陳 嫣， 王 宏， 宋秀麗， 樊靜靜， 孫 陽， 汪道文， 楊曉云

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢 430030

先天性長QT綜合征(long QT syndrome，LQTS)是一種罕見的遺傳性心臟疾病，其遺傳方式主要包括常染色體顯性遺傳與常染色體隱性遺傳。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每2500個(gè)新生兒中可能會(huì)有1個(gè)人被診斷為LQTS[1]。目前LQTS中已有20余種突變基因被發(fā)現(xiàn)，最常見的主要包括LQT1、LQT2和LQT3三個(gè)亞型，約占LQTS患者的90%。LQT1致病基因?yàn)榫幋a心臟緩慢延遲整流鉀電流(IKs)通道的KCNQ1基因，LQT2致病基因?yàn)榫幋a心臟快速延遲整流鉀電流(rapidly activated delayed rectifier potassium current，IKr)通道α亞基的KCNH2基因，LQT3致病基因?yàn)榫幋a心臟電壓門控鈉通道(Nav1.5)α亞基的SCN5A基因。LQTS的靜息心電圖可表現(xiàn)為QT間期延長，患者因心肌復(fù)極異常而有發(fā)生惡性室性心律失常的風(fēng)險(xiǎn)[2]。有1/3以上基因突變攜帶者靜息心電圖QT間期正常[3]，但首發(fā)表現(xiàn)可能就是心源性猝死(sudden cardiac death，SCD)。因此，LQTS的診斷具有極大的挑戰(zhàn)性。近年來，隨著基因檢測技術(shù)在臨床工作中的不斷推廣，LQTS基因陽性診斷率越來越高，與基因突變相關(guān)的家族性LQTS也越來越受到人們的重視。臨床上除了對疑似LQTS患者進(jìn)行相關(guān)檢查外，對已知LQTS患者突變的分子遺傳學(xué)和一級(jí)家族成員的篩查均有助于提高診斷的可信度。此外，LQTS的突變基因篩選還可識(shí)別無癥狀和表型陰性的LQTS個(gè)體，避免這些潛在患者因服用可致QT間期延長的藥物而遭受額外的外源性傷害。因此，對LQT2患者的致病基因、發(fā)病機(jī)制及其家族遺傳背景的不斷深入研究，對于防止不良心血管事件的發(fā)生具有重要的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

Nanodrop 2000、超純水儀和細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher，美國)；高速冷凍離心機(jī)(美國Eppendorf公司)；PCR儀器、Qubit 2.0定量儀與10n PGM測序儀(美國Life Technologies公司)；超低溫冰箱(中國海爾)；瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)(北京市六一儀器廠)；紫外核酸檢測儀(北京市六一儀器廠)；普通倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；Western blot裝置(美國Bio-Rads公司)；膜片鉗放大器、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)程序(美國AXON公司)；顯微操縱器、微電極拉制儀P1000、微電極拉制儀加熱片、微電極玻璃管(美國Sutter公司)；熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

血液基因組DNA提取試劑盒(南京諾維贊生物科技有限公司)；建庫試劑盒(美國Life Technologies公司)；Qubit dsDNA高濃度測定試劑盒和Supplies 200 v2試劑盒(美國Life Technologies公司)；Beckman磁珠(美國Beckman公司)；人胚腎293細(xì)胞(HEK293)為實(shí)驗(yàn)室既往凍存的細(xì)胞株(ATCC來源)；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清(美國Gibco公司)；Western blot制膠套裝、NP40細(xì)胞裂解液(中國博士德有限公司)；BCA蛋白濃度檢測試劑盒、ECL顯影液、細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000(美國Thermo Fisher公司)；蛋白Marker(中國金斯瑞公司)；PVDF膜(德國Dassel公司)；GAPDH抗體、KCNH2抗體(Abclonal公司)。

1.2 LQTS家系收治和臨床數(shù)據(jù)收集

收集在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心血管內(nèi)科門診就診的多個(gè)LQTS家系的病例資料，并對相應(yīng)家庭成員進(jìn)行檢測及隨訪。所有家系成員都同意并簽署了知情同意書。在嚴(yán)格保護(hù)所有成員隱私的前提下，詳細(xì)詢問患者平時(shí)出現(xiàn)相關(guān)癥狀的具體情況，如暈厥或猝死發(fā)生的時(shí)間、次數(shù)、具體癥狀、轉(zhuǎn)歸等，然后進(jìn)行相關(guān)體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查，包括常規(guī)心電圖、長程心電圖、超聲心動(dòng)圖等。每個(gè)患者及家屬各采集5 mL靜脈血，800 r/min離心分離血漿和白細(xì)胞后保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)基因檢查。華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了本研究。

1.3 高通量靶向測序

采用基因組DNA提取試劑盒抽提患者及家屬的血樣品進(jìn)行檢測，將離子通道病相關(guān)的73個(gè)致病基因做成一個(gè)心律失?；蚝霞糜诟咄堪邢驕y序，測量其外顯子區(qū)及其附近區(qū)域。

基因合集如下：AKAP9、CACNB2、GPD1L、KCNQ1、PKP2、SCN4A、SNTA1、ANK2、CACNB3、HCN4、LAMA4、PRKAG2、SCN4B、SYNE1、ABCC9、CALM1、KCNA5、KCND3、PSEN2、SCN5A、TAZ、CACNA1A、CALM2、KCNE1、MYH6、RBM20、SCN7A、TBX20、CACNA1B、CAV3、KCNE2、MYH7、RYR2、SCN8A、TCAP、CACNA1C、CRYAB、KCNE3、MYL3、SCN10A、SCN8A、TMEM43、CACNA1D、DMPK、KCNE4、MYLK2、SCN11A、SCN9A、TNNT2、CACNA2D1、DSP、KCNH2、MYOT、SCN1A、TRPM4、CACNA1E、FKRP、KCNJ2、MYPN、SCN1B、SDHA、CACNA1F、FKTN、KCNJ5、NOG1、SCN2A、SGCA、CACNA1G、FXN、KCNJ8、NPPA、SCN3B、SLMAP。

首先配置Barcode反應(yīng)體系，純化Barcode液及擴(kuò)增庫，純化庫，然后測定庫溶液濃度并稀釋。完成建庫后，根據(jù)測序儀的要求制備IonPGMTM模板，用ES純化OneTouch后的產(chǎn)物，然后上機(jī)測序并分析結(jié)果。

用高通量測序篩查出先證者血樣中DNA突變，濾除UCSC數(shù)據(jù)庫Common SNPs，濾除dbSNP數(shù)據(jù)庫及1000-genome-project數(shù)據(jù)庫的常見突變，濾除無功能的同義突變和內(nèi)含子突變，篩選出候選致病突變基因。

1.4 構(gòu)建突變質(zhì)粒

采用吉?jiǎng)P基因公司GV146-EGFP-KCNH2質(zhì)粒及空載對照質(zhì)粒。在野生型質(zhì)粒基礎(chǔ)上，用點(diǎn)突變試劑盒構(gòu)建點(diǎn)突變質(zhì)粒。點(diǎn)突變構(gòu)建引物：KCNH2-mut-G120T-F，5′-AACGAGGATTGGGCTGTCATCATGTTCATCCT-3′；KCNH2-mut-G120 T-R，5′-ACAGCCCAATCCTCGTTCTTCACGG-GCACCAC-3′。擴(kuò)增并提取點(diǎn)突變質(zhì)粒后進(jìn)行Sanger測序，確定其突變成功。

1.5 Western blot檢測

收集目的細(xì)胞后提取細(xì)胞蛋白，BCA法測蛋白濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。在上樣孔中加入相應(yīng)體積的蛋白混合液(20 μg)，空白孔中加入蛋白Marker，先恒壓60 V電泳，蛋白進(jìn)入下層膠后調(diào)整至120 V，恒壓維持直至目的蛋白充分分離。350 mA恒流轉(zhuǎn)膜，持續(xù)1.5 h。將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中封閉1 h。先后孵育相應(yīng)一抗、二抗后，ECL曝光顯影。

1.6 膜片鉗實(shí)驗(yàn)

配置細(xì)胞內(nèi)液、細(xì)胞外液，制作玻璃微電極使電極范圍至3～5 MΩ。在熒光顯微鏡下選擇大小合適、表面光滑無顆粒的帶熒光細(xì)胞，在電極與細(xì)胞膜形成的高阻抗封接穩(wěn)定后，短暫快速負(fù)壓破膜，進(jìn)入全細(xì)胞記錄狀態(tài)，調(diào)節(jié)補(bǔ)償電容，通過穩(wěn)態(tài)激活、穩(wěn)態(tài)失活、失活再恢復(fù)這一程序記錄。用Clampfit軟件記錄電流數(shù)值并進(jìn)行分析，然后用Sigma Plot軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 獲取1個(gè)LQTS家系相關(guān)臨床資料

先證者為46歲女性，因“發(fā)生暈厥1次”收住我院心血管內(nèi)科?；颊邥炟拾l(fā)作時(shí)伴意識(shí)喪失約10 min，無大小便失禁，無抽搐。蘇醒后自覺心前區(qū)不適，約1 h后緩解。外院動(dòng)態(tài)心電圖示：竇性心動(dòng)過緩，頻發(fā)室性期前收縮，部分成對出現(xiàn)伴短陣室性心動(dòng)過速。無特殊既往史及家族史。家族成員中無暈厥或SCD病史。入院檢查：血常規(guī)、氨基末端腦鈉尿肽(NT-proBNP)、心肌生化標(biāo)志物、血沉、糞常規(guī)、D-二聚體、甲狀腺功能等均未見明顯異常。超聲心動(dòng)圖示：心臟各房室瓣膜結(jié)構(gòu)未見明顯異常。心電圖(圖1A)提示QT(QTc)間期延長達(dá)501 ms，T波振幅低有切跡。入院診斷：長QT綜合征，尖端扭轉(zhuǎn)型室速，心源性暈厥可能性大。治療方案：擬植入雙心室起搏埋藏式心律轉(zhuǎn)復(fù)除顫器(implantable cardioverter defibrillator，ICD)。

進(jìn)一步對該患者家系進(jìn)行調(diào)查。采用1993年Schwartz等提出的家系研究評分系統(tǒng)進(jìn)行評估：若評分大于等于4分，則診斷為LQTS；若評分為2～3分，則為可疑診斷；若評分小于2分則可排除LQTS。該家系中包括先證者共4位兄弟姐妹診斷為LQTS，父親為疑似LQTS(圖1B)。

A：先證者典型心電圖表現(xiàn)，QTc間期延長達(dá)501 ms，T波振幅低有切跡；B：LQTS家系圖譜，4位兄弟姐妹均診斷為LQTS，父親為疑似LQTS(○、□分別代表家系中正常女性及男性；●、■分別代表家系中LQTS女性及男性；灰色代表可疑LQTS成員；表示先證者)圖1 獲取的一個(gè)LQTS家系相關(guān)資料Fig.1 Related data of an LQTS family

另外，我們對該患者家系進(jìn)行了心電圖檢查，心電圖顯示先證者兄弟姐妹中的Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅱ9這3例患者均出現(xiàn)了QT間期延長，其余家屬心電圖均正常。

2.2 高通量測序篩選可疑突變位點(diǎn)

對突變位點(diǎn)進(jìn)行功能預(yù)測，做了相關(guān)保守性評估，在HGMD等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，最后通過Sanger測序驗(yàn)證確定該陽性突變。這個(gè)突變點(diǎn)為KCNH2基因編碼蛋白上第358位核酸堿基，由鳥嘌呤(G)突變?yōu)樾叵汆奏?T)，為雜合突變。

2.3 明確該先證者家系中基因突變情況

對先證者直系及旁系親屬血樣進(jìn)行測序驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)除了先證者為KCNH2基因c.358G>T雜合突變之外，先證者確診為LQTS的兄弟中也有該雜合突變(圖2)，家屬Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅱ9均出現(xiàn)KCNH2 c.358G>T位點(diǎn)雜合突變，Ⅰ1未查血樣，其余家屬該堿基位點(diǎn)均為野生型。

一代測序確認(rèn)先證者及部分家屬基因突變情況圖2 親屬一代測序驗(yàn)證圖Fig.2 Verification diagram of the first generation sequencing of relatives

2.4 構(gòu)建KCNH2 c.358G>T突變質(zhì)粒(KCNH2-G120W)

以GV146為載體的KCNH2過表達(dá)質(zhì)粒為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物，構(gòu)建點(diǎn)突變質(zhì)粒。通過質(zhì)粒測序，我們確定成功構(gòu)建了KCNH2-G120W突變質(zhì)粒。KCNH2 c.358G>T突變改變了KCNH2蛋白的結(jié)構(gòu)域(圖3)，從而可能影響了KCNH2的蛋白功能。

左：野生型KCNH2蛋白結(jié)構(gòu)圖(綠色箭頭為野生型肽段)；右：KCNH2 c.358G>T突變蛋白結(jié)構(gòu)圖(紅色箭頭為突變后的肽段)圖3 KCNH2-G120W突變質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.3 Construction of KCNH2-G120W mutant plasmid

2.5 轉(zhuǎn)染KCNH2-G120W突變質(zhì)粒觀察對全細(xì)胞膜電位的影響

將等量的帶EGFP標(biāo)簽的空白對照質(zhì)粒、KCNH2-WT質(zhì)粒、KCNH2-G120W突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞系中，待轉(zhuǎn)染48 h后將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下可見細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均較高(圖4A)。我們將不同組細(xì)胞提取總蛋白后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)，最后曝光結(jié)果顯示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，KCNH2-WT質(zhì)粒組和KCNH2-G120W突變質(zhì)粒組KCNH2蛋白水平均過表達(dá)(圖4B)。

A：熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染了空白對照質(zhì)粒(a)、KCNH2-WT質(zhì)粒(b)及KCNH2-G120W突變質(zhì)粒(c)的細(xì)胞中有明顯熒光；B：Western blot顯示在HEK293T中轉(zhuǎn)染成功圖4 KCNH2-G120W突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功Fig.4 Successful transfection of KCNH2-G120W mutant plasmid

KCNH2基因編碼mRNA后翻譯成電壓門控K+通道Kv11.1的α-亞基通道蛋白。這些α-亞基通道蛋白在心肌細(xì)胞肌膜形成通道，傳導(dǎo)IKr電流。IKr缺失可延遲心室肌細(xì)胞AP的復(fù)極而導(dǎo)致LQTS。因此，我們假設(shè)該突變可能會(huì)導(dǎo)致IKr電流減小或消失，引起心肌復(fù)極異常，從而引發(fā)LQT2。為了進(jìn)一步證實(shí)該假設(shè)，我們用膜片鉗技術(shù)將轉(zhuǎn)染KCNH2-WT質(zhì)粒組和KCNH2-G120W突變質(zhì)粒組的HEK293T細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞膜電位檢測，記錄的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。由此發(fā)現(xiàn)，KCNH2-G120W突變質(zhì)粒組的尾電流顯著下降，表示突變體不能正常地運(yùn)送至細(xì)胞膜表面，從而導(dǎo)致電流下降。

A：KCNH2-WT質(zhì)粒組膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B：KCNH2-G120W突變質(zhì)粒組膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果；C：KCNH2-G120W突變質(zhì)粒組相比于KCNH2-WT組尾電流顯著下降，與KCNH2-WT組比較，*P<0.05圖5 轉(zhuǎn)染KCNH2-G120W突變質(zhì)粒對全細(xì)胞膜電位的影響Fig.5 Effect of transfection of KCNH2-G120W mutant plasmid on whole cell membrane potential

3 討論

遺傳性長QT綜合征是由多個(gè)基因位點(diǎn)之一的有害突變引起的，主要與3種心臟離子通道基因突變有關(guān)，分別是：KCNQ1(LQT1)、KCNH2(LQT2)和SCN5A(LQT3)[4-5]，我國LQTS患者中以LQT2型最常見，其主要與KCNH2基因突變有關(guān)。KCNH2基因突變通過多種機(jī)制引起IKr通道功能障礙，延長心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)間，心電圖因心室復(fù)極延遲而表現(xiàn)為QT(QTc)間期異常延長[2-3]。心室復(fù)極延遲增加了患者發(fā)生致命性尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動(dòng)過速(torsades de pointes，TdP)、室顫等惡性心律失常的風(fēng)險(xiǎn)[6]，患者可反復(fù)發(fā)作暈厥,甚至發(fā)生心源性猝死。

迄今為止，已鑒定出約300個(gè)KCNH2基因突變點(diǎn)，突變類型包括錯(cuò)義突變、無義突變、剪接突變、移碼突變、片段缺失等突變類型，LQT2突變類型是根據(jù)IKr降低的不同分子機(jī)制來進(jìn)行分類的[7]，即與導(dǎo)致最大電流降低的突變基因有關(guān)。研究表明，KCNH2基因編碼Kv11.1通道α亞基，該亞基是心肌細(xì)胞動(dòng)作電位2期和3期IKr激活的基礎(chǔ)，因而在心臟復(fù)極中起著重要作用。心室肌細(xì)胞復(fù)極時(shí)，IKr通道功能障礙可引起K+外流減慢，導(dǎo)致復(fù)極時(shí)間延長，心電圖出現(xiàn)QT間期延長。Shimizu等[8]對213個(gè)先證者家庭中的858例LQTS2型患者進(jìn)行基因檢測，共發(fā)現(xiàn)162個(gè)不同的KCNH2基因突變。突變點(diǎn)主要分布在3個(gè)區(qū)域：N端(28.4%，n=46)、C端(30.9%，n=50)和跨膜結(jié)構(gòu)域(40.7%，n=66)。

在本研究中，我們從臨床LQTS患者中篩選出具有遺傳突變的LQT2家系，找到了KCNH2 c.358G>T雜合子突變。由此初步假設(shè)，KCNH2 c.358G>T突變可能是導(dǎo)致家族性LQT2的關(guān)鍵因素之一。KCNH2基因c.358G>T雜合突變改變了KCNH2基因編碼的α亞基蛋白結(jié)構(gòu)。α亞基為電壓門控K+通道的蛋白，主要在心肌細(xì)胞肌膜形成通道，傳導(dǎo)IKr電流。KCNH2-G120W突變體影響了IKr功能，導(dǎo)致IKr電流減小或消失，引起心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極時(shí)間延長，從而導(dǎo)致心肌復(fù)極異常，心電圖表現(xiàn)為QT間期延長。為了驗(yàn)證該假設(shè)，我們設(shè)計(jì)了KCNH2 c.358G>T突變質(zhì)粒，驗(yàn)證突變成功后將該突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293細(xì)胞系中，利用全細(xì)胞膜電位來檢測突變后的細(xì)胞膜電位變化趨勢。在膜電位檢測中，發(fā)現(xiàn)KCNH2-G120W突變質(zhì)粒組的尾電流與KCNH2-WT組相比顯著下降，提示該突變體不能正常地運(yùn)送K+至細(xì)胞膜表面，從而導(dǎo)致電流下降。但是KCNH2 c.358G>T突變究竟是影響了Kv11.1 a通道蛋白的某個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域還是影響蛋白空間構(gòu)象而導(dǎo)致蛋白功能異常，后續(xù)研究還需要進(jìn)一步深入探討。

多數(shù)LQTS患者可通過多種途徑來控制疾病進(jìn)展，如應(yīng)用β-腎上腺素能受體阻滯劑、生活方式干預(yù)、避免服用延長QT間期的藥物、避免低鉀和低鎂血癥及針對高危臨床特征患者植入ICD[9-11]。但因離子通道突變點(diǎn)位置不同，編碼類型不同，其危險(xiǎn)分層及具體治療方法也不相同。本研究為LQTS的發(fā)病機(jī)制提供了新的突變位點(diǎn)，也為臨床家系篩查提供了新的思路和研究方向。對該突變詳細(xì)機(jī)制的進(jìn)一步研究可能會(huì)為LQTS的治療提供新的方法和手段，但仍需要更多基礎(chǔ)層面的研究和臨床實(shí)踐的檢驗(yàn)。