楊天睿，葉 堃，苗云波，段靳嵐，楊起江，張思思

(1.云南省第一人民醫(yī)院 老年病科，云南 昆明 650032； 2.昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032；3.昆明理工大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500)

0 引 言

據(jù)國家心血管病中心發(fā)布的《中國心血管病報(bào)告2019》數(shù)據(jù)顯示，我國心血管病現(xiàn)患病人數(shù)為2.9億，每年我國約有350萬人死于心血管病，占總死亡病因的41%，居各種疾病之首.1990-2017年，中國人群缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)疾病負(fù)擔(dān)及其危險(xiǎn)因素的變化趨勢(shì)分析中顯示，IHD 傷殘調(diào)整壽命年(DALY)率由1990年 1 116.4/10萬增至2017年 2 131.0/10萬，增長率為90.9%；且≥70歲人群傷殘壽命損失年(YLD)率的2007-2017年均增長率(0.4%)高于1990-2007年均增長率(0.2%)，證明了雖然IHD所致的過早死亡得到了有效控制，但其所致傷殘負(fù)擔(dān)增大，成為疾病負(fù)擔(dān)的主要來源[1].目前針對(duì)缺血性心臟病主要治療手段包括冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入、藥物等，治療機(jī)制均是通過快速恢復(fù)心肌血流灌注，從而減輕心肌損傷甚至心肌壞死.然而，在心肌缺血恢復(fù)的同時(shí)，即可激發(fā)因再灌注導(dǎo)致細(xì)胞功能受損，即缺血再灌注損傷(Ischemia Reperfusion Injury, I/R)[2].已有研究表明[3]，在心肌細(xì)胞發(fā)生缺血再灌注損傷后常伴隨著細(xì)胞凋亡的增加，但尚缺乏從絲裂原活化蛋白激酶通路(Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等方面入手，分析其在細(xì)胞凋亡與心肌缺血再灌注損傷過程中的病理生理機(jī)制.

為此，本研究關(guān)注于心肌缺血再灌注后細(xì)胞凋亡率及其包括凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2), Bax蛋白，磷酸化的P38蛋白，磷酸化應(yīng)激活化蛋白激酶-1(p-c-Jun N-terminal kinase-1，P-JNK-1), 磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-extracellular regulated protein kinases，P-ERK)，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78kD，GRP78), 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白，即C/EBP同源蛋白(C/EBP-Homologous Protein，CHOP)在內(nèi)的蛋白表達(dá)水平的變化.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雄性實(shí)驗(yàn)樹鼩滇西亞種40只，4～6月齡，體重120～150 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心提供，合格證 SCXK(滇)K2015-0002.本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過，編號(hào)(2017)倫審【科】第(025)號(hào).

1.2 試劑及主要儀器

全蛋白提取試劑盒(Wanleibio)，TUNNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，TUNNEL檢測(cè)液，Western洗滌液(wanleibio)，PVDF膜(Millipore)，Anti-Bcl-2抗體[E17](Abcam)，Anti-Bax抗體[E63](Abcam)，Anti-CHOP抗體[9C8](Abcam)，Anti-GRP78 BiP抗體(Abcam)，Anti-ERK1抗體[Y72](Abcam)，Anti-ERK1 (phospho Y204)抗體(Abcam)，Anti-JNK1抗體[EPR140(2)](Abcam)，Anti-p38抗體[E229](Abcam)，山羊Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)(Abcam)，Anti-beta Actin抗體[mAbcam 8226](Abcam).PowerLab型Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)，DYY-7C型電泳儀，DYCZ-24DN型雙垂直蛋白電泳儀，WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)，石蠟切片機(jī)，熒光顯微鏡.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

健康成年雄性實(shí)驗(yàn)樹鼩滇西亞種40只，隨機(jī)分為持續(xù)灌注對(duì)照組(一組)、缺血模型組(二組)、缺血再灌注模型組(三組)，共3組，保證每組試驗(yàn)成功10只.建模方法和標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[4]，用3.6%的水合氯醛腹腔麻醉給藥(1 mL/只)，經(jīng)腹腔肝素化(普通肝素 1 000 U/只)抗凝.迅速開胸將心臟分離，并移至Langendorff灌注裝置上，逆行插管主動(dòng)脈，用K-H液恒溫(37 ℃)恒壓(60 mmHg,1 mm Hg=0.133 kPa)穩(wěn)定灌注，保證冠狀動(dòng)脈回流通暢，冠脈流量為6～12 mL/min.待灌注系統(tǒng)穩(wěn)定后，空白對(duì)照組持續(xù)灌注 60 min，缺血組持續(xù)灌注 30 min 后停灌 30 min，缺血再灌注組穩(wěn)定灌注后停灌 30 min，再灌注 30 min.

1.4 標(biāo)本采集

待灌注結(jié)束，立即取下心臟，沖去血漬，用濾紙吸干水分，將心臟置于 -20 ℃ 冷凍 2 h 后，沿心臟冠狀面以 2 mm 間隔切出6片心肌，之后將心室肌組織分割成 0.2 g 大小的組織塊.

1.5 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)

按試劑盒說明書操作(每張切片上，隨機(jī)抽取凋亡的細(xì)胞核高倍視野必須達(dá)5個(gè)以上，并且心肌細(xì)胞核數(shù)不得少于200個(gè)).

凋亡指數(shù)(Apoptotic Index)=陽性細(xì)胞/(陽性細(xì)胞+陰性細(xì)胞)×100%

通過切片包埋，切片脫蠟到水，染色，抗熒光淬滅后封片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察(波長為 570 nm，紅色熒光)，于200×鏡下拍照并計(jì)數(shù)凋亡率.

1.6 Western-blot法檢測(cè)

將心室肌組織塊放入 5 mL 的小燒杯中，與預(yù)冷的勻漿介質(zhì)1∶9配比，剪碎后倒入玻璃勻漿器中研磨成10%的心肌均漿，按照蛋白提取試劑盒說明書提取樹鼩心肌組織蛋白，利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，完成樣品蛋白濃度測(cè)定.以 20 μL/孔上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后迅速將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，封閉后的PVDF膜用TBST 漂洗5 次后，分別加入稀釋一抗和二抗 ( TBST 1∶5 000 稀釋)，室溫孵育及漂洗后將ECL化學(xué)發(fā)光試劑A、B等體積混合，凝膠成像儀下顯影成像.用Image J圖象處理軟件分析目的條帶，以目的條帶與β-actin條帶之比進(jìn)行半定量分析.

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.符合正態(tài)分布的計(jì)量資料表示以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用單因素方差分析方法比較各組間的計(jì)量資料；多重比較使用方差齊性時(shí)采用LSD方法，方差不齊時(shí)采用Dunnett-t檢驗(yàn)分析方法，以P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

表1 凋亡率比較(x±s)

圖1 凋亡率比較Fig.1 Comparison of apoptosis rate

2 結(jié) 果

2.1 Tunnel凋亡率組間比較

由表1及圖1可見，Tunnel凋亡率兩兩比較發(fā)現(xiàn)缺血模型組顯著高于對(duì)照組，再灌注模型組顯著高于對(duì)照組、缺血模型組,且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即再灌注模型組呈現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞，tunel染色呈陽性，而缺血模型組次之，對(duì)照組發(fā)生凋亡的細(xì)胞則最少.

2.2 凋亡蛋白 Bcl-2與BAX組間表達(dá)量比較

由表2及圖2可知，凋亡蛋白BCL-2蛋白表達(dá)量:空白對(duì)照組>缺血模型組>再灌注模型組；Bax蛋白表達(dá)量:空白對(duì)照組<缺血模型組<再灌注模型組；再灌注模型組Bcl-2/Bax比值下降明顯.

表2 Bcl-2與Bax表達(dá)量比較(x±s, n=10)

圖2 Bcl-2與Bax表達(dá)量比較Fig.2 Comparison of expression in Bcl-2 and Bax

2.3 P38、JNK-1、ERK組間表達(dá)量比較

圖3 P38、JNK-1、ERK表達(dá)量比較Fig.3 Comparison of expression in Lin P38, JNK-1, ERK

由表3可知，心肌組織P38、JNK-1、ERK磷酸化水平兩兩比較，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注模型組顯著高于缺血模型組，缺血模型組顯著高于空白對(duì)照組.由圖3可知，從空白對(duì)照組、缺血模型組至缺血再灌注模型組，磷酸化P38、JNK-1、ERK蛋白量均呈現(xiàn)逐漸增高表達(dá)趨勢(shì).

表3 心肌組織P38、JNK、ERK表達(dá)量比較(x±s)

圖4 GRP78、CHOP-1表達(dá)量比較Fig.4 Comparison of expression in GRP78 and CHOP-1

2.4 GRP78、CHOP-1組間表達(dá)量比較

由表4及圖4可見，心肌組織GRP78、CHOP-1表達(dá)量水平：空白對(duì)照組<缺血模型組<缺血再灌注模型組，且各組GRP78、CHOP-1蛋白量表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增高趨勢(shì).

表4 心肌組織GRP78、CHOP-1表達(dá)量比較(x±s)

3 討 論

本研究采用動(dòng)物離體心臟模型模擬缺血再灌注損傷過程，挖掘心肌缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制.細(xì)胞凋亡是通過激活信號(hào)通路，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)死亡蛋白系統(tǒng)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序化死亡.研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡參與了缺血再灌注損傷過程始終，并受多種基因調(diào)控，與Bcl-2家族密切相關(guān)[5].研究證實(shí)[6-7]，Bcl-2/Bax比值直接影響著細(xì)胞存亡，Bcl-2/Bax值增加，細(xì)胞趨于存活；比值下降，細(xì)胞趨于凋亡.當(dāng)心肌缺血再灌注發(fā)生時(shí)，Bax基因表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2基因表達(dá)顯著下調(diào).MAPK家族是細(xì)胞內(nèi)重要的信息傳遞系統(tǒng)，正常情況下這類激酶分布于細(xì)胞質(zhì)中，以弱活化狀態(tài)或靜止?fàn)顟B(tài)存在，當(dāng)細(xì)胞受到刺激，該系統(tǒng)往往被激活，通過磷酸化作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游分子底物的生物學(xué)活性，介導(dǎo)包括細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞的病理生理過程[8].當(dāng)細(xì)胞處于缺血再灌注損傷狀態(tài)，MAPK應(yīng)急信號(hào)通路p38信號(hào)途徑迅速啟動(dòng)，增強(qiáng)了胞質(zhì)蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化水平，加重細(xì)胞凋亡.JNK作為MAPK家族的重要信號(hào)通路，在I/R損傷發(fā)生時(shí)，其通過介導(dǎo)線粒體釋放促凋亡因子，直接促進(jìn)Bcl-2高表達(dá)，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子大量表達(dá)[9-10]，與細(xì)胞調(diào)亡有著密切聯(lián)系.大量研究表明[11]，ERK信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理功能，雖然不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，ERK作用可能存在差異，但ERK對(duì)細(xì)胞存活或損傷發(fā)揮著重要作用.ERK往往在心損早期參與啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，而在長時(shí)間I/R過程中，其作用則為介導(dǎo)細(xì)胞損傷[12].內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic Reticulum Stress，ERS)發(fā)生時(shí)[13]，應(yīng)激性蛋白分泌增加，激活促凋亡編碼基因，其中GRP78蛋白作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白，在維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)中扮演著重要角色[14].當(dāng)細(xì)胞受到缺氧、缺血等有害刺激時(shí)，GRP78蛋白則大量表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上尚未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的積累，維持鈣離子平衡，保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，盡可能延長處于有害要素刺激下的細(xì)胞存活期[15].GRP78下游的信號(hào)分子CHOP是增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白，為特異性轉(zhuǎn)錄因子，其作用機(jī)制主要是啟動(dòng)胱天蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而參與到細(xì)胞凋亡過程中[16].

本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組及缺血模型組相比較，缺血再灌注模型組細(xì)胞凋亡率明顯升高，再灌注模型組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著下調(diào)，Bax表達(dá)量明顯增加，其Bcl-2/Bax比值下降，細(xì)胞趨于凋亡，以上結(jié)果與之前研究相一致，再次證明了細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié).在缺血再灌注模型組中磷酸化P38、JNK、ERK蛋白表達(dá)量均顯著增加，激活了MAPK家族信號(hào)通路系統(tǒng)，將信息傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.GRP78、CHOP-1蛋白表達(dá)量顯著增高，可能啟動(dòng)了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，削弱了細(xì)胞的自我保護(hù)作用，加重了細(xì)胞凋亡.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)在心肌缺血再灌注損傷發(fā)生及其發(fā)展過程中，細(xì)胞通過啟動(dòng)MAPK信號(hào)通路、激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激系統(tǒng)，調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)，加速細(xì)胞凋亡.

但本研究也存在一定的局限性，樣本量相對(duì)較小，尚缺乏臨床研究數(shù)據(jù)等.細(xì)胞凋亡貫穿于缺血再灌注損傷過程中，但因其涉及諸多環(huán)節(jié)，并存在交互作用，要從機(jī)制根源阻止損害發(fā)生，今后的工作將任重而道遠(yuǎn).

4 結(jié) 論

本研究運(yùn)用離體心肌缺血再灌注模型，避免神經(jīng)體液因素的干擾，直接顯現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷過程，首次以實(shí)驗(yàn)樹鼩作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在生物醫(yī)藥研究方面具有重要價(jià)值.細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷機(jī)制中關(guān)鍵環(huán)節(jié)，MAPK家族是細(xì)胞內(nèi)的重要信息傳遞系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注損傷中心肌細(xì)胞通過活化P38 MAPK信號(hào)通路表達(dá)，激活JNK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)ERK信號(hào)通路水平，引起細(xì)胞凋亡.細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙是心肌缺血再灌注損傷的重要原因，研究證實(shí)缺血再灌注損傷活化了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78和特異性促凋亡分子CHOP，心肌細(xì)胞出現(xiàn)過度的ERS，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失調(diào)，加重線粒體損傷.該研究將細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞器功能損害有機(jī)聯(lián)系起來，展現(xiàn)了一系列細(xì)胞效應(yīng)過程，深入挖掘心肌缺血再灌注損傷機(jī)制，為下一步的干預(yù)研究奠定基礎(chǔ).