謝敬儀　王琪　王濤　錢麗麗

[摘要]目的探究E3泛素連接酶FBXO40在心肌細胞增殖過程中的調(diào)控作用。方法轉(zhuǎn)染si-FBXO40小干擾RNA和FBXO40過表達載體分別敲低和過表達原代心肌細胞中的FBXO40，利用實時定量PCR（qPCR）方法檢測經(jīng)上述處理后原代心肌細胞中增殖相關標記基因（cdc20、Cyr61、Ccna2、Aurkb）的表達水平;轉(zhuǎn)染FBXO40過表達載體以及si-FBXO40小干擾RNA，在24 h后利用CCK-8方法進一步檢測原代心肌細胞增殖情況。結(jié)果與對照組相比，過表達FBXO40的原代心肌細胞中與細胞增殖相關基因Ccna2、Cdc20、Aurkb和Cyr61的表達明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（t=2.20～3.90，P<0.05）。與對照組相比，敲低FBXO40表達的原代心肌細胞中促增殖基因Cyr61的表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（t=10.96，P<0.05）。CCK-8檢測顯示，F(xiàn)BXO40過表達組的吸光度值高于對照組，敲低組的吸光度值低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（F=6.72，P<0.05）。結(jié)論FBXO40在心肌細胞增殖過程中具有重要的調(diào)控作用，可促進心肌細胞增殖。

[關鍵詞]泛素蛋白連接酶類;FBXO40;肌細胞，心臟;細胞增殖

[中圖分類號]R345.9;R329.25[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2022）02-0201-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.047[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡出版]https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20220311.1333.003.html;2022-03-1415：16：03

EFFECT OF FBXO40 ON THE PROLIFERATION OF CARDIOMYOCYTES? XIE Jingyi， WANG Qi， WANG Tao， QIAN Lili （Institute of Translational Medicine， Qingdao University Meadical College， Qingdao 266021， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the regulatory role of the E3 ubiquitin ligase FBXO40 in the process of cardiomyocyte proliferation. MethodsPrimary cardiomyocytes were transfected with si-FBXO40 small-interfering RNA or FBXO40 overexpression vector to knock down FBXO40 or induce the overexpression of FBXO40. Quantitative real-time PCR was used to mea-sure the mRNA expression levels of proliferation-related markers （Cdc20， Cyr61， Ccna2， and Aurkb） in the primary cardiomyocytes after the above treatment， and CCK-8 assay was used to measure the proliferation of primary cardiomyocytes at 24 hours after transfection with FBXO40 overexpression vector or si-FBXO40 small-interfering RNA. ResultsCompared with the control group， the primary cardiomyocytes with FBXO40 overexpression had significant increases in the expression of proliferation-related genes （Ccna2， Cdc20， Aurkb， and Cyr61） （t=2.20-3.90，P<0.05）， while the primary cardiomyocytes with FBXO40 knock-down had a significant reduction in the expression of the proliferation-promoting gene Cyr61 （t=10.96，P<0.05）. CCK-8 assay showed that compared with the control group， the FBXO40 overexpression group had a significantly higher absorbance value and the FBXO40 knock-down group had a significantly lower absorbance value （F=6.72，P<0.05）. ConclusionFBXO40 plays an important role in regulating the proliferation of cardiomyocytes and can promote the proliferation of cardiomyocytes.

[KEY WORDS]ubiquitin-protein ligases; FBXO40; myocytes， cardiac; cell proliferation

嚴格的蛋白質(zhì)控制在心臟的發(fā)育與功能維持方面發(fā)揮重要作用，蛋白質(zhì)代謝或運輸異常存在于多種心臟疾病中。泛素蛋白酶體系統(tǒng)在調(diào)控錯誤折疊蛋白或損傷蛋白降解方面發(fā)揮重要作用，其中，E3泛素連接酶尤為重要，它通過對細胞關鍵蛋白的識別、相互作用和泛素化，在細胞增殖和分化等過程中發(fā)揮著關鍵作用[1]。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，泛素連接酶參與細胞增殖的調(diào)控，細胞周期調(diào)節(jié)因子（其中許多具有腫瘤抑制或致癌功能）的破壞與癌癥的發(fā)生進展密切相關;癌抑制蛋白的非正常或快速降解，或者是癌蛋白的大量堆積，都會導致癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)化。2006年，NAKAYAMA等[2]發(fā)現(xiàn)，Skp1-Cul1-F-box（SCF） E3泛素連接酶復合體的特異性泛素化導致細胞增殖、基因組不穩(wěn)定甚至是癌癥。2016年，LIU等[3]研究表明，泛素蛋白酶FAT10可調(diào)控癌細胞的增殖。2020年，GUO等[4]研究表明，泛素蛋白酶HRD1在谷氨酰胺缺乏的條件下可特異性抑制三陰性乳癌細胞增殖。

F-box蛋白是E3泛素連接酶的一種，F(xiàn)BXO40是2007年發(fā)現(xiàn)的一種F-box蛋白，其在骨骼肌和心肌中特異性高表達，而且在去神經(jīng)性肌肉萎縮樣本中的表達也顯著上調(diào)[5]。2011年SHI等[6]研究結(jié)果表明，SCF-FBXO40復合體在骨骼肌中通過誘導胰島素受體底物1（IRS1）蛋白降解來抑制胰島素樣生長因子1（IGF1）誘導的骨骼肌肥大信號通路。然而，F(xiàn)BXO40在心肌中的研究尚未見報道。本研究旨在探討FBXO40對心肌細胞增殖是否具有調(diào)控作用以及發(fā)揮怎樣的作用，以期為心肌疾病的治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1主要材料

DMEM-F12培養(yǎng)液、PBS緩沖液（美倫生物公司），胎牛血清（BI公司），Trizol總RNA提取試劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green預混型實時定量PCR（qPCR）試劑盒（艾瑞克生物公司），胰液素（美國Sigma公司），Ⅱ型膠原酶（美國Worthington公司），DEPC原液、qPCR引物（擎科生物公司），siRNA序列及NC對照序列（上海吉瑪生物科技有限公司），Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司），CCK-8試劑盒（同仁化學研究所）。

1.2實驗方法

1.2.1原代心肌細胞培養(yǎng)解剖大鼠乳鼠取出心臟，在PBS緩沖液中洗滌至無血污;將心臟剪碎后置于含有胰液素和膠原酶的消化工作液中（用PBS液加到50 mL），在37 ℃恒溫水浴鍋中消化6～8 min，收集每次消化后的上清液，剩余組織加入5 mL消化液繼續(xù)消化，直至組織塊被完全消化;將上清液收集到離心管中以800～1 000 r/min離心5～6 min，棄上清，將沉淀的細胞加入DMEM-F12培養(yǎng)液（加青霉素/鏈霉素雙抗）中吹打混勻清洗后，再次離心去上清，將剩余沉淀再次懸浮于DMEM-F12培養(yǎng)液（加青霉素/鏈霉素雙抗）中，經(jīng)260目過濾網(wǎng)過濾到培養(yǎng)皿，在37 ℃細胞培養(yǎng)箱中差速貼壁培養(yǎng)1.5～2.0 h，最后接種于細胞培養(yǎng)皿中。整個過程在超凈工作臺中進行無菌操作。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染當原代心肌細胞密度達60%～70%時可進行轉(zhuǎn)染。實驗分為對照組、敲低組和過表達組。對照組細胞不做處理。敲低組先將溶解的3.5 μL si-FBXO40小干擾RNA加入到125 μL無血清DMEM-F12培養(yǎng)液中混勻（標為1號管），過表達組則先將2.5 μL的FBXO40過表達載體加入到125 μL無血清DMEM-F12培養(yǎng)液中混勻（2號管），置室溫3～5 min;將7 μL Lipofectamin 3000加入250 μL無血清DMEM-F12培養(yǎng)液中混勻（3號管），室溫放置3～5 min;將3號管中試劑按1∶1的比例分入1號、2號管中混勻，室溫下靜置20～25 min;敲低組和過表達組分別將1號、2號管中液體加入到細胞培養(yǎng)皿中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，進行后續(xù)檢測。

1.2.3qPCR檢測增殖相關基因的表達用Trizol試劑提取原代心肌細胞總RNA，測定RNA濃度及純度，進行反轉(zhuǎn)錄和qPCR。模板cDNA使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建，qPCR體系根據(jù)試劑盒說明書設置。引物序列見表1。將qPCR的定量結(jié)果標準化，以GAPDH為內(nèi)參對照，計算Cdc20、Ccna2、Cyr61和Aurkb基因的相對表達量。實驗至少重復3次。

1.2.4CCK-8法檢測細胞增殖將原代心肌細胞懸液接種于96孔板中（每孔約1×104個細胞），分為對照組、敲低組和過表達組，每組設置5個復孔，各組細胞的處理同1.2.2。細胞培養(yǎng)24 h后進行CCK-8檢測，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h后，用酶標儀測量450 nm波長處的吸光度值。實驗重復3次[7]。

1.3統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組比較采用成組t檢驗，多組比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1過表達FBXO40后心肌細胞中增殖相關基因的表達變化

qPCR檢測結(jié)果顯示，過表達組細胞成功誘導FBXO40過表達（t=45.22，P<0.01）;與對照組相比較，過表達組原代心肌細胞中與細胞增殖相關基因Ccna2、Cdc20、Aurkb和Cyr61的表達均明顯上調(diào)（t=2.20～3.90，P<0.05）。見表2。

2.2敲低FBXO40后心肌細胞中Cyr61基因的表達變化

qPCR檢測結(jié)果顯示，敲低組的原代心肌細胞中成功轉(zhuǎn)染si-FBXO40小干擾RNA（t=8.27，P<0.05）;與對照組相比，敲低組原代心肌細胞中促增殖基因Cyr61的表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（t=10.96，P<0.05）。見表3。

2.3FBXO40對心肌細胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染24 h后CCK-8檢測結(jié)果顯示，對照組、過表達組和敲低組的吸光度值分別為0.191±0.005、0.205±0.002和0.154±0.030（n=3），過表達組的吸光度值高于對照組，敲低組的吸光度值低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（F=6.72，P<0.05）。表明敲低FBXO40會抑制原代心肌細胞增殖，而過表達FBXO40能促進細胞增殖。

3討論

泛素蛋白酶體系統(tǒng)參與多種細胞過程的調(diào)控，如細胞增殖、細胞周期進程、轉(zhuǎn)錄和凋亡等[8-11]。在細胞增殖過程中細胞的有絲分裂周期是一個被嚴格調(diào)控的過程，有絲分裂的進程復雜，需要通過泛素連接酶的復雜催化和蛋白酶復合體對底物的降解來調(diào)節(jié)細胞周期[12]。細胞周期調(diào)控過程主要是周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的連續(xù)性激活，通過CDKs以及周期蛋白激酶抑制劑（CKIs）的泛素介導來實現(xiàn)蛋白質(zhì)的水解。在真核細胞中，E3泛素連接酶的兩個家族，即后期促進復合物和SCF蛋白復合體，負責許多CDKs調(diào)節(jié)因子的泛素化和蛋白酶體降解，確保細胞周期的精確調(diào)控[13-14]。在過去的幾十年里，越來越多的證據(jù)表明，由于蛋白水解控制不力而導致的細胞周期轉(zhuǎn)變異常，導致細胞增殖失控，最終影響身體功能甚至是發(fā)生癌變[15-17]。一些泛素化因子通過調(diào)控細胞增殖以及細胞周期進程來參與心血管疾病的治療[18]。因此，更好地理解細胞增殖，了解細胞周期調(diào)控中泛素信號的多樣性和復雜性，將為精確控制細胞周期進程和解決癌癥或心血管疾病的臨床治療問題提供新的思路。

E3泛素連接酶在蛋白質(zhì)代謝中發(fā)揮重要的作用，F(xiàn)-box蛋白作為一種E3泛素連接酶是SCF的重要組成部分，它通過F-box結(jié)構(gòu)域與Skp1相互作用，并通過其他相互作用區(qū)域與蛋白結(jié)合并使其泛素化進而介導蛋白水解[19]。F-box蛋白根據(jù)其特異性底物識別域可分為3個亞類：FBXW亞類含有WD40重復結(jié)構(gòu)域，由10個成員組成;FBXL亞類富含亮氨酸重復結(jié)構(gòu)域，有22個家族成員;其余37種F-box蛋白被指定為FBXO蛋白，其中包含各種尚未被完全鑒定的結(jié)構(gòu)域[20-23]。FBXO40蛋白是2007年發(fā)現(xiàn)的一種F-box蛋白。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXO40在骨骼肌和心肌中特異性高表達[5]，然而FBXO40在心肌中的作用未見報道。本研究通過體外實驗，初步探究了FBXO40在心肌細胞增殖過程中是否具有調(diào)控作用，以及具有怎樣的調(diào)控作用。本研究首先采用qPCR方法檢測過表達FBXO40后原代心肌細胞中增殖相關基因的表達變化，結(jié)果顯示，在原代心肌細胞中過表達FBXO40后，與細胞增殖相關的基因Ccna2、Cdc20、Aurkb、Cyr61的表達均顯著上調(diào)，提示FBXO40具有促進心肌細胞增殖的作用。隨后，本研究又通過敲低原代心肌細胞中的FBXO40表達，分別采用qPCR和CCK-8方法檢測了具有促增殖作用的基因Cyr61相對表達量的變化以及細胞增殖情況，結(jié)果顯示，與過表達FBXO40相反，敲低FBXO40表現(xiàn)出抑制細胞增殖的作用，進一步驗證了FBXO40對細胞增殖具有促進作用。在后續(xù)工作中我們將進一步探究FBXO40在心肌細胞增殖中的具體調(diào)控通路，為心血管疾病的預防治療提供新的靶標。

[參考文獻]

[1]DENG L， MENG T， CHEN L， et al. The role of ubiquitination in tumorigenesis and targeted drug discovery[J].? Signal Transduction and Targeted Therapy， 2020，5（1）：11.

[2]NAKAYAMA K I， NAKAYAMA K. Ubiquitin ligases： cell-cycle control and cancer[J].? Nature Reviews Cancer， 2006，6（5）：369-381.

[3]LIU X X， CHEN L F， GE J， et al. The ubiquitin-like protein FAT10 stabilizes eEF1A1 expression to promote tumor proli-feration in a complex manner[J].? Cancer Research， 2016，76（16）：4897-4907.

[4]GUO X， WANG A， WANG W， et al. HRD1 inhibits fatty acid oxidation and tumorigenesis by ubiquitinating CPT2 in triple-negative breast cancer[J].? Molecular Oncology， 2021，15（2）：642-656.

[5]YE J W， ZHANG Y， XU J L， et al. FBXO40， a gene encoding a novel muscle-specific F-box protein， is upregulated in denervation-related muscle atrophy[J].? Gene， 2007，404（1/2）：53-60.

[6]SHI J， LUO L Q， EASH J， et al. The SCF-Fbxo40 complex induces IRS1 ubiquitination in skeletal muscle， limiting IGF1 signaling[J].? Developmental Cell， 2011，21（5）：835-847.

[7]SARRI E， RAMOS B， SALIDO G M， et al. The cholecystokinin analogues JMV-180 and CCK-8 stimulate phospholipase C through the same binding site of CCK（A） receptor in rat pancreatic acini[J].? British Journal of Pharmacology， 2001，133（8）：1227-1234.

[8]ZOU T T， LIN Z H. The involvement of ubiquitination machinery in cell cycle regulation and cancer progression[J].? International Journal of Molecular Sciences， 2021，22（11）：5754.

[9]TIWARI S， ROEL C， WILLS R， et al. Early and late G1/S cyclins and cdks act complementarily to enhance authentic human β-cell proliferation and expansion[J].? Diabetes， 2015，64（10）：3485-3498.

[10]BUDHIDARMO R， DAY C L. The ubiquitin-associated domain of cellular inhibitor of apoptosis proteins facilitates ubi-quitylation[J].? The Journal of Biological Chemistry， 2014，289（37）：25721-25736.

[11]EE G， LEHMING N. How the ubiquitin proteasome system regulates the regulators of transcription[J].? Transcription， 2012，3（5）：235-239.

[12]SWATEK K N， KOMANDER D. Ubiquitin modifications[J].? Cell Research， 2016，26（4）：399-422.

[13]WOOD D J， ENDICOTT J A. Structural insights into the functional diversity of the CDK-cyclin family[J].? Open Biology， 2018，8（9）：180112.

[14]SURYADINATA R， SADOWSKI M， SARCEVIC B. Control of cell cycle progression by phosphorylation of cyclin-depen-dent kinase （CDK） substrates[J].? Bioscience Reports， 2010，30（4）：243-255.

[15]TAKAHASHI H， UEMATSU A， YAMANAKA S， et al. Establishment of a wheat cell-free synthesized protein array containing 250 human and mouse E3 ubiquitin ligases to identify novel interaction between E3 ligases and substrate proteins[J].? PLoS One， 2016，11（6）：e0156718.

[16]TUNDO G R， SBARDELLA D， SANTORO A M， et al. The proteasome as a druggable target with multiple therapeutic potentialities： cutting and non-cutting edges[J].? Pharmacology & Therapeutics， 2020，213：107579.

[17]SENFT D， QI J F， RONAI Z A. Ubiquitin ligases in oncoge-nic transformation and cancer therapy[J].? Nature Reviews Cancer， 2018，18（2）：69-88.

[18]DREWS O， TAEGTMEYER H. Targeting the ubiquitin-proteasome system in heart disease： the basis for new therapeutic strategies[J].? Antioxidants & Redox Signaling， 2014，21（17）：2322-2343.

[19]NGUYEN K M， BUSINO L. The biology of F-box proteins： the SCF family of E3 ubiquitin ligases[J].? Advances in Experimental Medicine and Biology， 2020，1217：111-122.

[20]WANG Z W， LIU P D， INUZUKA H， et al. Roles of F-box proteins in cancer[J].? Nature Reviews Cancer， 2014，14（4）：233-247.

[21]LAN R X， JIN B， LIU Y Z， et al. Genome and transcriptome profiling of FBXW family in human prostate cancer[J].? American Journal of Clinical and Experimental Urology， 2020，8（4）：116-128.

[22]HONG M J， KIM J B， SEO Y W， et al. Regulation of glycosylphosphatidylinositol-anchored protein （GPI-AP） expression by F-box/LRR-repeat （FBXL） protein in wheat （Triticum aestivum L.）[J].? Plants （Basel， Switzerland）， 2021，10（8）：1606.

[23]ZOU C B， CHEN Y， SMITH R M， et al. SCF （Fbxw15） mediates histone acetyltransferase binding to origin recognition complex （HBO1） ubiquitin-proteasomal degradation to regulate cell proliferation[J].? The Journal of Biological Chemistry， 2013，288（9）：6306-6316.

（本文編輯馬偉平）