王志剛，徐耀端，丁向前，王 為，敬 聰，耿 鑫，李經(jīng)輝，余化霖

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)外二科，云南 昆明 650032； 2.云南省紅河州腫瘤醫(yī)院 神經(jīng)外科，云南 個舊 661000；3.紅河州第三人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，云南 個舊 661000)

0 引 言

脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)是脊柱損傷嚴(yán)重的并發(fā)癥，損傷破壞脊髓上下行傳導(dǎo)束，導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下肢體的運(yùn)動、感覺及自主神經(jīng)功能障礙，甚至危及生命[1-2]，具有高患病率、高致殘率等特性[3]，臨床治療效果差，給家庭及社會帶來極為繁重的經(jīng)濟(jì)和心理壓力[4-5].如何有效改善SCI后脊髓神經(jīng)再生修復(fù)及功能恢復(fù)是一項(xiàng)挑戰(zhàn).細(xì)胞重新編程技術(shù)是一門生物學(xué)新技術(shù)，利用該技術(shù)將體細(xì)胞重新編程為誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞，再分化為所需要的細(xì)胞類型[6].研究發(fā)現(xiàn)一些成熟的體細(xì)胞，導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子并使其表達(dá)，能將其定向轉(zhuǎn)換成需要的細(xì)胞[7-8].如成年小鼠的胰腺分泌細(xì)胞在體內(nèi)通過導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)換成胰島β細(xì)胞[9].在損傷的小鼠心臟中成心肌細(xì)胞通過轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)換成心肌細(xì)胞[10].星形膠質(zhì)細(xì)胞廣泛分布于脊髓組織中.其中脊髓損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生形成膠質(zhì)瘢痕，可維持周圍細(xì)胞的完整性，然而膠質(zhì)瘢痕的持續(xù)存在不利于脊髓損傷后功能的恢復(fù)[11]，有趣的是星形膠質(zhì)細(xì)胞不管是在大腦中還是在體外是經(jīng)得起重新編程這個重任的[12].研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)外可以重新轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)干細(xì)胞[12-13].Su Z等[14]通過一些神經(jīng)源性因子能促使反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)為神經(jīng)元.目前參與細(xì)胞重編程轉(zhuǎn)錄因子常用的有OCT3/4、SOX2、KLF4 和 MYC[15],其中SOX2是脊髓中的一個關(guān)鍵的重新編程因素[16].慢病毒經(jīng)常作為基因貨物的信使[17]，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞是慢病毒靶向的細(xì)胞之一[14].雙皮質(zhì)素(Doublecortin,DCX)廣泛表達(dá)于神經(jīng)干細(xì)胞及未成熟神經(jīng)元.丙戊酸(Valproic Acid,VPA)是一種組蛋白脫乙酰激酶抑制劑，能提高胞內(nèi)基因重組編程，并能夠加速神經(jīng)元的形成，促使誘導(dǎo)的未成熟神經(jīng)元成熟[14].

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用急性鉗夾型大鼠脊髓損傷模型，通過慢病毒介導(dǎo)SOX2轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染大鼠脊髓損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞，探討其能否促進(jìn)成DCX-陽性的神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)元的增殖，通過 BBB評分、病理學(xué)檢查、免疫組化、免疫印跡等監(jiān)測分析其對脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)系，從而為臨床治療SCI提供潛在的治療手段.

1 材料和方法

1.1 動物來源

成年雄性SD大鼠60只，體重240g左右，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心供給.隨機(jī)分為:(1) Sham組(假手術(shù)組,n=12)；(2) SCI組(脊髓損傷組，n=12)；(3) SOX2-NC組(脊髓損傷+慢病毒組，n=12)；(4) SOX2-OE組(脊髓損傷+過表達(dá)SOX2慢病毒組，n=12)；(5) SOX2-OE+VPA組(脊髓損傷+過表達(dá)SOX2慢病毒+丙戊酸組，n=12).

1.2 試劑及儀器

用到的試劑及儀器有：動脈瘤夾(德國Rebstock公司，夾合力 70 g)，動脈瘤夾持夾器(德國Rebstock公司)，OCT(美國SAKURA公司)，正置白光拍照顯微鏡(Nikon，Japan)，Western Blot電泳儀(BIO-R)，Western Blot轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD)，PCR用試劑primer(生工生物工程上海有限公司)，移液槍(德國Dragon)，微量注射泵(上海高鴿工貿(mào)有限公司)，腦立體定位儀、磨鉆(深圳沃瑞德科技有限公司).

1.3 過表達(dá)SOX2慢病毒制備

選用載體PGMLV-6751，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增片段引物，并在引物5’端引入線性化克隆載體末端的同源序列，使得擴(kuò)增產(chǎn)物5’和3’最末端序列分別和線性化克隆載體兩末端序列完全一致，將設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行合成.將含有載體的質(zhì)粒的菌液進(jìn)行過夜培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒提取，取 1 μg 新鮮質(zhì)粒用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，多次離心得到載體片段；將目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，將過表達(dá)載體與目的基因的無縫連接，將其進(jìn)行轉(zhuǎn)化并測定；經(jīng)Western Blot驗(yàn)證，構(gòu)建成功的過表達(dá)載體有較好的過表達(dá)效果.

1.4 動作模型制作及慢病毒的注射

麻醉充分，備皮，固定，消毒,鋪巾.以T10節(jié)段為中心，切口約 3.0 cm.切開組織，夾起T10棘突，剪除椎板，露出脊髓；醫(yī)用動脈瘤夾鉗夾脊髓，Sham組按照上述方式只剪除T10椎板.參照文獻(xiàn)[18-19]報道的鉗夾型急性大鼠脊髓損傷模型的建立與評價.

SOX2-NC組(立體定向儀引導(dǎo)下，使用注射微量泵注射 2 μL 慢病毒在損傷處上下兩端約 1.5 mm，距中線 0.5 mm 處，深度 2 μm，注射 1 min，停頓 3 min，緩緩?fù)酸?SOX2-OE組和SOX2-OE+VPA組(同一位置注射 2 μL 過表達(dá)SOX2慢病毒).Sham和SCI組(同一位置注入 2 μL 0.9%氯化鈉)，術(shù)后SOX2-OE+VPA組腹腔連續(xù)給與丙戊酸(100 mg/kg,2次/天)4 w，其余組給與相同劑量0.9%氯化鈉.

1.5 BBB運(yùn)動評分和Rivlin實(shí)驗(yàn)評價各組的運(yùn)動恢復(fù)

在各時間觀察點(diǎn)(1、3、7、14、21、28 d)對各組行BBB評分和Rivlin實(shí)驗(yàn)，評價運(yùn)動恢復(fù)狀況.各組隨機(jī)抽10只，由2名人員按照BBB運(yùn)動評分和Rivlin實(shí)驗(yàn)分別獨(dú)自評分3次，取平均值.

1.6 HE染色觀察各組SCI的結(jié)構(gòu)變化

4 w 后進(jìn)行灌注取材，用10%水合氯醛麻醉充分后固定，暴露心臟，從心尖進(jìn)針至主動脈，打開右心耳.先用0.9%氯化鈉灌注，再用多聚甲醛灌注.剪除椎板，保留距損傷處上下各約 2 cm 脊髓.多聚甲醛固定過夜，梯度脫水.行蘇木精-伊紅染色(HE染色)：漂洗，處理脊髓，蘇木精浸泡，沖洗，伊紅染色，清洗，脫水，透明，封固，觀測脊髓結(jié)構(gòu)形態(tài)改變.其余切片自然干燥，-20 ℃ 保存.

1.7 甲苯胺藍(lán)染色尼氏小體變化

復(fù)溫，漂洗，水平衡，染液，洗去，分色，脫水，透明，封固，觀測尼氏小體數(shù)量、形態(tài)、染色深度，對陽性面積結(jié)果進(jìn)行分析.

1.8 免疫組化檢測SOX2轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、增殖神經(jīng)元數(shù)量

脫蠟、水化，修復(fù)，阻斷，血清封閉，加入一抗、二抗，DBA，復(fù)染細(xì)胞核，封片，觀測.

1.9 Western Blot免疫印跡檢測SOX2轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及DCX細(xì)胞含量

提取蛋白，4 ℃ 離心，標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋為不同濃度，37 ℃ 水浴 30 min，取出膠板加入電泳液準(zhǔn)備上樣，以 250 mA 轉(zhuǎn)膜 1 h，封閉 1 h，抗體孵育，洗脫3次×10 min，顯影.

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 評價脊髓損傷模型

術(shù)后所有大鼠均出現(xiàn)運(yùn)動喪失和尿潴留，死亡3只，其原因有麻醉過深、肺部感染、膀胱破裂，其中SCI組死亡1只，SOX2-OE組死亡1只，SOX2-OE+VPA組死亡1只，用相同體重雄性SD大鼠替換.

2.2 過表達(dá)SOX2對大鼠SCI運(yùn)動恢復(fù)評價

術(shù)后對各組在時間觀察點(diǎn)(1，3，7，14，21，28 d)行BBB評分和Rivlin實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如表1、圖1所示.術(shù)后各組BBB評分和Rivlin實(shí)驗(yàn)評分都有所降低，但隨著時間發(fā)展評分逐漸上升，在各時間觀察點(diǎn)其他組評分都低于Sham組；SOX2-OE組與SCI組相比，SOX2-OE組中大鼠的BBB和Rivlin實(shí)驗(yàn)評分明顯比SCI組高(P<0.05)，其中SOX2-OE+VPA組與SOX2-OE組相比，SOX2-OE+VPA組中大鼠的BBB和Rivlin實(shí)驗(yàn)評分明顯比SOX2-OE組高(P<0.05)，然而SOX2組與SCI-NC組相比，SCI組及SCI-NC組無明顯區(qū)別(P<0.05).

表1 各組大鼠SCI后 BBB 評分比較

表2 各組大鼠脊髓損傷后Rivlin斜板實(shí)驗(yàn)評分比較

注*：SOX2-OE組與SCI組相比，P<0.05，n=8。#：SCI組與SOX2-NC組相比，P>0.05，n=8。&：與SOX2-OE組相比，P<0.05，n=8。圖1 SOX2對大鼠SCI后BBB運(yùn)動功能評分Fig.1 SOX2 on the BBB motor function score in rats after SCI

*：SOX2-OE組與SCI組相比，P<0.05，n=8.#：SCI組與SOX2-NC組相比，P>0.05，n=8.&：與SOX2-OE組相比，P<0.05，n=8.圖2 SOX2對大鼠SCI后Rivlin實(shí)驗(yàn)評分Fig.2 SOX2 on the Rivlin test score in rats after SCI

2.3 過表達(dá)SOX2對脊髓結(jié)構(gòu)的影響

采用HE染色來說明過表達(dá)SOX2對脊髓結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如圖3和圖4所示.從圖3得出Sham組(圖A)脊髓層次清楚，灰白質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚，SCI組(圖B)、SOX2-NC組(圖C)脊髓組織層次排列混亂，脊髓空洞形成(黑色長箭頭)；SOX2-OE(圖D)和SOX2-OE+VPA組(圖E)脊髓灰白質(zhì)界線尚可區(qū)分，脊髓空洞面積相對較小.圖4中，Sham組(圖A)：脊髓結(jié)構(gòu)清晰，白質(zhì)、灰質(zhì)分界明顯，白質(zhì)神經(jīng)纖維數(shù)量豐富，未見明顯脫髓鞘；灰質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量豐富；SCI組(圖B)、SOX2-NC組(圖C)脊髓組織層次排列混亂，脊髓空洞形成(黑色短箭頭)，明顯脫髓鞘(黑色長箭頭)，灰白質(zhì)界線不清；SOX2-OE組(圖D)、SOX2-OE+VPA組(圖E):脊髓灰白質(zhì)界線尚可區(qū)分，少量脫髓鞘

圖3 術(shù)后 28 d 各組大鼠脊髓HE染色(×40)Fig.3 HE staining of the rat spinal cord in each group 28 days after operation (×40)

圖4 術(shù)后 28 d 各組大鼠脊髓HE染色(×200)Fig.4 HE staining of the rat spinal cord in each group 28 days after operation (×200)

2.5 過表達(dá)SOX2對尼氏(Nissl)小體的影響

采用過表達(dá)SOX2對Nissl小體的影響，結(jié)果如圖5所示，SCI組(圖B)、SOX2-NC組(圖C)、SOX2-OE組(圖D)、SOX2-OE+VPA組(圖 E)中 Nissl小體(短箭頭)少于Sham組(圖 A)，SCI組Nissl小體明顯減少，染色淡，形態(tài)不規(guī)則，部分成顆粒狀.SOX2-OE組中 Nissl小體較SCI組多(P<0.05)，形態(tài)略規(guī)則.SOX2-OE-VPA組中 Nissl小體較SOX2-OE組多(P<0.05)(陽性面積百分比(%)=陽性面積/組織面積*100).

圖5 術(shù)后 4 周各組大鼠脊髓尼氏染色(×400)Fig.5 Nissl staining of rat spinal cord slices in each group 4 weeks after operation (×400)

2.6 過表達(dá)SOX2轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞后促進(jìn)DCX-干細(xì)胞和神經(jīng)元增多

通過免疫組化檢測SOX2轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果圖6所示.SOX2-OE組中轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞(短箭頭)陽性面積百分比較SCI組多(P<0.05)；SOX2-OE-VPA組中轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞(短箭頭)陽性面積百分比較SOX2-OE組多(P<0.05).也通過Brdu檢測增殖神經(jīng)元數(shù)目情況，結(jié)果圖7所示：SOX2-OE組中增殖神經(jīng)元(短箭頭)陽性面積百分較SCI組多(P<0.05)；SOX2-OE-VPA組中增殖神經(jīng)元(短箭頭)陽性面積百分比較SOX2-OE組多(P<0.05)(陽性面積百分比(%)=陽性面積/組織面積*100).

同時，通過Western Blot免疫印跡檢測DCX-神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果圖8所示.SOX2-OE組中轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較SCI組多(P<0.05)；SOX2-OE-VPA組中轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較SOX2-OE組多(P<0.05)；SOX2-OE組中DCX-陽性干細(xì)胞數(shù)量較SCI組多(P<0.05)；SOX2-OE-VPA組中DCX-陽性干細(xì)胞數(shù)量比較SOX2-OE組多(P<0.05).

圖6 術(shù)后4周各組大鼠脊髓SOX2免疫組化染色(×400)Fig.6 SOX2 immunohistochemical staining of spinal cord of rats in each group 4 weeks after operation (×400)

圖7 術(shù)后4周各組大鼠脊髓Brud免疫組化染色(×400)Fig.7 Brud immunohistochemical staining of spinal cord of rats in each group 4 weeks after operation (×400)

圖8 術(shù)后4周各組大鼠脊髓Western Blot免疫印跡結(jié)果檢測SOX2 轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞及DCX-陽性神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)情況Fig.8 The Western Blot results of the spinal cord of each group detected the expression of SOX2 transfected astrocytes and DCX-positive neural stem cells 4 weeks after operation

3 討 論

SCI后除了原發(fā)性損傷外，更為重要的是損傷后缺血、炎癥免疫反應(yīng)、興奮毒性、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的一連串的聯(lián)級反應(yīng)，導(dǎo)致?lián)p傷加重[20-21].其中，星形膠質(zhì)細(xì)胞充當(dāng)著要緊的作用.SCI后反應(yīng)性膠質(zhì)增生，致使脫髓鞘[22]，脫髓鞘也會導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和膠質(zhì)瘢痕形成[23]，而且星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子和興奮性氨基酸，進(jìn)一步導(dǎo)致?lián)p傷加劇[24-25].此外，星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖并遷徙到損傷處，形成膠質(zhì)瘢痕屏障及產(chǎn)生抑制因子，從而影響神經(jīng)元和軸突再生[26].

神經(jīng)元再生是SCI功能恢復(fù)的最理想途徑.目前，SCI研究多以干細(xì)胞為主，并取得喜人效果，但實(shí)際工作卻面臨很大阻力，首先面臨倫理問題、免疫排斥、成瘤風(fēng)險等[27-28]；另外，移植過程中二次損傷[29].細(xì)胞重編程技術(shù)是一項(xiàng)生物學(xué)新技術(shù)，利用該技術(shù)從患者體細(xì)胞中產(chǎn)生所需的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，再分化成所需要的細(xì)胞類型[6].研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)中的多種細(xì)胞已經(jīng)被證明在體內(nèi)是可重新編程的[30]，包含星形膠質(zhì)細(xì)胞、NG2膠質(zhì)細(xì)胞和早期有絲分裂后神經(jīng)元等[31]，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞具有豐富、分布廣泛、神經(jīng)損傷后易轉(zhuǎn)化為不同細(xì)胞等獨(dú)特優(yōu)勢[32]，另外，研究表明星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化不會改變其神經(jīng)元譜系，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的生物學(xué)表型[33].

研究表明體內(nèi)重編程主要是由關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的異位表達(dá)啟動的[34].SOX2是一種高遷移率的DNA結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子，參加胚胎發(fā)生，干細(xì)胞的維持和原始生殖細(xì)胞的增殖，也參與體細(xì)胞重編程為多功能干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞，有關(guān)鍵作用[13-35].引人注意的是，不同轉(zhuǎn)錄因子可以讓星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為不同類型的神經(jīng)元[36].研究發(fā)現(xiàn)SOX2是成人脊髓中的一個關(guān)鍵的重新編程因素[15].而慢病毒可作為基因貨物的信使，它能夠短時間以細(xì)胞特異性的方式傳遞遺傳物質(zhì)，提供了有效的組織轉(zhuǎn)導(dǎo)，不會立即產(chǎn)生免疫反應(yīng)或細(xì)胞毒性[17-37]，星形膠質(zhì)細(xì)胞是慢病毒靶向的細(xì)胞[14].本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒將SOX2注射到SCI局部，4w后取SCI組織以免疫組化及Western Blot免疫印跡觀察DCX-陽神經(jīng)干細(xì)胞和增殖神經(jīng)元，結(jié)果：①SOX2-OE組和SOX2-OE+VPA組的DCX-陽性神經(jīng)干細(xì)胞、增殖神經(jīng)元均多于SCI組(P<0.05)，提示SOX2能使脊髓中星形膠質(zhì)細(xì)胞重新編程，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)元增殖；②SOX2-OE組和SOX2-OE+VPA組脫髓鞘程度均小于SCI組，提示SOX2可減輕脫髓鞘程度.研究發(fā)現(xiàn)防止脫髓鞘不僅對軸突再生至關(guān)重要，而且對OPC在再髓鞘形成過程中變成少突膠質(zhì)細(xì)胞也至關(guān)重要[33]；③SOX2-OE組和SOX2-OE+VPA組的Nissl小體數(shù)量、形態(tài)及染色情況均優(yōu)于SCI組(P<0.05)，當(dāng)神經(jīng)元受損壞時，Nissl小體能產(chǎn)生變化，如Nissl小體消融等，Nissl小體能反映神經(jīng)元損傷[36]；④結(jié)合HE染色發(fā)現(xiàn)SOX2-OE組和SOX2-OE+VPA組脊髓空洞面積均低于SCI組；⑤SOX2-OE組和SOX2-OE+VPA組在各時間觀察點(diǎn)的BBB評分和Rivlin實(shí)驗(yàn)結(jié)果高于SCI組(P<0.05)，提示慢病毒介導(dǎo)SOX2轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染大鼠脊髓損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞可改善SCI大鼠后肢功能.

4 結(jié) 論

通過BBB評分、Rivlin斜板實(shí)驗(yàn)、病理改變、免疫組化、Western Blot免疫印跡觀察大鼠SCI的行為學(xué)、結(jié)構(gòu)、分子水平改變，證實(shí)過表達(dá)SOX2能轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)DCX-陽性神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)元增多，從而改善SCI神經(jīng)功能恢復(fù)情況，為自體細(xì)胞移植提供來源，也使得原位治療SCI成為可能，其具體分子途徑和機(jī)制有待進(jìn)一步研究.