有深入報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)探究血紅素輔基氧化處理導(dǎo)致肌球蛋白結(jié)構(gòu)的改變對(duì)肌球蛋白凝膠特性及保水性的影響，旨在為控制肉品氧化、改善肉品保水性提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三黃雞購(gòu)自江蘇立華牧業(yè)股份公司；將雞暗處?kù)o置過(guò)夜后殺雞快速取出胸肉（胸大?。┯糜谔崛〖∏虻鞍?。

血紅素輔基 美國(guó)Sigma公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、尿素、β-巰基乙醇（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20/FG2 pH計(jì)、AL電子天平 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；T-25型數(shù)顯勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司；多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek儀器有限公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell垂直電泳系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；JS-680C全自動(dòng)凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；UniCenMR臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Herolab公司；SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；NICOMP Z3000納米粒度電位儀美國(guó)PSS公司；MCR302旋轉(zhuǎn)流變儀 奧地利Anton Paar公司；TMS-TOUCH物性測(cè)定儀 美國(guó)FTC公司；MesoMR23-060H-1低場(chǎng)核磁共振成像與分析系統(tǒng) 蘇州紐邁分析儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

參考Hayakawa等[15]的方法并略作改動(dòng)。將新鮮雞胸肉置于冰浴中快速降溫，剔除筋膜和脂肪，切碎后與提取液A（0.5 mol/L KCl、0.1 mol/L KH2PO4、50 mmol/L K2HPO4、5 mmol/L EDTA-2Na、4 mmol/L焦磷酸鈉，pH 6.5）以1∶3（g/mL）混合，5 000hg冰浴條件下勻漿5 s。將勻漿液在冰浴條件下進(jìn)行超聲處理，超聲功率200 W，工作時(shí)間1 s，間隔時(shí)間3 s，超聲時(shí)長(zhǎng)10 min。將超聲后并已攪拌20 min的勻漿液離心（4 ℃、5 000hg、10 min），用三層紗布過(guò)濾得上清液。用10 倍體積的預(yù)冷超純水對(duì)濾液進(jìn)行稀釋，4 ℃條件下混勻靜置4 h后去除上清液得沉降物。將沉降物離心（4 ℃、8 000hg、10 min）得沉淀，沉淀與提取液B（0.3 mol/L KCl、20 mmol/L K2HPO4、20 mmol/L KH2PO4，pH 7.0）以1∶3（g/mL）混勻20 min，再離心（4 ℃、10 000hg、20 min）得上清液。上清液加10 倍體積的預(yù)冷超純水混勻，4 ℃靜置過(guò)夜后離心（4 ℃、8 000hg、10 min）除上清液，收集沉淀，即為粗肌球蛋白。粗肌球蛋白與透析液（0.6 mol/L KCl、20 mmol/L K2HPO4、20 mmol/L KH2PO4，pH 7.5）以1∶3（g/mL）溶解并于透析袋（mw=10 kDa）中透析16 h，得到的溶液10 000hg離心20 min，上清液即為肌球蛋白溶液。用雙縮脲法測(cè)定肌球蛋白的蛋白濃度。

提取的肌球蛋白的純度通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）系統(tǒng)測(cè)定。

1.3.2 血紅素輔基的配制

準(zhǔn)確稱取血紅素輔基粉末0.163 g，用30 mmol/L NaOH溶液配制成濃度為10 mmol/L儲(chǔ)備液，避光保存[16]。用磷酸鹽緩沖液（0.6 mol/L KCl、20 mmol/L K2HPO4、20 mmol/L KH2PO4，pH 7.5）將儲(chǔ)備液稀釋成濃度為0.4、1.0、1.5、3.0 mmol/L的血紅素輔基溶液，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 血紅素輔基介導(dǎo)肌球蛋白氧化體系的構(gòu)建

向肌球蛋白沉淀中等體積混合血紅素輔基溶液（濃度分別為0、0.4、1.0、1.5、3.0 mmol/L），4 ℃避光條件下孵育16 h，將氧化后的肌球蛋白混合液用20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L K2HPO4、20 mmol/L KH2PO4，pH 7.5）進(jìn)行稀釋，4 ℃、10 000hg離心20 min得到不同氧化程度的肌球蛋白沉淀[17]。實(shí)驗(yàn)所需肌球蛋白濃度通過(guò)磷酸鹽緩沖液（0.6 mol/L KCl、20 mmol/L K2HPO4、20 mmol/L KH2PO4，pH 7.5）調(diào)整。

1.3.4 血紅素輔基氧化修飾肌球蛋白凝膠的制備

調(diào)整不同氧化程度的肌球蛋白樣品質(zhì)量濃度為35 mg/mL，稱取相同體積蛋白樣品置于小燒杯中，用聚乙烯（polyethylene，PE）保鮮膜封口。將裝有蛋白樣品的燒杯置于水浴鍋內(nèi)，20 ℃恒溫20 min后，勻速升溫至85 ℃（升溫速率1.5 ℃/min），保溫20 min。加熱完成后，取出樣品在室溫條件下放置至常溫，然后于4 ℃貯存過(guò)夜備用。每個(gè)處理組平行3次。

1.3.5 肌球蛋白溶解度及粒徑的測(cè)定

根據(jù)Liu Ru等[18]的方法略作修改，確定肌球蛋白的溶解度。將5 mg/mL氧化肌球蛋白溶液在4 ℃、離心10 min，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定離心前后肌球蛋白的質(zhì)量濃度，溶解度按下式計(jì)算：

使用納米激光粒度分析儀測(cè)定肌球蛋白的粒徑。調(diào)整肌球蛋白溶液質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，檢測(cè)3次后進(jìn)行信息采集，每個(gè)樣品平行采集3次，取平均圖譜。

1.3.6 肌球蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

采用濁度法測(cè)定肌球蛋白的乳化性質(zhì)[19]。調(diào)整肌球蛋白質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，取4 mL置于離心管中，并加入1 mL大豆油，10 000hg均質(zhì)1 min，立即從距離心管底5 mm處取勻漿液50 μL，加入到5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS溶液中，振蕩混勻后于500 nm處測(cè)定吸光度記為A0；靜置10 min后在相同的位置再次取勻漿液50 μL，加入到5 mL SDS溶液中，振蕩混勻后測(cè)定吸光度記為A10。以0.1% SDS溶液為空白對(duì)照，乳化活性和乳化穩(wěn)定性計(jì)算公式如下：

式中：A0、A10為乳狀液在500 nm處第0、10分鐘的吸光度；φ為乳化液的油體積分?jǐn)?shù)（φ=0.2）；C為乳化前的蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）。

1.3.7 肌球蛋白流變特性

參考Diedericks等[20]的方法略作修改。取一定量的肌球蛋白溶液置于動(dòng)態(tài)流變儀的載物臺(tái)上，設(shè)置圓形平板與載物臺(tái)間距為1 000 μm，并用液體石蠟封住樣品。實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置如下：振動(dòng)頻率0.1 Hz，應(yīng)變力為2%，以2 ℃/min的升溫速率從20 ℃加熱到80 ℃。

1.3.8 肌球蛋白凝膠強(qiáng)度

取肌球蛋白凝膠樣品置于質(zhì)構(gòu)儀載物臺(tái)上，設(shè)置參數(shù)：應(yīng)變力0.1 N，測(cè)試速率30 mm/min，形變量50%，穿刺距離10 mm，室溫條件下測(cè)定[2]。

1.3.9 凝膠持水力（water-holding capacity，WHC）

采用離心法測(cè)定凝膠WHC[21]。將制備好的蛋白凝膠置于離心管后，4 ℃、10 000hg離心15 min，記錄離心前后離心管的質(zhì)量以及空離心管質(zhì)量。計(jì)算公式如下：

總而言之，GPS系統(tǒng)具有數(shù)據(jù)測(cè)量的高效性、準(zhǔn)確性和科學(xué)性，減少了工作流程中浪費(fèi)的大量人力、財(cái)力、物力?，F(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了GPS技術(shù)和地理信息系統(tǒng)的結(jié)合，二者的應(yīng)用也為人們的工作和生活帶來(lái)了極大的便利。在未來(lái)的日子里，研究人員還要不斷完善GPS技術(shù)，為各行業(yè)提供準(zhǔn)確有效的數(shù)據(jù)支持。

式中：m0為離心管的質(zhì)量/g；m1為離心前離心管與凝膠的總質(zhì)量/g；m2為離心后離心管與凝膠的總質(zhì)量/g。

1.3.10 肌球蛋白凝膠低場(chǎng)核磁共振測(cè)定

采用低場(chǎng)核磁共振成像與分析系統(tǒng)對(duì)肌球蛋白凝膠進(jìn)行測(cè)定以確定凝膠樣品的橫向弛豫時(shí)間（T2）[22]。將2 g樣品放入圓柱形玻璃管（直徑15 mm）中。參數(shù)設(shè)置如下：測(cè)量溫度32 ℃，質(zhì)子共振頻率22.6 MHz，使用25 mm線圈，r值為200 μs，等待時(shí)間為4 000 ms，脈沖個(gè)數(shù)為15 000，兩個(gè)峰值間隔為0.25 ms，掃描次數(shù)為16，反演迭代次數(shù)為100 000，采用CPMG序列進(jìn)行測(cè)量，每組3次平行。

1.3.11 肌球蛋白凝膠分子間作用力的測(cè)定

根據(jù)Yang Xiaoyu等[23]的方法并作修改，通過(guò)不同溶劑破壞肌球蛋白凝膠形成過(guò)程中的分子作用力。NaCl溶液（0.6 mol/L）破壞離子鍵，低濃度尿素（1.5 mol/L）可破壞氫鍵，高濃度尿素（8 mol/L）可同時(shí)破壞氫鍵和疏水相互作用，而β-巰基乙醇（0.5 mol/L）會(huì)破壞二硫鍵。將樣品分別溶解在以下溶劑中，以分析血紅素輔基誘導(dǎo)的肌球蛋白凝膠形成過(guò)程中不同分子作用的貢獻(xiàn)。選擇的4種溶劑為S1：0.6 mol/L NaCl；S2：0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素；S3：0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素；S4：0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.5 mol/Lβ-巰基乙醇。將樣品（0.5 g）溶解在5 mL的不同溶劑中，勻漿后離心（8 000hg、4 ℃、15 min）。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)量濃度。離子鍵、氫鍵、疏水作用和二硫鍵的貢獻(xiàn)分別以S1、S2-S1、S3-S2、S4-S3的溶解度表示。

1.3.12 肌球蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察

參考Zheng Jiabao等[24]的方法用掃描電子顯微鏡在10 kV的掃描電壓下觀察肌球蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。將同樣大小的凝膠在液氮中快速冷凍，冷凍后的樣品通過(guò)真空冷凍干燥機(jī)干燥，將樣品截面朝上逐個(gè)粘貼在掃描電鏡樣品臺(tái)上，表面噴金鍍膜后于放大500 倍條件下觀察肌球蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，結(jié)果表示為 fs。數(shù)據(jù)分析采用軟件IBM SPSS Statistics 25.0，運(yùn)用單因素（方差分析法）ANOVA-Tukey對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素檢驗(yàn)分析，P＜0.05，差異顯著，采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白溶解度及粒徑的影響

在肉品加工中處于高度溶解狀態(tài)的蛋白能表現(xiàn)出良好的保水性[25]。由圖1A可知，0.2～0.5 mmol/L血紅素輔基處理下，肌球蛋白溶解度基本無(wú)變化；血紅素輔基濃度繼續(xù)升高，肌球蛋白溶解度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，當(dāng)濃度提高至1.5 mmol/L，溶解度降低了28.13%。粒徑大小可用來(lái)表明肌球蛋白的聚集程度。由圖1B可知，肌球蛋白在添加血紅素輔基后，肌球蛋白的粒徑增大，血紅素濃度增加至1.0～1.5 mmol/L后，肌球蛋白的粒徑顯著增大（P＜0.05）。肌球蛋白溶解度與粒徑結(jié)果表明適度的氧化導(dǎo)致肌球蛋白交聯(lián)聚集，形成可溶性聚集體，肌球蛋白仍表現(xiàn)出良好的溶解狀態(tài)，但其平均粒徑有所增大。在高濃度氧化攻擊下，蛋白發(fā)生過(guò)度氧化，蛋白分子交聯(lián)聚集，大量不溶性的聚集體的形成降低了蛋白的溶解性并且導(dǎo)致了肌球蛋白平均粒徑顯著增大（P＜0.05）[26]。

圖1 血紅素輔基濃度對(duì)肌球蛋白溶解度（A）和粒徑（B）的影響Fig.1 Effect of hemin prosthetic group concentration on solubility (A) and particle size (B) of myosin

2.2 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響

乳化性可以通過(guò)乳化活性和乳化穩(wěn)定性表達(dá)，乳化活性反映了蛋白在水油界面的吸附能力，乳化穩(wěn)定性反映蛋白保持乳化體系中水油界面穩(wěn)定狀況的重要指標(biāo)[27]。如圖2所示，0.2～1.0 mmol/L血紅素輔基處理的肌球蛋白溶液乳化活性差異不顯著（P＞0.05）；當(dāng)血紅素輔基濃度在0.2～0.5 mmol/L之間時(shí)，肌球蛋白乳化穩(wěn)定性有所提高；當(dāng)血紅素輔基濃度達(dá)1.5 mmol/L時(shí)，乳化活性與乳化穩(wěn)定性顯著降低（P＜0.05）。肌球蛋白乳化特性結(jié)果表明低濃度血紅素輔基對(duì)肌球蛋白氧化程度不高，肌球蛋白部分解折疊，疏水基團(tuán)暴露有利于其在油滴表面形成穩(wěn)定的蛋白膜[28]，同時(shí)疏水氨基酸與親水、親油氨基酸暴露并相互影響，導(dǎo)致肌球蛋白乳化活性變化不顯著（P＞0.05）[29]；高濃度血紅素輔基處理下肌球蛋白過(guò)度氧化，變性程度加劇，分子交聯(lián)形成大量不溶性的蛋白聚集體，蛋白分子穩(wěn)定性降低，難以形成穩(wěn)定的界膜，同時(shí)蛋白與脂肪間的交聯(lián)能力降低，乳狀液分層加快，表現(xiàn)出乳化活性和乳化穩(wěn)定性的降低[30]。

圖2 血紅素輔基濃度對(duì)肌球蛋白乳化活性（A）和乳化穩(wěn)定性（B）的影響Fig.2 Effect of hemin prosthetic group concentration on emulsifying activity (A) and emulsion stability of myosin (B)

2.3 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白凝膠流變學(xué)特性的影響

儲(chǔ)能模量（G’）又稱彈性模量，用來(lái)反映凝膠過(guò)程中的彈性部分，可以反映凝膠的質(zhì)構(gòu)及微觀結(jié)構(gòu)等性質(zhì)。損耗模量（G’’）代表凝膠的黏度，一般與G’的變化趨勢(shì)一致[31]。如圖3所示，不同濃度血紅素輔基處理后肌球蛋白G’和G’’的變化趨勢(shì)相似，且G’值始終高于G’’值，表明肌球蛋白的彈性及凝膠狀特性在黏彈性中占主導(dǎo)地位。未添加血紅素輔基的肌球蛋白，其G’值在53 ℃和60 ℃有2個(gè)轉(zhuǎn)變峰：53 ℃為肌球蛋白凝膠的形成期，此階段主要是肌球蛋白分子頭部的變性與聚合，隨后蛋白尾部解折疊，溫度升高使得低溫凝膠網(wǎng)絡(luò)被破壞，流動(dòng)性增強(qiáng)，G’值降低，隨著溫度繼續(xù)升高，肌球蛋白最終形成不可逆的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[16]。添加適量的血紅素輔基后（0.2～0.5 mmol/L），肌球蛋白第1個(gè)轉(zhuǎn)變峰不明顯，這可能是因?yàn)檠t素輔基氧化導(dǎo)致肌球蛋白結(jié)構(gòu)部分展開，從而削弱了肌球蛋白的頭部聚集，使得肌球蛋白在加熱初期的聚集模式由頭部聚集為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐晕膊拷宦?lián)為主[32]。隨后肌球蛋白G’值逐漸增大，原因主要是血紅素輔基氧化進(jìn)一步促進(jìn)了肌球蛋白分子解折疊，巰基氧化形成二硫鍵，蛋白分子發(fā)生交聯(lián)，最終形成了良好的網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)；當(dāng)血紅素輔基濃度增加至1.5 mmol/L時(shí)，60 ℃峰幾乎消失，曲線變得平緩，這主要是由于高添加量的血紅素輔基造成肌球蛋白過(guò)度氧化變性，蛋白過(guò)度解折疊，疏水基團(tuán)嚴(yán)重暴露，同時(shí)蛋白大量聚集，蛋白穩(wěn)定性降低，不利于肌球蛋白加熱后進(jìn)一步交聯(lián)形成有序的三維網(wǎng)狀凝膠結(jié)構(gòu)。

圖3 血紅素輔基濃度對(duì)肌球蛋白流變學(xué)特性的影響Fig.3 Effect of hemin prosthetic group concentration on rheological properties of myosin

2.4 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白凝膠強(qiáng)度的影響

通過(guò)熱誘導(dǎo)作用形成肌球蛋白凝膠，其蛋白的凝膠特性與保水性有關(guān)[33]。由圖4可知，隨著氧化程度加深，肌球蛋白凝膠強(qiáng)度發(fā)生顯著改變。低濃度血紅素輔基（0.2～0.5 mmol/L）處理的蛋白凝膠，其凝膠強(qiáng)度較未處理組顯著提高（P＜0.05）；而高濃度血紅素輔基（1.5 mmol/L）氧化處理后，其凝膠強(qiáng)度顯著下降（P＜0.05）。肌球蛋白凝膠強(qiáng)度結(jié)果表明：低濃度血紅素輔基對(duì)肌球蛋白凝膠的形成更為有利，這主要是由于適度氧化可以提高蛋白的溶解性，使蛋白結(jié)構(gòu)伸展，分子交聯(lián)形成可溶性聚合物，蛋白的凝膠特性得到改善，蛋白的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)強(qiáng)度得到提高。但過(guò)度氧化會(huì)使蛋白溶解度大大降低，由于蛋白的過(guò)度解旋，導(dǎo)致疏水基團(tuán)的大量暴露，分子聚集形成不溶性聚合物，溶脹不充分，不利于凝膠體系的形成[33]，這也與肌球蛋白流變學(xué)結(jié)果相符合。

圖4 血紅素輔基濃度對(duì)肌球蛋白凝膠強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of hemin prosthetic group concentration on gel strength of myosin gels

2.5 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白凝膠持水性的影響

如圖5所示，添加0.2～0.5 mmol/L血紅素輔基后，肌球蛋白凝膠的持水性提高了14.42%；當(dāng)血紅素添加量提高至1.0～1.5 mmol/L后，肌球蛋白凝膠WHC顯著降低（P＜0.05）。持水性的結(jié)果表明適度氧化能夠增強(qiáng)肌球蛋白疏水相互作用，導(dǎo)致蛋白分子交聯(lián)聚集形成可溶性聚集體，這一變化有助于加熱過(guò)程中肌球蛋白尾部的有序聚集，形成規(guī)則的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高肌球蛋白凝膠束縛水分的能力[34]；高濃度血紅素輔基的過(guò)度氧化則降低了肌球蛋白的溶解度，破壞了肌球蛋白的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，肌球蛋白發(fā)生變性并過(guò)度聚集形成大量不溶性的聚集體，不利于穩(wěn)定的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，對(duì)水分的截留能力弱，水分流失嚴(yán)重，保水能力差。

圖5 血紅素輔基濃度對(duì)肌球蛋白凝膠持水性的影響Fig.5 Effect of hemin prosthetic group concentration on water-holding capacity of myosin gels

2.6 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白凝膠水分分布的影響

如圖6所示，肌球蛋白凝膠中4種狀態(tài)水分的橫向弛豫時(shí)間T2分別在0～5、8～30、147～534、1 417～3 765 ms之間，分別表示強(qiáng)結(jié)合水（T2b）、弱結(jié)合水（T21）、不易流動(dòng)水（T22）和自由水（T23）[35]。其中T22信號(hào)最強(qiáng)，T23其次，表明肌球蛋白凝膠中的水分主要以不易流動(dòng)水與自由水的形式存在。有關(guān)研究表明弛豫時(shí)間T2與凝膠中水分子的游離程度呈正相關(guān)，即弛豫時(shí)間越小，蛋白與水分子結(jié)合越緊密，水分自由度越低；反之弛豫時(shí)間越長(zhǎng)，則水分與蛋白結(jié)合力越弱，水分越容易流失[36]。添加了血紅素輔基的肌球蛋白，其T2弛豫時(shí)間和峰比例均發(fā)生了明顯變化：0.2～0.5 mmol/L血紅素輔基處理肌球蛋白凝膠后，T22和T23減小，不易流動(dòng)水峰面積比例P22顯著增高（P＜0.05）、自由水峰面積比例P23顯著降低（P＜0.05）；1.0～1.5 mmol/L血紅素輔基處理后肌球蛋白凝膠T2提高，不易流動(dòng)水峰面積比例P22顯著降低（P＜0.05），自由水峰面積比例P23顯著增高（P＜0.05）。這些結(jié)果說(shuō)明了血紅素輔基適度氧化導(dǎo)致肌球蛋白更多極性基團(tuán)的暴露，水的親和力增強(qiáng)，有助于肌球蛋白形成密集有序的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，鎖住更多的水分，降低凝膠中水分的流動(dòng)性[37]，血紅素輔基高度氧化導(dǎo)致肌球蛋白結(jié)構(gòu)過(guò)度展開，大量的疏水基團(tuán)暴露出來(lái)，蛋白分子發(fā)生聚集，同時(shí)高度氧化導(dǎo)致肌球蛋白發(fā)生變性，穩(wěn)定性降低，不利于有序穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，自由水流動(dòng)性增強(qiáng)，表現(xiàn)出凝膠持水率的降低。

圖6 不同濃度血紅素輔基對(duì)肌球蛋白凝膠水分分布的影響Fig.6 Effect of hemin prosthetic group concentration on moisture distribution of myosin gels

2.7 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白凝膠分子間相互作用的影響

凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是蛋白與蛋白、蛋白與水分子之間二硫鍵、氫鍵和疏水相互作用達(dá)到平衡的結(jié)果[38]。凝膠中添加不同的變性劑，能夠破壞維持凝膠穩(wěn)定的分子間作用力，提高蛋白的溶解度。在熱誘導(dǎo)肌球蛋白形成凝膠的過(guò)程中，熱可以破壞維持蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力，蛋白在變性再聚集過(guò)程中又形成了新的分子間作用力穩(wěn)定凝膠結(jié)構(gòu)[39]。由圖7所示，維持肌球蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要作用力為疏水相互作用和二硫鍵，添加了0.2 mmol/L血紅素輔基后，疏水相互作用和二硫鍵含量顯著增加（P＜0.05），當(dāng)血紅素輔基濃度提高至1.0 mmol/L后，蛋白凝膠中的疏水相互作用和二硫鍵含量開始降低。肌球蛋白凝膠分子間作用力的變化表明低濃度的血紅素輔基氧化導(dǎo)致蛋白疏水基團(tuán)與巰基部分暴露，疏水相互作用增強(qiáng)，游離巰基結(jié)合形成二硫鍵，此時(shí)蛋白開始聚集，肌球蛋白結(jié)構(gòu)在加熱前展開的程度更大，這有利于穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。而過(guò)度氧化使蛋白變性過(guò)度，結(jié)構(gòu)大量展開，蛋白分子間發(fā)生過(guò)度交聯(lián)聚集，肌球蛋白在加熱前已變形成大量的聚集體，這不利于熱誘導(dǎo)過(guò)程中蛋白分子的交聯(lián)，因此形成粗糙、無(wú)序、不穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖7 血紅素輔基濃度對(duì)肌球蛋白凝膠化學(xué)作用力的影響Fig.7 Effect of hemin prosthetic group concentration on chemical forces of myosin gels

2.8 血紅素輔基對(duì)肌球蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)肌球蛋白凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描電鏡研究有助于深入了解氧化對(duì)蛋白凝膠形成過(guò)程的影響[40]。肌球蛋白凝膠的狀態(tài)與蛋白持水性呈現(xiàn)相關(guān)性。未處理的肌球蛋白凝膠存在明顯的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖8A）；當(dāng)添加血紅素輔基濃度為0.2～0.5 mmol/L時(shí)（圖8B、C），肌球蛋白凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更為明顯，表面更平整，孔隙細(xì)膩且形狀規(guī)則均勻，結(jié)構(gòu)致密，有較好的成膠能力。致密均勻的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有助于水分的截留，這與凝膠的保水性結(jié)果一致；當(dāng)添加血紅素輔基濃度為1.0～1.5 mmol/L時(shí)（圖8D、E），蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐漸不清晰，結(jié)構(gòu)粗糙松散，孔隙變大，分布不均，肌球蛋白凝膠結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂。這一結(jié)果表明高濃度的血紅素輔基使肌球蛋白過(guò)度氧化，導(dǎo)致蛋白變性，結(jié)構(gòu)過(guò)度展開，蛋白分子間疏水性聚集導(dǎo)致蛋白過(guò)度交聯(lián)，阻礙了肌球蛋白熱誘導(dǎo)聚集交聯(lián)以及二硫鍵的形成，從而使蛋白膠束分布不均勻，不能形成良好的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，截留水分子的能力變?nèi)?，表現(xiàn)出保水性降低的現(xiàn)象。

圖8 血紅素輔基濃度對(duì)肌球蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.8 Effect of hemin prosthetic group concentration on the microstructure of myosin gels

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，隨著血紅素輔基濃度的增加，肌球蛋白溶解度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，粒徑增加，這是由于血紅素輔基氧化肌球蛋白造成蛋白結(jié)構(gòu)展開，蛋白分子發(fā)生聚集。低濃度血紅素輔基（0.2～0.5 mmol/L）處理后有助于提高肌球蛋白乳化穩(wěn)定性，改善肌球蛋白凝膠強(qiáng)度，同時(shí)提高凝膠中不易流動(dòng)水的比例，提升凝膠束縛水的能力；高濃度血紅素輔基（1.0～1.5 mmol/L）處理后，肌球蛋白結(jié)構(gòu)大量展開并過(guò)度聚集，肌球蛋白變性加劇，降低了蛋白的乳化特性，因此肌球蛋白凝膠呈現(xiàn)粗糙的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，凝膠保水性下降，凝膠品質(zhì)降低。在此基礎(chǔ)上，對(duì)血紅素輔基處理后肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠形成過(guò)程中分子間作用力變化的研究表明，穩(wěn)定肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的主要作用力為疏水相互作用和二硫鍵，適度氧化有利于肌球蛋白凝膠形成過(guò)程中疏水相互作用及二硫鍵的形成，凝膠網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定提高性；過(guò)度氧化的肌球蛋白在加熱前已大量聚集，不利于熱誘導(dǎo)過(guò)程中疏水相互作用以及二硫鍵的形成、分子的聚集以及穩(wěn)定有序的凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。