苗永美，韓 朔，苗翠蘋，張 維，徐榮華

1安徽科技學(xué)院生命與健康科學(xué)學(xué)院，鳳陽 233100；2云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650504

植物內(nèi)生菌是指寄生于植物活體組織、器官內(nèi)的細(xì)菌、真菌和放線菌等微生物，幾乎每種植物體內(nèi)都含豐富菌物，內(nèi)生菌經(jīng)過長(zhǎng)期進(jìn)化逐漸與寄主形成共生關(guān)系，不會(huì)引起明顯的宿主植物外在感染癥狀。研究表明內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物不僅能抑制病原微生物，還可以激活宿主植物的免疫應(yīng)答系統(tǒng)，增強(qiáng)植物防御相關(guān)基因的表達(dá)譜[1,2]，也是天然藥物重要來源[3]。微生物農(nóng)藥因綠色環(huán)保及對(duì)農(nóng)副品品質(zhì)影響小等優(yōu)勢(shì)已成為21世紀(jì)農(nóng)藥新產(chǎn)業(yè)，代表著植保方向。蘭科植物因其生境內(nèi)生菌更為豐富，Chen等[4]從5種蘭科藥用植物(白芨、手參、金釵石斛、束花石斛、金線蓮)分離到241株內(nèi)生菌。作者前期在開展石豆蘭屬植物(Bulbophyllumsp.)離體培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)其組織內(nèi)生菌豐富[5]，有些菌能與寄主離體組織共生?？菸∈敲藁ǚN植期一種常見病害，全國(guó)各主要產(chǎn)棉區(qū)普遍發(fā)生，危害嚴(yán)重，估計(jì)每年因枯萎病損失皮棉1億公斤?？菸∮杉怄哏牭毒?Fusariumoxysporum)引起，該病原菌根據(jù)寄主特異性被劃分為不同?；?，如棉花專化型、黃瓜?；汀⑾憬秾；偷龋行；陀指鶕?jù)寄主品種被進(jìn)一步劃分為不同生理小種[6]，并形成了與其他國(guó)家不同獨(dú)特生理小種[7]。不同?；图吧硇》N引起的枯萎病需要不同防治方法[8]，因此找準(zhǔn)尖孢鐮刀菌不同專化型及其生理小種的生防菌尤為重要。本試驗(yàn)以尖孢鐮刀菌棉花萎蔫專化型為指示菌，從石豆蘭屬植物內(nèi)生菌中尋找具抑制效果的生防菌，優(yōu)化發(fā)酵條件，電鏡觀察主要抑菌物質(zhì)脂肽對(duì)病原菌形態(tài)影響。本實(shí)驗(yàn)為抑菌物質(zhì)的制備進(jìn)而為棉枯病的生物防治奠定實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

石豆蘭屬植物采自福建屏南鴛鴦獼猴自然保護(hù)區(qū)；尖孢鐮刀菌棉花枯萎?；?F.oxysporumf.sp.vasinfectum)，由本校農(nóng)學(xué)院段海明博士提供。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：NA、金氏、YPD、LB、大豆酪蛋白、YG、R2A共7種；指示菌培養(yǎng)用PDA培養(yǎng)基；篩選培養(yǎng)基為L(zhǎng)B；發(fā)酵培養(yǎng)基以LB為基礎(chǔ)，添加不同C、N。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)生菌分離

植株表面洗凈、吸干水分，葉片、假鱗莖、橫走莖和根分別剪下，75%酒精處理30 s，無菌水漂洗3次，0.1%HgCl2消毒8 min，無菌水洗5次。材料切碎，按1∶20加無菌水研磨，渦旋混勻，梯度稀釋。取100 μL菌懸液涂布于分離培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)4天。據(jù)菌落顏色、大小、形態(tài)等特征挑菌落，劃線多次純化。

1.3.2 活性菌篩選

對(duì)峙法初步篩出具抑菌活性菌株，瓊脂小柱法復(fù)篩。復(fù)篩步驟：活性菌活化，30 ℃，180 r/min條件下培養(yǎng)12 h得種子液，2%接種量接入LB(裝量20 mL/50 mL)發(fā)酵3 天，離心，上清微孔膜過濾，與PDA按1∶10混合制平板。病原菌活化，打孔器(d=0.8 cm)沿邊緣打菌餅、倒扣在復(fù)篩平板中央，LB代替發(fā)酵液做對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)4天，十字交叉法測(cè)量菌落直徑。抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.3.3 菌種鑒定

抑菌效果最好菌株BBs-27做分子鑒定。PowerSoilRDNA Isolation Kit試劑盒提取總DNA，用引物(PA：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′和PB：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)PCR擴(kuò)增16S rDNA、測(cè)序，NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索，選取近緣菌種，以大腸桿菌為外支，MEGA 7.0軟件中Muscle序列比對(duì)，選用Kimura2-parameter距離模型計(jì)算進(jìn)化距離，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Bootstrap值=1 000)。

1.3.4 發(fā)酵液不同滅菌處理

BBs-27發(fā)酵液上清依次用0.45 μm、0.22 μm微孔膜過濾和121 ℃高溫處理15 min。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

單因素有碳源、氮源，pH、溫度和時(shí)間。據(jù)單因素結(jié)果，選蔗糖、(NH4)2HPO4、時(shí)間和溫度為自變量，抑菌率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行4因素3水平Box-Behnken設(shè)計(jì)，其他條件為：LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH=5，180 r/min。重復(fù)3次。

1.4 脂肽制備及對(duì)尖孢鐮刀菌形態(tài)影響

酸沉醇提法制備脂肽：7 mol/L鹽酸調(diào)pH=2，過夜沉淀；4 ℃、5 000 r/min離心20 min，甲醇多次抽提，蒸發(fā)濃縮，35 ℃真空干燥1天，稱重，計(jì)算產(chǎn)量。

配制10 mg/mL脂肽原液，過濾除菌，添加至PDA培養(yǎng)基中使脂肽終濃度為0.02～1 mg/L，按“1.3.2”方法抑菌試驗(yàn)。菌絲噴金后用型號(hào)FEIQuanta-200掃描電鏡觀察菌絲形態(tài)和孢子。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

Excel繪圖，Design-Expert 8.0.5軟件響應(yīng)面設(shè)計(jì)，SPSS 18.0多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性菌篩選

從4種組織中共分離到39株細(xì)菌，兩級(jí)篩選到13株有抑菌活性，抑菌率在5.77%～60.78%之間，其中27號(hào)菌抑菌率最高，根據(jù)編號(hào)和來源命名為BBs-27。

2.2 菌株鑒定

菌株BBs-27的16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast，利用Mega7軟件進(jìn)行聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1)，與Bacillussubtilissubsp.subtilisstrain168相似性為98.93%，系統(tǒng)發(fā)育樹上屬同一分支，說明它們之間親緣關(guān)系最近。

2.3 發(fā)酵液不同處理方式對(duì)抑菌率影響

經(jīng)過微孔濾膜過濾和濕熱高溫滅菌處理后的發(fā)酵液抑制率分別為56.12%和51.57%，說明高溫對(duì)抑菌物質(zhì)活性有一定影響，但抑菌活性仍然較好，證明主要抑菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性高。由于過濾處理操作費(fèi)力費(fèi)時(shí)、污染率高等，后期試驗(yàn)用濕熱滅菌法除菌。

2.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 碳源

以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，BBs-27發(fā)酵液抑菌率為51.57%，除了2.5%～3.0%木糖外，其他糖添加都能顯著提高抑菌率，尤其添加2.0%～2.5%蔗糖時(shí)其抑菌率顯著高于其他處理，而兩者之間差異不顯著(見表1)。

表1 不同碳源對(duì)抑菌率影響

2.4.2 氮源

LB中分別添加0.05%～0.2%的7種氮源，發(fā)酵物抑菌率在66.59%～80.39%之間都顯著性高于對(duì)照，0.05%(NH4)2HPO4時(shí)抑菌率最高，為80.39%，結(jié)果見表2。

表2 不同氮源對(duì)抑菌率影響

2.4.3 初始pH

初始pH對(duì)抑菌率影響見圖2，抑菌率會(huì)隨著pH增大先升高后降低，pH=5時(shí)發(fā)酵物的抑菌率最高，為74%，顯著高于其他pH。

圖2 初始pH對(duì)抑菌率影響

2.4.4 發(fā)酵溫度

發(fā)酵溫度會(huì)顯著影響抑菌物質(zhì)合成(見圖3)，抑菌率隨著溫度升高先增大后減小，40～42 ℃的抑菌率顯著高于其他處理，但兩者之間差異不顯著。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)抑菌率影響

2.4.5 發(fā)酵時(shí)間

4個(gè)發(fā)酵時(shí)間的產(chǎn)物抑菌率有明顯差異(見圖4)，抑菌率隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)先升高后降低，發(fā)酵96 h時(shí)，抑菌率最高，為58.82%。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌率影響

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表3和表4。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 模型方差分析

2.5.1 回歸模型建立與分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇蔗糖、(NH4)2HPO4、溫度和時(shí)間四因素、三個(gè)水平，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理構(gòu)建響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)(見表3)。1～24號(hào)是析因?qū)嶒?yàn)，25～29號(hào)為中心實(shí)驗(yàn)。

2.5.2 方差分析

利用Design Expert V8.0.6對(duì)表3數(shù)據(jù)多元回歸擬合分析，得回歸方程：Y=4585.03-28.79A-1401.75B-216.53C+3.00D+32.35AB-0.47AC+0.42AD+29.90BC+0.10BD-0.11CD+2.90A2+287.91B2+2.66C2+3.64×10-3D2。

表4所示，回歸模型極顯著(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)P=0.153 1(>0.05)，說明模型失擬不顯著，R2=0.9551(>0.75)，Radj=0.910 2，說明模型擬合度較高，實(shí)驗(yàn)誤差小，可用來分析和預(yù)測(cè)抑菌物質(zhì)合成發(fā)酵條件。A、B、C、C2對(duì)抑菌率影響極顯著(P<0.01)；其次AD、BC和CD的影響顯著(P<0.05)。根據(jù)F值大小說明對(duì)抑菌率影響的大小順序依次為C>A>B>D。

2.5.3 發(fā)酵條件響應(yīng)面分析及優(yōu)化

為了更直觀探討上述因素之間的交互影響，固定任意兩個(gè)因素，考察另兩個(gè)因素間的交互作用，如圖5所示。根據(jù)響應(yīng)面走勢(shì)、等高線密集，形狀，存在顯著交互作用的兩因素且從大到小依次是BC、CD和AD，其他相互作用不顯著。通過軟件分析得到最優(yōu)化值為蔗糖2.49%、(NH4)2HPO40.01%，溫度40.14 ℃，發(fā)酵時(shí)間105.56 h，此條件下，模型預(yù)測(cè)抑菌率為88.82%。

圖5 兩因素交互對(duì)抑菌率影響的響應(yīng)面圖

2.5.4 發(fā)酵參數(shù)修正及驗(yàn)證試驗(yàn)

為操作方便，實(shí)際工藝參數(shù)修正為2.5%蔗糖、0.01%(NH4)2HPO4，40 ℃，105 h。依據(jù)上述參數(shù)進(jìn)行發(fā)酵抑菌試驗(yàn)，抑菌率均值為88.06%，與預(yù)測(cè)值基本一致，相對(duì)誤差為0.86%，說明該模型能較好地預(yù)測(cè)抑菌物質(zhì)產(chǎn)率，測(cè)產(chǎn)脂肽產(chǎn)量為0.6g(干重)/L。

2.6 脂肽對(duì)尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)影響

添加0.02～1 mg/L脂肽對(duì)尖孢鐮刀菌棉花枯萎?；偷囊志试?.71%～70.29%范圍內(nèi)，根據(jù)線性方程Y=0.058 9X+21.202，脂肽的半抑菌率IC50為488.93 μg/L。脂肽對(duì)病原菌有明顯抑制作用，表現(xiàn)為菌落變小，縱向生長(zhǎng)，顏色為淺黃色；而對(duì)照組菌絲中央為紅色，新長(zhǎng)出菌絲為白色(見圖6)。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)脂肽處理組菌絲膨大變形，粗細(xì)不均、有大量分生孢子(見圖7)，說明菌體處于逆境狀態(tài)，生長(zhǎng)受到抑制。

圖6 脂肽對(duì)尖孢鐮刀菌抑菌效果

圖7 發(fā)酵液對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲形態(tài)的影響

3 討論與結(jié)論

尖孢鐮刀菌能引起植物根腐病、枯萎病和黃化病[9]。用于棉枯病的生防菌主要有哈茨木霉TH-1[10]、綠色木霉GY20[11]、海洋鏈霉菌ZW-1[11]、壯觀鏈霉菌SC11[13]、短小芽孢桿菌[14]、解淀粉芽孢桿菌SN06[15]、蠟狀芽孢桿菌YUPP-10[16]等。因?yàn)榧怄哏牭毒嬖诓煌瑢；秃蜕硇》N，本研究所用尖孢鐮刀菌病原菌從本校試驗(yàn)田發(fā)病棉花植株中分離，屬于棉花萎蔫專化型，以抑制該病原菌的拮抗菌為篩選目標(biāo)，從石豆蘭屬植物中篩選到一株具較好抑制作用的細(xì)菌，命名為BBs-27，分子鑒定與枯草芽孢桿菌亞種相似性最高。芽孢桿菌屬的很多種具有廣譜抗菌活性，具抑菌效果有枯草芽孢桿菌[17]、地衣芽孢桿菌[18]、瓦雷茲芽孢桿菌[19]、解淀粉芽孢桿菌[20]和蠟樣芽孢桿菌[21]等類型。

抑菌物質(zhì)的發(fā)酵受培養(yǎng)基和環(huán)境因子影響較大[22]，通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件會(huì)提高抑菌物質(zhì)產(chǎn)量。Liu等[23]用優(yōu)化后的培養(yǎng)基發(fā)酵莫海威J7，抑菌物產(chǎn)量提高了38.89%，Chen等[24]優(yōu)化了解淀粉芽孢桿菌SC1150菌株發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)香蕉枯萎病4號(hào)生理小種的抑菌圈直徑由23.31增加到28.33。本研究中除了含2.5%～3.0%木糖培養(yǎng)基中沒有抑菌物質(zhì)產(chǎn)生，其他糖添加都能促進(jìn)抑菌物質(zhì)產(chǎn)生；LB中只含有機(jī)氮，添加0.05%無機(jī)氮源(NH4)2HPO4能提高抑菌活性，優(yōu)化后抑菌率由51.57%提高到88.06%，脂肽產(chǎn)量為0.6g(干重)/L，比枯草芽孢桿菌HS-A38及誘變菌株的產(chǎn)量均高[25]，Zhang等[26]對(duì)B.subtilisATCC2133產(chǎn)脂肽條件進(jìn)行了優(yōu)化，HPLC法測(cè)定含量為4.885 g/L，這可能因菌株及檢測(cè)方法有關(guān)。

產(chǎn)生抗菌脂肽微生物有多種，如細(xì)菌、放線菌、真菌等，其中芽孢桿菌是發(fā)現(xiàn)產(chǎn)脂肽最多的屬類，不同微生物產(chǎn)生的脂肽具不同結(jié)構(gòu)、特性和不同抑菌效果[27]。本研究所用的BBs-27產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有些耐高溫、有些高溫下失活，說明抑菌物質(zhì)有多種，但主要抑菌物質(zhì)是耐121℃高溫處理的。根據(jù)脂肽理化性質(zhì)和本試驗(yàn)脂肽的抑菌效果，推測(cè)出BBs-27產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要是脂肽。已開展的另一部分研究表明其他高溫失活的抑菌物質(zhì)可能是蛋白質(zhì)，抑菌蛋白的相關(guān)研究及脂肽結(jié)構(gòu)等工作有待進(jìn)一步開展。