杜麗霞，姜子濤,2*，周烜

(1.天津天獅學(xué)院 食品工程學(xué)院，天津 301700；2.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

草果被人們譽(yù)為食品調(diào)味香料中的“五香之一”，被廣泛應(yīng)用于四川火鍋、麻辣香鍋、鹵制菜品中，起到去腥、增香的作用。草果(Amomumtsaoko)，別名紅草果、草果仁、草果子，是姜科豆蔻屬多年生草本植物，主要分布于中國云南、廣西、貴州等省區(qū)。草果中含有多種活性成分，如揮發(fā)油[1-3]、甾醇類[4]和黃酮類[5-6]等，這些豐富的化學(xué)成分使其具有抗氧化、抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等多種生物活性[7-10]，在食品、藥品、保健品及化妝品等行業(yè)具有良好的應(yīng)用前景。目前，國內(nèi)外對草果的研究主要集中在揮發(fā)油的分離鑒定及揮發(fā)油的抗氧化、抗菌等活性[11-14]，而對其中的多酚類化合物研究較少，多酚類化合物活性的研究更少[15-17]。本文提出了一種未涉及復(fù)雜費(fèi)時的單體分離前提下，對草果提取物中每一個酚類成分抗氧化活性進(jìn)行評價的方法。作者采用乙醇溶液作為提取劑的微波輔助提取法從草果中提取多酚，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了草果多酚的最佳提取條件；采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)鑒定了草果多酚的化學(xué)成分；以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH)為探針，對每一個多酚類化合物的抗氧化活性進(jìn)行了評價，為復(fù)雜混合物中抗氧化劑活性成分的快速篩選開拓了一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草果：云南省保山市，粉粹后過40目篩，密封避光保存；DPPH：美國Sigma-Aldrich公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；D101大孔樹脂：天津南大樹脂科技有限公司，使用前按照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行預(yù)處理；試驗(yàn)用水均為去離子水，所用試劑均為分析純。

LC-15C高效液相色譜儀 島津管理(中國)有限公司；CW-2000超聲-微波協(xié)同萃取/反應(yīng)儀 上海新拓分析儀器科技有限公司；Agilent G6410A LC-MSD QQQ液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；UV1000單光束紫外可見分光光度計 上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 草果多酚的提取方法

精密稱取定量粉碎過篩的草果粉末于超聲-微波協(xié)同萃取儀配套的提取瓶中，加入定量濃度的乙醇溶液，置于超聲-微波協(xié)同萃取儀中，關(guān)閉超聲功能，開啟微波功能，將微波功率調(diào)至400 W，調(diào)好提取溫度和時間后進(jìn)行微波輔助提取，提取完的溶液以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，上清液即為草果多酚提取液。

1.2.2 草果多酚得率的測定方法

用參考文獻(xiàn)[18]中的方法制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=0.4307x+0.0063，R2=0.9991。

準(zhǔn)確吸取1.2.1中制備的草果多酚上清液5 mL，加蒸餾水10 mL，混勻后，準(zhǔn)確吸取稀釋后的上清液1 mL置于25 mL容量瓶中，從加水至6 mL開始，按照參考文獻(xiàn)[18]中的方法進(jìn)行顯色和測定，最后按此公式計算。草果多酚得率(%)=(C×N×V)/10M。式中：C為樣品吸光度值帶入線性回歸方程中計算出的多酚提取液濃度(mg/mL)；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積(mL)；M為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.3 草果多酚提取工藝條件的優(yōu)化

先進(jìn)行四因素五水平的單因素試驗(yàn)，找到乙醇濃度、提取溫度、料液比和提取時間這4個單因素下的最優(yōu)水平，然后設(shè)計四因素三水平的正交試驗(yàn)L9(34)，最后得到草果多酚最佳提取工藝條件。

1.2.4 草果多酚的純化方法

以濕法裝柱，制備D101大孔樹脂層析柱，將1.2.1方法中制備的草果上清液稀釋至多酚濃度為1.0 mg/mL，用0.1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至4后，以2 BV/h(BV為樹脂床體積)的流速進(jìn)行上樣，直至流出液吸光度達(dá)到泄漏點(diǎn)時停止，然后用蒸餾水洗滌層析柱至流出液無色、無醇味后，用70%乙醇溶液以2 BV/h的流速進(jìn)行解吸，收集解吸液，將解吸液的多酚濃度稀釋至0.5 mg/mL，備用。

1.2.5 草果多酚的定性分析

液相色譜條件：Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，柱溫30 ℃，流動相A為甲醇，流動相B為0.1%甲酸溶液，梯度洗脫條件為0～30 min：40%～75% A，30～35 min：75% A，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為ESI負(fù)離子源，噴霧電壓為4000 V；霧化氣體為N2，霧化氣壓力為35 psi，霧化氣流速為10 L/min，離子源溫度為350 ℃；碰撞氣體為N2，碰撞氣壓力為0.15 MPa。

1.2.6 草果多酚清除DPPH自由基有效成分的識別

取純化后并經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后的草果多酚提取液兩份：一份直接用HPLC分離測定；另一份與5 mL DPPH溶液混合均勻，反應(yīng)1 h后，再用HPLC分離測定。兩次測定的色譜條件均為：色譜柱C18柱；流動相為乙腈∶水為75∶25(V/V)；流速0.8 mL/min；檢測波長268 nm；色譜柱溫度為室溫(25 ℃)，進(jìn)樣量5 μL。最后根據(jù)草果多酚提取液與DPPH溶液反應(yīng)前后色譜峰面積的變化情況，計算出草果多酚提取物中每一成分清除DPPH自由基的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取草果多酚的單因素試驗(yàn)結(jié)果

草果多酚的單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 單因素對草果多酚得率的影響Fig.1 Effect of single factor on the extraction yield of polyphenols from Amomum tsaoko注：a為乙醇濃度的影響；b為溫度的影響；c為料液比的影響；d為時間的影響。

由圖1中a可知，當(dāng)乙醇濃度由40%升到70%時，醇溶性的多酚逐漸被提取出來，多酚得率隨之升高，當(dāng)進(jìn)一步升高乙醇濃度至80%時，會導(dǎo)致部分水溶性的多酚不能被充分提取出來，多酚得率隨之下降，當(dāng)乙醇濃度為70%時，草果多酚的得率最高，因此選擇70%為最佳乙醇濃度。由圖1中b可知，當(dāng)提取溫度在40～70 ℃之間時，草果多酚的得率隨著提取溫度的升高而提高，這是因?yàn)樯咛崛囟龋铀倭朔肿拥倪\(yùn)動，更有利于多酚物質(zhì)從細(xì)胞中溶出，當(dāng)提取溫度進(jìn)一步提高到80 ℃時，多酚得率反而降低，這是因?yàn)檫^高的提取溫度會使多酚氧化分解，因此選擇70 ℃為最佳提取溫度。由圖1中c可知，當(dāng)料液比為1∶30時，多酚得率最高；當(dāng)料液比低于1∶30時，溶劑量過少，達(dá)到飽和后，多酚不再溶出；當(dāng)料液比高于1∶30時，溶劑量過多，不利于微波的傳導(dǎo)，使得多酚得率稍有下降。由圖1中d可知，當(dāng)提取時間為10 min時，草果多酚得率最高；當(dāng)時間低于10 min時，時間過短，多酚未被充分提取出來；當(dāng)時間高于10 min時，微波會加速多酚的氧化分解，所以隨著微波時間進(jìn)一步加長，多酚得率反而逐漸下降，因此選擇10 min為最佳提取時間。

與文獻(xiàn)[6]、文獻(xiàn)[16]、文獻(xiàn)[17]比較可知，微波輔助提取能夠顯著縮短草果多酚的提取時間，其提取時間為超聲波輔助提取法的1/4，為傳統(tǒng)溶劑提取法的1/15，同時微波輔助提取法的多酚得率也要高于這兩種方法，這是因?yàn)槲⒉艽偈怪参锏募?xì)胞組織破壁或變形，使多酚成分更加快速且充分地溶出。

2.2 提取草果多酚的正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of orthogonal test

續(xù) 表

由表1可知，對草果多酚得率影響最大的因素是乙醇濃度，然后是提取溫度，最后是料液比和提取時間。草果多酚的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度70%、提取溫度70 ℃、料液比1∶35(g/mL)、提取時間10 min。在此條件下平行提取3次，得到的草果多酚得率分別為11.08%、11.15%、11.17%，平均值為11.13%。

2.3 草果多酚成分分析

草果多酚的總離子流圖見圖2，在其質(zhì)譜條件下分析得到草果中3種多酚類化合物的母離子和碎片離子信息，見表2。

圖2 草果多酚的總離子流圖Fig.2 The total ion flow diagram of polyphenols from Amomum tsaoko

表2 草果多酚的LC-MS/MS數(shù)據(jù)Table 2 LC-MS/MS data of polyphenols from Amomum tsaoko

通過比對樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間、母離子及其碎片離子的數(shù)據(jù)以及圖譜解析，確定出了草果多酚提取物中3種多酚類化合物，分別是原兒茶醛、漢諾基諾醇和雙氫楊梅樹皮素二聚體，分別占總量的7.2%、65.3%和17.3%。原兒茶醛樣品(1號峰)及標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖是非常吻合的(見圖3中a)；通過圖譜解析和文獻(xiàn)比對，確定2號峰為漢諾基諾醇，m/z 315.1是漢諾基諾醇的[M-1]準(zhǔn)分子離子峰，其發(fā)生α-裂脫掉HO-C6H4-C4H7(OH)-基團(tuán)，得到m/z 149的碎片離子，其裂解規(guī)律及其質(zhì)譜圖見圖3中b，此結(jié)果和Martin等[19]和Zhang等的結(jié)果是一致的；3號峰 m/z 639.4為雙氫楊梅樹皮素二聚體的[M-1]準(zhǔn)分子離子峰，m/z 331.1為雙氫楊梅樹皮素單體峰(含一分子水)。根據(jù)二級質(zhì)譜圖譜解析和文獻(xiàn)比對，該成分被確定為雙氫楊梅樹皮素二聚體[20]，其分子裂解規(guī)律及質(zhì)譜圖見圖3中c。由表2可知，漢諾基諾醇為草果多酚的主要成分。

圖3 草果多酚與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的二級質(zhì)譜比對圖Fig.3 Comparison of MS2 spectra of polyphenols from Amomum tsaoko and corresponding standard samples

2.4 草果多酚清除DPPH自由基有效成分的識別

草果多酚與DPPH反應(yīng)前后的HPLC圖見圖4?？寡趸钚栽綇?qiáng)的多酚類化合物與DPPH自由基反應(yīng)的能力就越強(qiáng)，而大量被消耗，反映到HPLC圖上就是該多酚化合物與DPPH反應(yīng)后的峰面積較反應(yīng)前大大降低，所以峰面積下降越多的多酚化合物其清除DPPH自由基及抗氧化活性越強(qiáng)。

圖4 草果多酚與DPPH自由基反應(yīng)前后的HPLC圖Fig.4 HPLC chromatogram of polyphenols from Amomum tsaoko before and after reacted with DPPH free radicals注：1為原兒茶醛，2為漢諾基諾醇，3為雙氫楊梅樹皮素二聚體。

試驗(yàn)結(jié)果顯示：原兒茶醛與DPPH反應(yīng)后，峰面積下降了4.56%，漢諾基諾醇與DPPH反應(yīng)后，峰面積下降了24.02%，雙氫楊梅樹皮素二聚體與DPPH反應(yīng)后，峰面積下降了21.84%?？梢?種多酚類化合物均具有抗氧化及清除DPPH自由基的能力，但它們之間活性強(qiáng)度存在差異，其活性順序依次為漢諾基諾醇>雙氫楊梅樹皮素二聚體>原兒茶醛，其中漢諾基諾醇的抗氧化及DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)。另外，其余的一些微量成分也表現(xiàn)出一定的抗氧化能力。有研究表明，草果總多酚的抗氧化能力高于Vc。因此，草果總多酚所表現(xiàn)出來的較強(qiáng)抗氧化活性是所有多酚協(xié)同作用的結(jié)果，漢諾基諾醇起主要作用。

3 結(jié)論

采用微波輔助提取法從調(diào)味香料草果中提取多酚類化合物，確定了最佳提取條件為：乙醇濃度70%、提取溫度70 ℃、料液比1∶35(g/mL)、提取時間10 min，草果多酚的得率為11.13%。用LC-MS/MS對草果多酚成分進(jìn)行分析，鑒定出3種多酚類化合物：原兒茶醛、漢諾基諾醇和雙氫楊梅樹皮素二聚體。同時，采用DPPH自由基作探針識別出草果中抗氧化活性較強(qiáng)的多酚類化合物，從結(jié)果上看，草果多酚中起主要抗氧化作用的是主成分漢諾基諾醇，其余大部分都具有抗氧化活性，但活性強(qiáng)弱有較大差異，這些多酚在草果中由于含量較低，起到輔助的作用。