張博銳，馬倩倩，王雯藝，張石蕾，劉 濤，趙 軍，馬 龍*

1新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，烏魯木齊 830054；2新疆藥物研究所維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830004

肝臟作為人體重要的消化腺，一旦發(fā)生病變將影響人體正常的代謝功能[1]。研究顯示[2]，形成肝癌的重要途徑是肝纖維化(liver fibrosis)。肝臟受到刺激時(shí)，免疫細(xì)胞則分泌大量免疫調(diào)控因子，導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞活化、增殖，合成大量膠原，在肝內(nèi)沉積大量細(xì)胞外基質(zhì)，造成纖維化形成[3]。因此，在肝臟病變過(guò)程的任何一個(gè)階段進(jìn)行控制，都可能會(huì)減輕肝臟疾病的損傷，治療肝纖維化的研究顯得十分重要[4]。近些年來(lái)，有研究表明[5]，肉蓯蓉治療肝病具有明顯療效，在治療肝纖維化的方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。

新疆道地藥材肉蓯蓉(Cistanches Herba)素有“沙漠人參”之稱，臨床應(yīng)用已有數(shù)千年的歷史[6]?，F(xiàn)代研究表明[7]，其具有抵抗衰老、保護(hù)肝臟、緩解疲勞、抗骨質(zhì)疏松、潤(rùn)腸通便等多種生物活性。You等[8]研究表明，肉蓯蓉苯乙醇苷能緩解肝臟纖維化程度。Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，肝臟星狀細(xì)胞的活化及肝纖維化能被肉蓯蓉苯乙醇苷脂質(zhì)體抑制。然而目前對(duì)于肉蓯蓉治療肝纖維化的藥理作用及其機(jī)制尚不明確且有待闡明。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“成分-疾病-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖[10]，再進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用和靶點(diǎn)富集分析[11]，最終預(yù)測(cè)肉蓯蓉治療肝纖維化的相關(guān)靶點(diǎn)和通路，通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，為肉蓯蓉有效成分治療肝纖維化的藥理作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 篩選肉蓯蓉活性成分相關(guān)靶點(diǎn)

1.1.1 肉蓯蓉化學(xué)活性成分的篩選

以“肉蓯蓉”作為檢索詞，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)中篩選出口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18的成分作為活性成分[12]，再結(jié)合中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)(ETCM，http://www.tcmip.cn)、中醫(yī)藥研究綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMID，ttp://www.megabionet.org/tcmid/)、CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.cnki.net/)、PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行肉蓯蓉有關(guān)成分補(bǔ)充。

1.1.2 肉蓯蓉活性成分及肝纖維化疾病靶點(diǎn)

使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)，篩選肉蓯蓉活性成分對(duì)應(yīng)的蛋白靶點(diǎn)[13]。再利用基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards，https://www.Genecards.org/)和孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM，https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)，以“肝纖維化”作為關(guān)鍵詞檢索，在數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得相關(guān)的蛋白靶點(diǎn)，最終獲得兩者共同的蛋白靶點(diǎn)[14]。

1.1.3 “肉蓯蓉活性成分-肝纖維化-蛋白靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

利用String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/)構(gòu)建“肉蓯蓉活性成分-肝纖維化-蛋白靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行可視化處理[15]。其中每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表基因、蛋白或活性成分，節(jié)點(diǎn)之間的連接代表活性成分與相關(guān)靶點(diǎn)之間的聯(lián)系，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中度值(degree)分析網(wǎng)絡(luò)中的核心基因，最終獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.1.4 GO、KEGG富集分析

David數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)導(dǎo)入肉蓯蓉治療肝纖維化的靶點(diǎn)，進(jìn)行GO、KEGG富集分析，根據(jù)Count數(shù)值進(jìn)行篩選[16]。

1.1.5 分子對(duì)接

通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取肉蓯蓉主要活性成分的2D化學(xué)結(jié)構(gòu)，在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)中查找相關(guān)核心靶點(diǎn)蛋白3D結(jié)構(gòu)，通過(guò)Autodock軟件進(jìn)行分子對(duì)接，獲取結(jié)合能最高的位點(diǎn)，最后通過(guò)Pymol軟件進(jìn)行可視化處理。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種雄性小鼠60只，SPF級(jí)，體重18～22 g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(新)2018-0002，使用許可證號(hào)為SYXK(新)2018-0003，倫理審批號(hào)：IACUC-20210326-10。

1.2.2 主要試劑

肉蓯蓉苯乙醇苷(CPhGs)(購(gòu)于新疆和田帝辰醫(yī)藥生物有限公司，批號(hào)：20180502)；復(fù)方鱉甲軟肝片(蒙古福瑞科技股份有限公司產(chǎn)品)；小鼠層粘連蛋白(LN)、小鼠透明質(zhì)酸(HA)、小鼠III型前膠原(PCIII)、小鼠IV型膠原(Col IV)酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒(北京江萊試劑公司，批號(hào)：JL20286-96T、JL2406-96T、JL20169-96T、JL20128-96T)；Masson三色染色液(珠海貝索，批號(hào)：20210115)；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(索萊寶HE染色試劑盒G1120)；SuperReal熒光定量預(yù)混試劑彩色版(SYBR Green，天根FP205-02)；FastKing RT Kit(With gDNase，天根KR116-02)；Transzol up(全式金ET111-01)。

1.2.3 主要儀器

HZQ-C全濕恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；DK-8D電熱恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司)；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；Varioskan Flash酶標(biāo)儀、QuantStudio 6實(shí)時(shí)熒光PCR儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；Retsch萊馳高通量組織研磨儀MM400；ST5020多功能染色機(jī)(上海徠卡貿(mào)易有限公司)。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)方法

動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(840 mg/kg)、CPhGs高劑量組(CPhGs-H，700 mg/kg)、中劑量組(CPhGs-M，350 mg/kg)、低劑量組(CPhGs-L，175 mg/kg)；陽(yáng)性對(duì)照組給予復(fù)方鱉甲軟肝片，參照藥品說(shuō)明書(一次4片，一天3次；每片0.5 g)和人民軍醫(yī)出版社出版的《機(jī)能實(shí)驗(yàn)教程》，進(jìn)行人和小鼠體重等效劑量換算；CPhGs高、中、低劑量組根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[17]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，大鼠CPhGs高、中、低劑量組(500、250、125 mg/kg)，依據(jù)大鼠與小鼠用藥劑量換算比例1∶1.4，換算小鼠給藥劑量CPhGs高、中、低劑量組(700、350、175 mg/kg)，每組各10只；正常對(duì)照組注射等量生理鹽水，其余各組小鼠均經(jīng)腹腔注射10%的CCl4橄欖油溶液(5 mL/kg)，1周注射2次，注射8周，建立肝纖維化小鼠模型；正常對(duì)照組、模型組灌胃給予蒸餾水，其余各組均按設(shè)定劑量灌胃給藥8周[18]。

1.2.5 生化指標(biāo)檢測(cè)

ELISA法以酶標(biāo)儀檢測(cè)肝組織勻漿中LN、HA、PCIII、Col IV的含量，嚴(yán)格遵守試劑盒的說(shuō)明。

1.2.6 肝組織病理學(xué)觀察

肝組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定、乙醇脫水、石蠟包埋后切片，進(jìn)行HE、Masson染色，觀察肝組織切片。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)PI3K、AKT mRNA的轉(zhuǎn)錄情況

取出小鼠肝組織并加入Transzol up試劑提取小鼠肝臟組織總RNA，采用RT-PCR法測(cè)定小鼠肝臟PI3K、AKT的mRNA轉(zhuǎn)錄情況。相關(guān)基因序列見表1。

表1 引物序列

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 篩選肉蓯蓉有效成分

篩選出肉蓯蓉已知成分75種，設(shè)定OB≥30%、DL≥0.18為篩選的閾值，得到8個(gè)符合條件的活性成分：β-谷甾醇(β-sitosterol)、花生四烯酸(arachidonate)、蘇齊內(nèi)酯(suchilactone)、鵝掌楸樹脂酚B二甲醚(yangambin)、槲皮素(quercetin)、丁派卡因(marckine)、毛蕊花糖苷(acteoside)、松果菊苷(echinacoside)，通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)共得到157個(gè)靶點(diǎn)基因(見圖1)。

圖1 肉蓯蓉-有效成分-靶點(diǎn)圖

2.2 “肉蓯蓉活性成分-肝纖維化-蛋白靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

檢索GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲得肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)1 005個(gè)，將篩選出來(lái)的肉蓯蓉157個(gè)潛在蛋白靶點(diǎn)和疾病肝纖維化相關(guān)的1 005個(gè)蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行去重處理，繪制韋恩圖(見圖2)，將92個(gè)共同靶點(diǎn)，導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行可視化處理構(gòu)建“肉蓯蓉活性成分-肝纖維化-蛋白靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)(見圖3)，其中核心靶點(diǎn)為：AKT、ICAM1、MMP9、BCL-2、ADRB2、CASP3、JUN、PON1、PIK3CG、RXRA、CASP8、PPARG、BAX、NOS3、PRKCA、TGFB1、CASP9等。degree>50作為閾值，根據(jù)degree和combine score值大小繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(見圖4)。

圖2 肉蓯蓉治療肝纖維化的藥物-疾病共同靶點(diǎn)韋恩圖

圖3 肉蓯蓉治療肝纖維化的“成分-共同靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO、KEGG富集分析

通過(guò)David數(shù)據(jù)庫(kù)，將肉蓯蓉治療肝纖維化的92個(gè)蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集分析(見圖5)。分別選取細(xì)胞組分、生物過(guò)程和分子功能Count值排名前十的條目。其中生物過(guò)程涉及DNA轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、負(fù)調(diào)控凋亡過(guò)程、衰老、炎癥反應(yīng)、對(duì)細(xì)胞增殖的正調(diào)控、凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)等；分子功能主要包括酶、蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和相同蛋白的結(jié)合、DNA結(jié)合、鋅離子結(jié)合等；細(xì)胞組分主要包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外環(huán)境、等離子體膜、細(xì)胞膜、線粒體等。通過(guò)David數(shù)據(jù)庫(kù)并根據(jù)Count值篩選出前20條通路，對(duì)肉蓯蓉治療肝纖維化的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析(見圖6)，得到的主要通路有：PI3K-AKT(見圖7)、TNF信號(hào)通路、HBV信號(hào)通路等。

圖5 肉蓯蓉治療肝纖維化的潛在作用靶點(diǎn)的GO分析

圖6 KEGG信號(hào)通路富集分析

圖7 肉蓯蓉治療肝纖維化作用的PI3K-AKT通路

2.4 構(gòu)建肉蓯蓉活性成分-肝纖維化-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

可視化處理構(gòu)建“肉蓯蓉活性成分-肝纖維化-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)(見圖8)。

圖8 肉蓯蓉活性成分-肝纖維化-蛋白靶點(diǎn)-通路

2.5 肉蓯蓉治療肝纖維化的活性成分分子對(duì)接結(jié)果

通過(guò)Autodock軟件對(duì)肉蓯蓉最重要的2種活性成分毛蕊花糖苷、松果菊苷與關(guān)鍵白蛋靶點(diǎn)ICAM1、AKT1、MMP9進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合能見表2。將結(jié)果導(dǎo)入Pymol軟件進(jìn)行可視化，分子對(duì)接結(jié)果顯示，毛蕊花糖苷與AKT在ASN-54、TYR-272、LYS-297位置處形成氫鍵；毛蕊花糖苷與ICAM1在GLN-168、LYS-8、ILE-10位置處形成氫鍵；毛蕊花糖苷與MMP9在LEU-188、ALA-189、GLU-227、HIS-230、HIS-236、HIS-226位置處形成氫鍵；松果菊苷與AKT在GLU-356、HIS-297、ASN-296、ALA-226、LYS-294、GLU-228位置處形成氫鍵；松果菊苷與ICAM1在DA-7、DT-8、DT-11、DT-12、DC-13位置處形成氫鍵；毛蕊花糖苷與MMP9在HIS-230、HIS-236、HIS-226、GLU-227、ALA-189、LEU-188、TYR-248位置處形成氫鍵(見圖9)。

表2 主要活性成分與關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)結(jié)合能

圖9 分子對(duì)接結(jié)果

2.6 各組小鼠LN、HA、PCIII、Col IV含量的差異

模型組與正常組相比LN、HA、PCIII、Col IV含量升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；CPhGs高、中、低劑量組與模型組相比明顯降低LN、HA、PCIII、Col IV含量(P<0.01)，結(jié)果說(shuō)明CPhGs具有抗肝纖維化的作用(見表3)。

表3 各組小鼠LN、HA、PCIII、CoL IV含量的差異

2.7 肝組織病理學(xué)觀察

HE染色(見圖10)：正常組肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無(wú)變性壞死的肝細(xì)胞及炎細(xì)胞分布，匯管區(qū)清晰可見，中央靜脈周圍有放射整齊排列的肝細(xì)胞。模型組有明顯的肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死、增殖、水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)和大量嗜酸性顆粒。高、中、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組肝細(xì)胞壞死程度較輕，嗜酸性顆粒明顯減少。

圖10 CPhGs對(duì)CCl4致肝纖維化小鼠肝組織病理學(xué)改變的影響

Masson染色(見圖11)：正常組肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，膠原染色后僅見血管壁有少量膠原纖維；模型組出現(xiàn)大量藍(lán)色纖維形成的假小葉包繞匯管區(qū)，可見大量空泡的形成。高、中、低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組可顯著降低肝臟組織肝纖維化水平，匯管區(qū)周圍藍(lán)色纖維明顯減少。

圖11 CPhGs對(duì)CCl4致肝纖維化小鼠肝組織膠原纖維改變的影響

2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)PI3K、AKT mRNA的表達(dá)

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織中PI3K、AKT mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01)；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及肉蓯蓉苯乙醇總苷高、中、低劑量組中PI3K、AKT mRNA表達(dá)量顯著減少(P<0.01)(見表4)。

表4 小鼠肝組織PI3K、AKT mRNA轉(zhuǎn)錄

3 討論與結(jié)論

肝纖維化的發(fā)展過(guò)程復(fù)雜，各細(xì)胞因子及各細(xì)胞通路之間相互“交流”、相互影響，形成了一個(gè)相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。因此單靶點(diǎn)、單通路治療很難起效，中藥具有多成分、多作用靶點(diǎn)和作用途徑復(fù)雜等特點(diǎn)，從而系統(tǒng)地對(duì)人體進(jìn)行調(diào)節(jié)。肉蓯蓉具有保護(hù)肝臟的作用，通過(guò)中藥數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP等數(shù)據(jù)庫(kù)得到肉蓯蓉有效成分：毛蕊花糖苷、松果菊苷、β-谷甾醇、花生四烯酸、蘇齊內(nèi)酯、鵝掌楸樹脂酚B二甲醚、槲皮素、丁派卡因。有研究表明[19]，肉蓯蓉苯乙醇苷類是肉蓯蓉主要活性成分，其中松果菊苷、毛蕊花糖苷被認(rèn)為是肉蓯蓉發(fā)揮藥效的主要生物活性成分，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)我們得到毛蕊花糖苷和松果菊苷作用與肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)，并通過(guò)分子對(duì)接進(jìn)行驗(yàn)證。

松果菊苷、毛蕊花糖苷作為肉蓯蓉中主要成分，通過(guò)調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗肝纖維化的作用[20]。ICAM1、AKT、MMP9可能是松果菊苷、毛蕊花糖苷治療肝纖維化的作用靶點(diǎn)，ICAM1作為一種細(xì)胞黏附因子，肝臟損傷的情況下會(huì)大量表達(dá)，可以通過(guò)抑制ICAM1過(guò)表達(dá)，抑制肝纖維化的發(fā)展[21]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)是PI3K下游的一個(gè)重要靶激酶，活化的AKT進(jìn)一步激活，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞增殖，加速肝纖維化的進(jìn)展，相反通過(guò)抑制AKT則會(huì)抑制肝纖維化的發(fā)生[22]；MMP-9可降解正常肝臟膠原基質(zhì)，破壞肝細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化、分泌大量的膠原蛋白，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展，相反通過(guò)抑制MMP-9則會(huì)抑制肝纖維化的發(fā)生[23]；本實(shí)驗(yàn)使用CCl4建立肝纖維化小鼠模型是經(jīng)典的造模方法之一，CCl4通過(guò)腹腔注射進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，相比較正常組，模型組小鼠LN、HA、PCIII、Col IV含量明顯升高；相對(duì)于模型組，CPhGs高、中、低劑量組明顯降低LN、HA、PCIII、Col IV含量；HE和Masson檢測(cè)結(jié)果表明：與模型組比較，CPhGs高、中、低劑量組肝細(xì)胞壞死程度較輕，嗜酸性顆粒明顯減少，匯管區(qū)周圍藍(lán)色纖維明顯減少。以上結(jié)果說(shuō)明肉蓯蓉苯乙醇總苷抑制肝纖維化的進(jìn)展可能與ICAM1、AKT、MMP9靶點(diǎn)有關(guān)，需要進(jìn)一步對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

肝纖維化的產(chǎn)生由多種因素引起，其中PI3K-AKT通路是由通路富集分析獲得排名靠前的通路，PI3K-AKT信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡、誘導(dǎo)人類腫瘤發(fā)生、乙肝病毒基因的轉(zhuǎn)錄、是治療肝纖維的重要通路之一[24]。PI3K-AKT通路能激活肝血管的形成，改善血供，重建細(xì)胞外基質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，抑制肝細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，從而導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生[25]。松果菊苷、毛蕊花糖分別可以通過(guò)調(diào)節(jié)ICAM1、AKT、MMP9靶點(diǎn)抑制肝臟細(xì)胞的增殖和活化，肉蓯蓉苯乙醇總苷可能通過(guò)參與肝臟細(xì)胞的能量代謝、增殖、凋亡三個(gè)方面干預(yù)肝臟纖維化的進(jìn)展，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)表明：與正常組相比，模型組小鼠肝組織中PI3K、AKT mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)；與模型組相比，肉蓯蓉苯乙醇總苷高、中、低劑量組中PI3K、AKT mRNA表達(dá)量顯著減少，其機(jī)制可能抑制PI3K-AKT通路的激活，延緩肝纖維化的進(jìn)展。

綜上所述，肉蓯蓉苯乙醇總苷可以有效緩解CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化，其機(jī)制可能與PI3K-AKT信號(hào)通路介導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞的增殖活化有關(guān)，本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入探討肉蓯蓉的中藥藥理作用奠定基礎(chǔ)。