潘 玥，劉小莉，王 英，夏秀東，陶寧萍，吳 寒，劉思遠，周劍忠,3*

1上海海洋大學食品學院，上海 201306；2江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所，南京 210014；3江蘇大學食品與生物工程學院，鎮(zhèn)江 212013

藍莓是一種小漿果，甜酸適口，為鮮食佳品，屬杜鵑花科，越橘屬植物。在我國東北長白山、大興安嶺和小興安嶺林區(qū)有大量的野生藍莓[1]。藍莓富含糖類、萜類、氨基酸和大量多酚類等化合物，具有較高的營養(yǎng)價值和保健作用[2]。近年來，對其活性成分的研究日益增多。與藍莓的果實和花相比，藍莓葉的酚類物質含量更高[3]。目前藍莓葉多酚在抗氧化能力[4]、降血壓、抑菌[5]方面的研究較多，降血糖方面的研究很少。如今糖尿病已成為威脅人類健康的重大疾病之一[6]。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶能夠促進口腔、胃、腸道對食物的分解，釋放葡萄糖進入血液，使血糖水平升高[7,8]。服用抑制劑類藥物是目前治療糖尿病的首選方式。市面上化學類藥物容易引起脹氣、消化不良等副作用[9]，從天然物質中提取抑制劑更具安全性。已有研究報道植物提取物中多酚類、萜類衍生物[10]、多糖[11]、苯丙素類化合物[12]等具有良好的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性。多酚在預防和治療糖尿病方面具有很大的潛力，Liu等[13]表明綠茶提取物中多酚具有抑制作用，能夠抑制腸道上皮細胞Caco-2對葡萄糖的攝取和轉運。Sun等[14]通過分子對接，探究出多酚能夠與α-淀粉酶活性位點的氨基酸殘基結合改變酶的分子構象，從而抑制其與底物結合。本文研究了藍莓葉多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用和抑制類型，為藍莓葉相關產品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍莓葉2020年7月采自溧陽白露山生態(tài)農業(yè)發(fā)展有限公司藍莓基地；AB-8大孔樹脂(上海藍季科技發(fā)展有限公司)；無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)；鹽酸(成都市科龍化工試劑有限公司)；氫氧化鈉、酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、葡萄糖、苯酚和可溶性淀粉(西隴化工股份有限公司)；沒食子酸、福林酚試劑、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)和阿卡波糖(麥克林)；α-淀粉酶(豬胰腺)(10 U/mg)和α-葡萄糖苷酶(上海源葉生物科技有限公司)。

Epoch酶標儀(美國Bioteck儀器有限公司)；ML204/02電子分析天平、FE28-Meter臺式pH計(梅特勒-托利多儀器有限公司)；Deltal 2-24/LSC冷凍干燥機(德國Christ公司)；3k15臺式高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；RE-2000A旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；KQ2 200DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍莓葉酚類物質的提取

參照Wu等[15]方法稍作改變，將新鮮藍莓葉切片，按照料液比為1∶10(g/mL)加入酸化乙醇(含有0.5%鹽酸的80%乙醇)勻漿2 min，超聲輔助提取20 min，功率為800 W，超聲結束后5 000 r/min離心10 min收集上清液。上述提取方法提取三次后合并溶劑。經40 ℃ 50 r/min旋轉蒸發(fā)濃縮，得到藍莓葉多酚粗提物，將其凍干后-20 ℃避光保存。

1.2.2 總酚含量的測定

參照Wu等[15]的方法，將藍莓葉多酚凍干樣配制成1 mg/mL溶液，取0.1 mL加入0.3 mL 10%乙醇稀釋，再分別加入2.0 mL 0.5 mol/L福林酚試劑，搖勻，反應4 min，隨后加入2 mL 75 g/L的飽和碳酸鈉，搖勻，室溫下暗反應2 h。用蒸餾水做空白對照，利用酶標儀在760 nm處測定吸光度。以沒食子酸(GA)在760 nm處的吸光值繪制標準曲線，公式為y=1.744x+0.021(R2=0.990)。y為藍莓葉多酚粗提液的吸光值，x表示總酚含量，mg GA/mg(DW)，DW為干重。

1.2.3 藍莓葉酚類物質的純化

采用AB-8大孔吸附樹脂對藍莓葉多酚粗提物進行純化，將100 mg粗提物溶于50 mL酸化乙醇中，經0.45 μm有機針膜過濾，按照Ma[16]方法進行純化，合并洗脫液。在40 ℃旋轉蒸發(fā)，蒸發(fā)至1/4體積停止，倒出溶液，-20 ℃下凍結溶液，冷凍干燥24 h，得到純化后藍莓葉多酚。

1.2.4 藍莓葉多酚的鑒定

1.2.4.1 樣品處理

將純化后的藍莓葉多酚凍干樣用80%甲醇溶解，過0.22 μm有機濾膜，采用LC-MS鑒定。

1.2.4.2 液相色譜-質譜法(LC-MS)成分鑒定

樣品采用LC-MS體系(G2-XS QTof，Waters)進行分析。將2 μL樣品注入UPLC柱(2.1 mm×100 mm ACQUITY UPLC BEH C18柱，含有1.7 μm粒子)，流速為0.35 mL/min。流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為 0.1% 甲酸乙腈水溶液。采用以下梯度程序：5% 流動相B，0.5 min；5%→40%流動相B,20 min;40%→95% 流動相B,2 min;95%流動相B,2 min。

質譜分析采用電噴霧源，正離子模式。MSe采集模式，選擇質量范圍50～1 200m/z。使用亮氨酸-腦啡肽(m/z556.277 1)校準質量。電離參數(shù)為：毛細管電壓2.5 kV，樣品錐 40 V，源溫度120 ℃，脫溶劑氣體溫度為 400 ℃。使用Masslynx 4.1和Unifi 進行數(shù)據(jù)采集和處理。成分鑒定參照南京農業(yè)大學標準譜庫，鑒定匹配度高于80%的化學成分。

1.2.5α-淀粉酶抑制實驗

將藍莓葉多酚濃度配制為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 μg/mL，阿卡波糖濃度配制為0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 μg/mL。按照Tian[17]方法稍作改變，以阿卡波糖作為陽性對照，按照表1進行α-淀粉酶抑制實驗，α-淀粉酶抑制率按下列公式計算。根據(jù)抑制率與藍莓葉多酚濃度關系，通過GraphPad Prism 8軟件擬合計算半抑制濃度IC50值。

表1 α-淀粉酶抑制活性測定

式中：ODA為實驗組吸光值；ODa為實驗空白組吸光值；ODB為對照組吸光值；ODb為空白組吸光值。

1.2.6α-葡萄糖苷酶抑制實驗

將藍莓葉多酚和阿卡波糖濃度配制為2、4、6、8、10、12、14 μg/mL，按照Tian[17]方法稍作改變，以阿卡波糖為陽性對照，按照表2進行α-葡萄糖苷酶抑制實驗，α-葡萄糖苷酶抑制率按下列公式計算。根據(jù)抑制率與藍莓葉多酚濃度關系，通過GraphPad Prism 8軟件擬合計算半抑制濃度IC50值。

表2 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

式中：ODA為實驗組吸光值；ODa為實驗空白組吸光值；ODB為對照組吸光值；ODb為空白組吸光值。

1.2.7 藍莓葉多酚穩(wěn)定性研究

1.2.7.1 藍莓葉多酚對溫度的穩(wěn)定性

將純化后的藍莓葉多酚配制成0.02 mg/mL溶液，分別在30、40、50、60、70、80、90 ℃水浴中保溫30 min，迅速冷卻至室溫，測其α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性，以溫度為橫坐標，以酶抑制活性為縱坐標，繪制曲線。

1.2.7.2 藍莓葉多酚對pH的穩(wěn)定性

將純化后的藍莓葉多酚配制成溶液，分別用不同pH(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)的PBS緩沖液溶解后于37 ℃保溫4 h，用緩沖液回調pH至6.8和6.9，再將各個pH條件下處理的多酚稀釋至相同濃度，測定其對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，以pH為橫坐標，以酶抑制活性為縱坐標，繪制曲線。

1.2.8 抑制作用類型研究

1.2.8.1α-淀粉酶抑制動力學

將純化后藍莓葉多酚配制成濃度為0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL的溶液，α-淀粉酶溶液設置為0、0.15、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9、1.05 mg/mL。計算酶促反應速率，繪制酶促反應速率與α-淀粉酶濃度的關系圖。

將可溶性淀粉配制成0.25%、0.33%、0.5%、1.0%、2.0%，計算不同底物濃度和不同濃度藍莓葉多酚下的酶促反應速率。繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖和Dixon圖，分析確定藍莓葉多酚對α-淀粉酶的抑制類型。

1.2.8.2α-葡萄糖苷酶抑制動力學

將純化后藍莓葉多酚配制成濃度為0.005、0.010、0.015、0.020 mg/mL的溶液，α-葡萄糖苷酶溶液設置為0、0.506、1.012、1.26、1.518、2.024 U/mL。計算酶促反應速率，繪制酶促反應速率與α-葡萄糖苷酶濃度的關系圖。

將pNPG配制成2.5、3.3、5、10、20 mmol/L，計算不同底物濃度和不同濃度藍莓葉多酚下的酶促反應速率。繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖和Dixon圖，分析確定藍莓葉多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制類型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

由Origin 2019軟件繪制，所有實驗重復測定3次，采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件整理及統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 純化前后藍莓葉多酚含量及抑制活性的變化

為確定純化前后藍莓葉多酚含量和抑制活性，將純化前后藍莓葉提取物凍干樣配制成相同濃度，按照“1.2.2”“1.2.5”和“1.2.6”方法分別測定并計算純化前后總酚含量、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的變化。通過圖1藍莓葉粗提物經純化后的總酚含量可知純化后藍莓葉多酚純度為36%，較純化前提高了44.00%，α-淀粉酶抑制率提高了138.70%，α-葡萄糖苷酶抑制率提高了12.42%。純化前后對α-淀粉酶抑制和α-葡萄糖苷酶活性提升極顯著(P< 0.01)，同等濃度下藍莓葉多酚對α-葡萄糖苷酶抑制率高于α-淀粉酶。接下來的實驗選擇對純化后藍莓葉多酚，對其成分、溫度和pH的穩(wěn)定性、半抑制濃度IC50值及其抑制類型進行探究。

圖1 藍莓葉多酚純化前后總酚含量和抑制活性的變化

2.2 藍莓葉純化后的多酚物質鑒定分析

從表3 LC-MS分析結果可以看出藍莓葉提取物中多酚主要有綠原酸、5,6,7,3′,4′-五氫化二異黃酮、槲皮素、原花青素、3′-羥基染料木素、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷、1,5-二阿魏?？鼘幩岬?1種多酚物質，其中綠原酸含量最高。有研究表明，綠原酸是藍莓葉中含量最高的酚類物質[18]，其中綠原酸、阿魏酸、槲皮素、原花青素等，已被證明具有較強的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性[19]。由“2.1”結果可知藍莓葉多酚提取物中總酚含量與對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性成正相關。結果表明，藍莓葉提取物中多酚類化合物是其抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的主要物質基礎。

表3 藍莓葉提取物成分分析結果

2.3 藍莓葉多酚對溫度的穩(wěn)定性研究

由圖2可知溫度對藍莓葉多酚抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性的影響趨勢大致相同。當溫度在30 ℃和40 ℃時，藍莓葉多酚對α-淀粉酶的抑制率無顯著性差異(P> 0.05)；40 ℃之后隨溫度升高，抑制率呈緩慢下降趨勢，80 ℃作用30 min，抑制劑活性較40 ℃失去了19.38%；90 ℃作用30 min后，藍莓葉多酚完全失活。溫度在30～80 ℃時，藍莓葉多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制率呈下降趨勢；當溫度在80 ℃時，相比30 ℃抑制率失去了14.75%；90 ℃作用30 min后，藍莓葉多酚幾乎完全失活。以上實驗結果說明提取物中有效活性成分容易受高溫影響發(fā)生氧化反應，從而導致抑制率下降。

圖2 溫度對藍莓葉多酚抑制活性的影響

藍莓葉多酚對酶的抑制活性受溫度影響較小。在37 ℃具有較高的抑制活性，說明其在人體內能夠保持良好的效果；但當溫度達到90 ℃時對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性明顯降低。在產品開發(fā)應用中應注意加工溫度對其活性成分的影響，不宜高溫。

2.4 藍莓葉多酚對pH的穩(wěn)定性研究

由圖3可知藍莓葉多酚經pH 2.0～8.0環(huán)境處理后能夠保持其對α-淀粉酶的抑制活性，抑制率都超過了90%。當pH > 8.0時抑制率呈緩慢下降趨勢，當pH為12.0時抑制率驟降至46.50%，說明藍莓葉多酚經過堿性條件處理后對α-淀粉酶抑制活性影響較大。藍莓葉多酚抑制α-葡萄糖苷酶活性受pH的影響較大，pH 2.0～5.0呈上升趨勢，pH 5.0時，抑制率最大，達到73.06%。在pH 5.0之后，隨著pH升高，α-葡萄糖苷酶抑制率逐漸降低。pH 7.0～8.0抑制率較pH 7.0驟降了45.49%，pH 8.0～11.0趨于穩(wěn)定，pH 12.0時完全失去抑制活性。藍莓葉多酚經pH 3.0～5.0處理后，對α-葡萄糖苷酶的抑制活性比較穩(wěn)定，在強酸和堿性條件下不穩(wěn)定。

圖3 pH對藍莓葉多酚抑制活性的影響

綜上所述，藍莓葉多酚在偏酸性條件下比較穩(wěn)定，能夠保持較高的抑制活性。而人體胃酸pH低于2，腸道pH在7.5左右[20]，說明藍莓葉多酚添加到食物中，在胃腸道消化環(huán)境下，仍能保持其抑制活性。在產品的開發(fā)研究中，將藍莓葉多酚添加至酸性食品中，能夠最大程度保持其功能活性。

2.5 藍莓葉多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究

由圖4可以看出隨著藍莓葉多酚和阿卡波糖對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨濃度增大而增大，且無限趨于100%，這表明藍莓葉多酚和阿卡波糖對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用與其活性成分含量有關。對其添加濃度(X)與抑制率(Y)之間的關系建立線性回歸方程，并計算IC50值(見表4)。藍莓葉多酚對α-淀粉酶的IC50值(10.926 μg/mL)大于α-葡萄糖苷酶的IC50值(7.276 μg/mL)，表明藍莓葉多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制率達到50%所需濃度低于對同等酶活下的α-淀粉酶抑制率達到50%所需濃度，即在此范圍內，藍莓葉多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制活性高于同等濃度的α-淀粉酶的抑制活性。

表4 藍莓葉多酚和阿卡波糖對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用(IC50)比較

圖4 藍莓葉多酚和阿卡波糖對α-淀粉酶(A)和α-葡萄糖苷酶(B)的抑制作用

阿卡波糖對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的IC50值低于藍莓葉多酚的，可知藍莓葉多酚抑制效果不及阿卡波糖，這可能與藍莓葉多酚提取純度不高有關。由“2.1”結果可知，純化后藍莓葉多酚純度為36%，遠低于阿卡波糖純度(98%)。本文采用的純化方法只粗略除去了水溶性雜質，而洗脫劑的選擇、吸附流速、樣品液濃度、洗脫流速等因素對純化效果有一定的影響。為提高藍莓葉多酚的體外降血糖活性，還需進一步優(yōu)化純化條件和方法。阿卡波糖應用于臨床，患者服用此藥物會有類似腹脹、腹瀉的情況[9]。而從藍莓葉中提取的多酚是一種天然植物活性物質，用于降血糖食品藥品研發(fā)更具安全性。

2.6 藍莓葉多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制類型

最后通過紫外光譜法研究了藍莓葉多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制動力學，探究藍莓葉多酚濃度、酶濃度與酶解速率之間的關系，判斷抑制作用是否可逆。如圖5A和5D所示，所有直線都基本過原點。隨著藍莓葉多酚濃度增加，直線斜率逐漸下降，說明藍莓葉多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用是可逆性的[21]。

為確定藍莓葉多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的可逆抑制類型，按照Lineweaver-Burk和Dixon雙倒數(shù)曲線作圖法，探究藍莓葉多酚濃度、底物濃度與酶解速率之間的關系，確定抑制類型和抑制常數(shù)。由圖5B、5C、5E和5F可知，反應體系中隨著抑制劑濃度降低，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的酶解反應速率明顯升高。隨著底物濃度的增加，酶解反應速率也在增加，并逐漸接近最大反應速率Vmax。這一結果說明藍莓葉多酚能夠競爭底物，優(yōu)先與酶相結合形成復合物，從而使酶失活[22]。通過Lineweaver-Burk圖監(jiān)測米氏常數(shù)Km和最大酶解速率Vmax值的變化，斜率為Km和Vmax的比值，y軸截距為1/Vmax值，直線斜率隨藍莓葉多酚濃度增大而增大。通過Dixon圖可以看出隨著藍莓葉多酚濃度增大，x軸截距減小，y軸截距增大，即Vmax值減小，Km增大。不同濃度多酚直線分別相交于第二象限和第三象限的一點，交點接近y軸，這種特征符合混合型抑制，藍莓葉多酚屬于混合型抑制劑。隨著抑制劑濃度增加，由于α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶被抑制改變了Vmax和Km值，表明藍莓葉多酚對酶具有完整且單一的抑制位點或單一類別的抑制位點[23]，從而更容易與酶結合改變酶的活性中心構象，抑制α-淀粉酶與淀粉生成葡萄糖，α-葡萄糖苷酶與對硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)生成葡萄糖和對硝基苯酚(pNP)。這與阿卡波糖對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果是相同的[24]。根據(jù)Zhang[25]中所述，Lineweaver-Burk圖中交點橫坐標絕對值為競爭性抑制常數(shù)Kic值，而Dixon圖中交點橫坐標絕對值為非競爭性抑制常數(shù)Kiu。通過計算得出藍莓葉多酚對α-淀粉酶的Kic為1.041 5 mg/mL，Kiu為0.150 4 mg/mL。對α-葡萄糖苷酶的Kic為0.222 9 mg/mL，Kiu為0.004 1 mg/mL。其競爭性常數(shù)>非競爭性常數(shù)，說明藍莓葉多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶都是競爭性大于非競爭性的混合可逆性抑制類型。而Kic和Kiu值越低，1/Kic和1/Kiu值越高，表明抑制劑與酶的結合越強。α-淀粉酶的Kic和Kiu值比α-葡萄糖苷酶的高，則說明藍莓葉多酚與α-葡萄糖苷酶結合力比α-淀粉酶結合力強。

圖5 藍莓葉多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制動力學

3 結論

本文研究的藍莓葉多酚提取物中主要成分有綠原酸、5,6,7,3′,4′-五氫化二異黃酮、槲皮素、原花青素等。體外降血糖活性評價顯示，藍莓葉多酚具有較好的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用，且抑制活性與總酚含量成正相關。通過探究溫度和pH對藍莓葉多酚抑制活性的影響，可知藍莓葉多酚在低溫(30～50 ℃)和偏酸性(pH 2.0～8.0和3.0～5.0)環(huán)境下比較穩(wěn)定，能夠保持較高的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性。藍莓葉多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度IC50分別為10.926和7.276 μg/mL，此外動力學研究結果，發(fā)現(xiàn)其對兩個酶的抑制類型均為競爭性大于非競爭性的混合性可逆抑制。

綜上所述，藍莓葉中多酚含量豐富，具有較好的體外α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用，揭示了藍莓葉多酚具有潛在的降血糖作用，為藍莓葉相關產品研發(fā)提供了一定的理論基礎。