王宜峰　朱新?！±畲?/p>

【摘要】 目的：分析長鏈非編碼RNA（LncRNA）和程序性死亡配體1（PD-L1）表達(dá)與卵巢癌患者化療耐藥性的關(guān)系。方法：收集2019年1月-2020年12月于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的128例卵巢癌患者臨床資料進(jìn)行回顧性分析，其中鉑類藥物耐藥患者69例設(shè)為耐藥組，鉑類藥物敏感患者59例設(shè)為敏感組，比較兩組的卵巢癌組織中LncRNA與PD-L1的表達(dá)情況，分析患者LncRNA和PD-L1的表達(dá)與卵巢癌患者化療耐藥性的關(guān)系。結(jié)果：對LncRNA的兩個分子[生長阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5（GAS5）、HOXC基因座轉(zhuǎn)錄因子（HOTAIR）]進(jìn)行分析，耐藥組以上兩個LncRNA分子的表達(dá)水平均明顯高于敏感組（P<0.05），耐藥組PD-L1表達(dá)水平明顯高于敏感組（P<0.05）;多因素logistic回歸分析顯示，GAS5、HOTAIR與PD-L1均為卵巢癌患者化療耐藥的獨(dú)立危險因素（P<0.05）;PD-L1表達(dá)水平和GAS5、HOTAIR表達(dá)水平均呈顯著正相關(guān)（P<0.05）;腫瘤細(xì)胞平均抑制率為（36.63±6.53）%，與PD-L1、GAS5、HOTAIR表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：卵巢癌組織中LncRNA的GAS5、HOTAIR分子與PD-L1的高表達(dá)與卵巢癌患者化療耐藥性密切相關(guān)，LncRNA與PD-L1相互協(xié)同，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞耐藥。

【關(guān)鍵詞】 LncRNA PD-L1 化療耐藥性 卵巢癌

Analysis of the Relationship between the Expression of LncRNA and PD-L1 and Chemoresistance in Patients with Ovarian Cancer/WANG Yifeng， ZHU Xinhai， LI Cui. //Medical Innovation of China， 2022， 19（11）： -173

[Abstract] Objective： To analyze the relationship between the expression of long non-coding RNA （LncRNA） and programmed death ligand 1 （PD-L1） and chemoresistance in patients with ovarian cancer. Method： The clinical data of 128 patients with ovarian cancer treated in the First Affiliated Hospital of Ji’nan University from January 2019 to December 2020 were collected and analyzed retrospectively， among them， 69 patients with platinum drug resistance were set as the drug-resistance group and 59 patients with platinum drug sensitivity were set as the sensitive group. The expression of LncRNA and PD-L1 in ovarian cancer tissues of the two groups were compared， the association between LncRNA and PD-L1 expression and chemoresistance in patients with ovarian cancer was analyzed. Result： Two molecules of LncRNA [growth arrest specific transcription factor 5 （GAS5） and HoxC locus transcription factor （HOTAIR）] were analyzed， the expression levels of these two LncRNA molecules in drug-resistant group were significantly higher than those in sensitive group （P<0.05）， and the expression level of PD-L1 in drug-resistant group was significantly higher than that in sensitive group （P<0.05）; multivariate logistic regression analysis showed that GAS5， HOTAIR and PD-L1 were independent risk factors of chemotherapy resistance in ovarian cancer patients （P<0.05）. The expression level of PD-L1 was significantly positively correlated with the expression levels of GAS5 and HOTAIR （P<0.05）; the average inhibition rate of tumor cells was （36.63±6.53）%， which was negatively correlated with the expression levels of PD-L1， GAS5 and HOTAIR （P<0.05）. Conclusion： The high expression of GAS5， HOTAIR in LncRNA and PD-L1 of ovarian cancer is closely related to chemotherapy resistance of ovarian cancer patients， LncRNA and PD-L1 cooperate with each other to promote drug resistance of tumor cells.

[Key words] LncRNA PD-L1 Chemoresistance Ovarian cancer

First-author’s address： Guangzhou Ping’an Hao Medical Laboratory Co.，Ltd.， Guangzhou 510670， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.11.042

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中常見的一種惡行腫瘤，其死亡率長期位居各種婦科腫瘤中的首位，其中導(dǎo)致其高死亡率的兩大原因為早期診斷困難和患者的耐藥性，同時治療失敗的原因亦多為耐藥性，卵巢癌患者出現(xiàn)多藥耐藥通常由腫瘤組織中異質(zhì)細(xì)胞群中的耐藥細(xì)胞引起[1-2]。目前，已有研究表明長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）與程序性死亡配體-1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）對卵巢癌的進(jìn)展起到促進(jìn)作用，且兩者具有協(xié)同作用[3-5]。因此本研究對128例患者卵巢癌組織細(xì)胞LncRNA與PD-L1表達(dá)水平進(jìn)行分析，探討兩項指標(biāo)與卵巢癌患者化療耐藥性的關(guān)系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 組織標(biāo)本來源 收集2019年1月-2020年12月于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的128例確診為卵巢癌患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析。128例卵巢癌患者中，鉑類藥物耐藥患者69例設(shè)為耐藥組，鉑類藥物敏感患者59例設(shè)為敏感組。納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2019年版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為卵巢癌患者[6];均行腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)或根治術(shù)后接受以鉑類為基礎(chǔ)的化療輔助治療?；颊唔樸K耐藥性判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)療效情況評價，殘留病灶消失并持續(xù)1年以上為完全緩解;殘留病灶縮小30%并維持1個月以上為部分緩解;殘留病灶縮小<30%為穩(wěn)定;殘留病灶體積增加>25%或者有新增則為進(jìn)展[7]，完全緩解+部分緩解+穩(wěn)定視為順鉑敏感，進(jìn)展則視為順鉑耐藥;資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：有既往惡性腫瘤史，術(shù)前行化療輔助治療。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 PCR試劑盒[Takara（寶）生物股份有限公司，批號AK8606]，LncRNA引物[生工生物工程（上海）股份有限公司合成]，細(xì)胞程序性死亡-配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）（Abcam公司，批號BGPTQC71P66），免疫組織化學(xué)法檢測試劑盒（上海羽朵生物科技有限公司，批號YDJ4123）。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR檢測LncRNA的表達(dá) 根據(jù)文獻(xiàn)檢索結(jié)果，本研究主要針對兩個LncRNA分子，即生長阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5（GAS5）和HOXC基因座轉(zhuǎn)錄因子（HOTAIR）進(jìn)行分析;GAS5基因引物序列，上游：CTTGCCTGGACCAGCTTAAT，下游：CAAGCCGACTCTCCATACCT;HOTAIR基因引物序列，上游：GGGGCTTCCTTGCTCTTCTTATC，下游：GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC。PCR在條件95 ℃ 15 s、51 ℃ 15 s、72 ℃ 45 s擴(kuò)增40循環(huán)。

1.2.2 采用免疫組化學(xué)法檢測PD-L1表達(dá)水平 制作組織連續(xù)切片，切片厚度約為4 mm，石蠟包埋，0.1 mL檸檬酸鹽121 ℃環(huán)境下沖洗10 min，3%過氧化氫孵育5 min，0.5%山羊血阻斷60 min，在4 ℃環(huán)境下將切片與PD-L1孵育過夜，再用蘇木素重復(fù)染色，免疫組化試劑盒檢測。

1.2.3 體外藥物敏感實驗 采用噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測。將腫瘤組織研磨至分散，在無菌環(huán)境下，0.9%生理鹽水漂洗2次，剪碎，加入0.25%胰蛋白消化酶。200目細(xì)胞篩制成單細(xì)胞混懸液，臺盼藍(lán)染色，加入順鉑（生產(chǎn)廠家：齊魯制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H37021358，規(guī)格：10 mg）20 μg/mL，震蕩搖勻，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。介入5 mg/mL的四甲基偶氮唑鹽（MTT）20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)3～24 h，顯微鏡下觀察MTT被還原成藍(lán)色結(jié)晶結(jié)束培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)液1 000 r/min離心10 min，去上層清液，采用酶標(biāo)儀測吸光度，并計算腫瘤細(xì)胞平均抑制率。

1.3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn) （1）采用2-ΔΔCt公式計算GAS5和HOTAIR基因的相對表達(dá)量，其中-ΔΔCt=ΔCt（標(biāo)準(zhǔn)基因）-ΔCt（目標(biāo)基因），Ct為循環(huán)閾值。（2）PD-L1陽性染色強(qiáng)度評分：0分為無染色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕色;陽性率評分：在顯微鏡下隨機(jī)選取10個視野，每個視野中100個細(xì)胞計數(shù)，1分為陽性率少于25%，2分為25%～50%，3分為>50%且≤75%，4分為>75%;染色強(qiáng)度評分與陽性率評分的乘積結(jié)果為PD-L1的表達(dá)強(qiáng)度評分。（3）采用Pearson相關(guān)性分析法分析PD-L1表達(dá)水平和GAS5、HOTAIR表達(dá)水平的相關(guān)性，PD-L1、GAS5、HOTAIR表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞平均抑制率相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料用率（%）表示，組間比較采用字2檢驗，logistic回歸分析，Pearson相關(guān)性分析法分析相關(guān)性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌化療耐藥性單因素分析 兩組FIGO分期、殘留病灶大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、GAS5、HOTAIR和PD-L1的表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且耐藥組GAS5、HOTAIR和PD-L1的表達(dá)水平均高于敏感組（P<0.05）。見表1。

2.2 卵巢癌化療耐藥性危險因素logistic回歸分析 FIGO分期、殘留病灶大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和GAS5、HOTAIR及PD-L1表達(dá)水平納入多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示：GAS5、HOTAIR及PD-L1表達(dá)水平均為卵巢癌患者化療耐藥性獨(dú)立危險因素（P<0.05），見表2。

2.3 PD-L1表達(dá)水平和GAS5、HOTAIR表達(dá)水平的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PD-L1表達(dá)水平和GAS5、HOTAIR表達(dá)水平均呈顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.460、0.294，P=0.000、0.001）。

2.4 PD-L1、GAS5、HOTAIR表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞平均抑制率相關(guān)性分析 腫瘤細(xì)胞平均抑制率為（36.63±6.53）%，與PD-L1、GAS5、HOTAIR表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.371、-0.412、-0.287，P=0.000、0.000、0.001）。

3 討論

相關(guān)研究表明，非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）包括miRNA、siRNA、piRNA和LncRNA，均可在卵巢癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移以及化療耐藥性發(fā)展中作為基因表達(dá)重要的調(diào)控因子，其起著重要的作用[8]。其中的LncRNA已被證實參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡與轉(zhuǎn)移等多個過程，與卵巢癌的發(fā)展存在相當(dāng)密切的關(guān)系[9-11]。LncRNA根據(jù)不同的作用機(jī)制分別參與卵巢癌組織細(xì)胞的敏感性以及耐藥性。目前已發(fā)現(xiàn)越來越多的與化療耐藥性相關(guān)的LncRNA分子，如LncRNA EBIC、lncRNA HOTAIR等[12]。本研究中根據(jù)文獻(xiàn)[2]檢索，選取兩個LncRNA分子：GAS5和HOTAIR作為分析對象，對LncRNA與耐藥性的關(guān)系進(jìn)行分析。本研究結(jié)果顯示，耐藥性卵巢癌組織細(xì)胞GAS5和HOTAIR基因表達(dá)水平高于化療敏感性卵巢癌組織細(xì)胞，logistic多因素回歸分析結(jié)果顯示，GAS5和HOTAIR基因均為卵巢癌細(xì)胞耐藥性獨(dú)立危險因素，且二者均對耐藥性具有一定的診斷效能。GAS5定位于細(xì)胞質(zhì)中，其在卵巢癌細(xì)胞耐藥中發(fā)揮作用的機(jī)制可能為GAS5的高表達(dá)，通過對p53信號通路和MAPK信號通路的調(diào)節(jié)而調(diào)節(jié)卵巢癌耐藥性。HOTAIR基因作為LncRNA的一員，長度為2 158 nt，在各種惡性腫瘤如卵巢癌、肝癌等均表達(dá)上調(diào)。研究表明，HOTAIR基因的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、耐藥以及復(fù)發(fā)具有相關(guān)性[13]。HOTAIR表達(dá)水平與p21mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而p21的功能喪失可介導(dǎo)耐藥性，同時HOTAIR可通過調(diào)節(jié)p53信號通道來調(diào)節(jié)耐藥性。

腫瘤免疫治療中PD-1是一種免疫共抑制分子，主要在活化的CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、CD4+細(xì)胞上[14]。PD-L1是PD-1的受體，有研究顯示其在胃癌、腸癌、肝癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤組織細(xì)胞中均呈高表達(dá)[15]。有報道顯示，PD-L1通過抑制CD8+T淋巴細(xì)胞參與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制，此可能與腫瘤細(xì)胞耐藥性有關(guān)[15-17]。本研究結(jié)果顯示，耐藥性耐藥性卵巢癌組織細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平明顯高于化療敏感腫瘤細(xì)胞，logistic多因素回歸分析結(jié)果顯示PD-L1為卵巢癌細(xì)胞耐藥性獨(dú)立危險因素，且對耐藥性具有一定的診斷效能;表明PD-L1參與卵巢癌細(xì)胞耐藥性上調(diào)機(jī)制。

本研究中Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PD-L1表達(dá)水平和GAS5、HOTAIR表達(dá)水平均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，腫瘤細(xì)胞平均抑制率與PD-L1、GAS5、HOTAIR表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)。有研究表明，LncRNA與PD-L1之間存在著非常緊密的關(guān)系[18]，如LncRNA HOTTIP和LncRNA EMX2OS等與PD-L1呈正相關(guān)，其可通過向上調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)而抑制機(jī)體免疫答應(yīng)，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的免疫逃逸。由此可見，LncRNA參與化療耐藥性相關(guān)基因與PD-L1有協(xié)調(diào)促進(jìn)作用，相互協(xié)同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)展及耐藥性的產(chǎn)生。

綜上所述，卵巢癌組織中LncRNA中的GAS5、HOTAIR分子與PD-L1的高表達(dá)與卵巢癌患者化療耐藥性密切相關(guān)，均可作為卵巢癌化療耐藥性預(yù)測指標(biāo)，聯(lián)合檢測具有一定的診斷效能。但是LncRNA種類繁多、功能復(fù)雜，各類LncRNA在腫瘤中的作用機(jī)制還需更多的實驗研究以及臨床試驗驗證探討。

參考文獻(xiàn)

[1]王根生，王悅.卵巢癌微環(huán)境與化療耐藥發(fā)生相關(guān)的研究進(jìn)展[J].腫瘤，2020，40（1）：68-75.

[2]潘忠勉，譚芳春，陳昌賢，等.卵巢上皮性癌耐藥相關(guān)ceRNA的生物信息學(xué)分析及臨床驗證[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2021，56（2）：121-130.

[3] ABIKO K，MATSUMURA N，HAMANISHI J，et al.IFN-γ from lymphocytes induces PD-L1 expression and promotes progression of ovarian cancer[J].Br J Cancer，2015，112（9）：1501-1509.

[4] SHANG A，WANG W，GU C，et al.Long non-coding RNA HOTTIP enhances IL-6 expression to potentiate immune escape of ovarian cancer cells by upregulating the expression of PD-L1 in neutrophils[J].J Exp Clin Cancer Res，2019，38（1）：411.

[5] DUAN M，F(xiàn)ANG M，WANG C，et al.LncRNA EMX2OS Induces Proliferation， Invasion and Sphere Formation of Ovarian Cancer Cells via Regulating the miR-654-3p/AKT3/PD-L1 Axis[J].Cancer Manag Res，2020，12：2141-2154.

[6]中國抗癌協(xié)會乳腺癌專業(yè)委員會.中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2019年版）[J].中國癌癥雜志，2019，29（8）：609-680.

[7]王少文，蔡建輝，聞?wù)渍?腫瘤科微創(chuàng)學(xué)[M].上海：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2011：98-101.

[8] LIU J，MATULONIS U A.New strategies in ovarian cancer： translating the molecular complexity of ovarian cancer into treatment advances[J].Clin Cancer Res，2014，20（20）：5150-5156.

[9] REN C，LI X，WANG T，et al.Functions and Mechanisms of Long Noncoding RNAs in Ovarian Cancer[J].Int J Gynecol Cancer，2015，25（4）：566-569.

[10] ZHENG Y，LIU L，SHUKLA G C.A comprehensive review of web-based non-coding RNA resources for cancer research[J].Cancer Lett，2017，407：1-8.

[11] NALLASAMY P，CHAVA S，VERMA S S，et al.PD-L1， inflammation， non-coding RNAs， and neuroblastoma： Immuno-oncology perspective[J].Semin Cancer Biol，2018，52：53-65.

[12]張春蘭，賀紅英，韋露薇，等.LncRNAs在卵巢癌診斷和預(yù)后評估研究中的進(jìn)展[J].中國腫瘤，2019，28（11）：852-860.

[13] WU Z H，WANG X L，TANG H M，et al.Long non-coding RNA HOTAIR is a powerful predictor of metastasis and poor prognosis and is associated with epithelial-mesenchymal transition in colon cancer[J].Oncol Rep，2014，32（1）：395-402.

[14]陳夢婕，錢素英.PD-1/PD-L1抑制劑在淋巴瘤治療中的研究進(jìn)展[J].中國腫瘤臨床，2018，45（10）：535-538.

[15]馬琳，偉忠民.秦皮甲素通過調(diào)控程序性死亡配體-1逆轉(zhuǎn)人肺癌細(xì)胞順鉑耐藥性[J].華中科技大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2018，47（4）：394-399，404.

[16]糜亞琴，蔣敬庭，吳昌平.PD-L1/PD-1在卵巢癌中的表達(dá)機(jī)制及免疫治療研究進(jìn)展[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2017，22（2）：180-183.

[17] TAUBE J M，YOUNG G D，MCMILLER T L，et al.Differential Expression of Immune-Regulatory Genes Associated with PD-L1 Display in Melanoma： Implications for PD-1 Pathway Blockade[J].Clin Cancer Res，2015，21（17）：3969-3976.

[18] CHEN J，WANG R，ZHANG K，et al.Long non-coding RNAs in non-small cell lung cancer as biomarkers and therapeutic targets[J].J Cell Mol Med，2014，18（12）：2425-2436.

（收稿日期：2021-07-27） （本文編輯：占匯娟）