段宇清， 黃 輝， 范 傲， 王 忠，2△

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1心內(nèi)二科 2國家衛(wèi)健委中亞高發(fā)病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832000

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是一種常見的心血管急癥，其發(fā)病主要是由于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂或糜爛形成血栓栓塞罪犯血管所致，其中炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮了重要的作用，而中性粒細(xì)胞作用最為廣泛，貫穿心肌梗死發(fā)生發(fā)展的全過程[1]。中性粒細(xì)胞胞外捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)是近年發(fā)現(xiàn)的中性粒細(xì)胞發(fā)揮功能的一種新的形式，它是由中性粒細(xì)胞受到刺激活化后釋放到胞外的一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要由雙鏈DNA(dsDNA)和瓜氨酸組蛋白組成，此外，還結(jié)合有髓過氧化物酶、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、組織因子等中性粒細(xì)胞的顆粒蛋白[2]。研究顯示，循環(huán)中的NETs相關(guān)成分可能通過激活血小板，觸發(fā)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙和斑塊不穩(wěn)定，以及冠狀動(dòng)脈血栓形成[3-4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在嚴(yán)重冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者中，血漿NETs相關(guān)結(jié)構(gòu)，如dsDNA、核小體和MPO-DNA復(fù)合物大量存在[5]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，NETs的主要成分dsDNA水平與急性ST段抬高型心肌梗死(acute ST-segment elevated myocardial infarction，STEMI)患者心肌梗死的面積大小、心室重塑和院內(nèi)不良心血管事件相關(guān)[6-7]，提示NETs可能參與了AMI的發(fā)生發(fā)展。但血漿中NETs及其相關(guān)結(jié)構(gòu)與AMI患者冠脈病變嚴(yán)重程度的關(guān)系并不清楚。本研究旨在探討AMI患者血漿中NETs水平與冠脈病變嚴(yán)重程度的關(guān)系，為AMI患者危險(xiǎn)分層提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2020年10月至2021年5月在石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的AMI患者及同期健康體檢者各95例作為研究對(duì)象，血液標(biāo)本及信息收集均獲得患者的知情同意并通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。AMI組納入標(biāo)準(zhǔn)：符合Fourth Universal Definition of Myocardial Infarction(2018)[8]的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，并在發(fā)病12 h內(nèi)接受急診冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)開通罪犯血管的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴腎功能不全、肝功能不全；伴類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等系統(tǒng)性疾病；既往有瓣膜性心臟病、持續(xù)性心房纖顫等心血管疾??；不同意及不配合完成本研究者。對(duì)照組為正常健康人群，依據(jù)隨機(jī)原則與AMI組在性別、年齡上進(jìn)行匹配。AMI組又根據(jù)Gensini評(píng)分結(jié)果分為冠脈輕度狹窄組(≤36分)34例與重度狹窄組(>36分)61例。

1.2 材料與方法

收集臨床基線資料及白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、肌鈣蛋白T、D-二聚體、左心室射血分?jǐn)?shù)等臨床指標(biāo)。在冠脈造影前采外周靜脈血5 mL置于EDTA抗凝管中，以3000 r/min離心5 min，分離血漿，儲(chǔ)存在-80℃冰箱待用。使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血漿瓜氨酸組蛋白3(CitH3)水平，采用PicoGreen熒光染料定量分析血漿中dsDNA水平。CitH3 ELISA試劑盒購于美國Cayman Chemical公司，Quant-iTTMPicoGreen?reagent試劑盒購于美國Invitrogen公司。

冠脈病變分析方法采用標(biāo)準(zhǔn)Judkins法行選擇性冠脈造影，根據(jù)冠脈造影結(jié)果運(yùn)用Gensini評(píng)分系統(tǒng)對(duì)病變進(jìn)行量化。Gensini評(píng)分系統(tǒng)包括：①病變部位：左冠脈主干5分，左前降支及左回旋支近段2.5分，左前降支中段1.5分，左前降支遠(yuǎn)段及左回旋支中段、遠(yuǎn)段1分，右冠脈及后降支1分，第一對(duì)角支1分，第二對(duì)角支0.5分，其余小分支0.5分；②管腔狹窄程度：1%～為1分，26%～為2分，51%～為4分，76%～為8分，91%～為16分，完全閉塞為32分。根據(jù)每處病變積分計(jì)算出Gensini評(píng)分。冠脈病變血管定義為冠脈造影確認(rèn)的主要冠狀動(dòng)脈(左前降支、左回旋支、右冠狀動(dòng)脈)且直徑狹窄超過50%以上。按照冠脈病變支數(shù)分為單支病變組、雙支病變組、三支病變組，若冠脈病變累及左主干則屬于雙支病變組(不管病變有無累及左前降支、左回旋支)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基本資料比較

AMI組患者血漿CitH3、dsDNA水平均高于對(duì)照組(均P<0.05)。年齡、體質(zhì)量指數(shù)、性別及吸煙、飲酒比例，兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。

表1 AMI組與對(duì)照組的基本資料比較Table 1 Comparison of basic information between AMI group and control group

2.2 AMI組患者Pearson相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析表明Gensini評(píng)分與血漿中CitH3(r=0.590，P<0.01)、dsDNA(r=0.613，P<0.01)水平呈正相關(guān)；冠脈病變血管支數(shù)與血漿中CitH3(r=0.368，P<0.01)、dsDNA(r=0.257，P=0.012)水平呈正相關(guān)。

2.3 冠脈輕度狹窄組與重度狹窄組臨床資料比較

冠脈重度狹窄組血漿CitH3、dsDNA、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、NT-proBNP、D-二聚體、MHR水平顯著高于冠脈輕度狹窄組；其余基線資料在兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 AMI組中冠脈輕度狹窄組與重度狹窄組臨床資料比較Table 2 Comparison of clinical data between mild coronary stenosis group and severe coronary stenosis group in the AMI group

2.4 不同病變血管支數(shù)患者血漿CitH3、dsDNA水平比較

與單支病變組比較，雙支病變組、三支病變組血漿CitH3、dsDNA水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；雙支病變與三支病變兩組間血漿CitH3、dsDNA水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見圖1。

與單支病變組比較，*P<0.05圖1 AMI患者單支病變組、雙支病變組和三支病變組CitH3、dsDNA水平的比較Fig.1 Comparison of CitH3 and dsDNA levels in patients with AMI among single-vessel，double-vessel and three-vessel groups

2.5 Logistic分析

將可能影響AMI患者冠脈重度狹窄的變量進(jìn)行Logistic單因素回歸分析，然后將單變量分析中有顯著性差異(P<0.05)的變量納入Logistic多因素回歸分析。結(jié)果顯示，血漿CitH3、dsDNA是冠脈重度狹窄的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表3。

表3 冠脈重度狹窄的多因素logistic回歸分析Table 3 Multivariate logistic regression analysis of severe coronary stenosis

2.6 ROC曲線

將AMI患者血漿CitH3、dsDNA水平和CitH3聯(lián)合dsDNA作為檢驗(yàn)變量，將冠脈重度狹窄作為狀態(tài)變量，繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，在識(shí)別重度冠狀動(dòng)脈狹窄的AMI患者能力方面，CitH3聯(lián)合dsDNA優(yōu)于CitH3、dsDNA兩個(gè)指標(biāo)，見圖2、表4。

圖2 預(yù)測冠脈重度狹窄ROC曲線Fig.2 ROC curve predicting severe coronary stenosis

表4 dsDNA、CitH3單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測冠脈重度狹窄的效能Table 4 Prediction efficacy of dsDNA and CitH3 alone or in combination for severe coronary stenosis

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是急性心肌梗死的基本病理基礎(chǔ)，與AMI患者的冠脈病變嚴(yán)重程度密切相關(guān)[9]?，F(xiàn)有的證據(jù)表明，炎癥在整個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用[10]，活躍的炎癥過程可促使白細(xì)胞大量匯聚，分泌蛋白酶(基質(zhì)金屬蛋白酶)，使斑塊的纖維帽逐漸變薄，易于破裂，最終導(dǎo)致血栓梗阻冠脈血管[11]。AMI是臨床常見的心血管急危重癥之一，具有起病迅速、癥狀危重、病情兇險(xiǎn)、預(yù)后差等特點(diǎn)。因此，盡早對(duì)疾病的嚴(yán)重程度做出評(píng)估，可為臨床診療工作提供重要參考。

眾所周知，中性粒細(xì)胞屬于抵御入侵病原體的第一道防線，是非特異性免疫的重要組成部分，通過趨化、吞噬、脫顆粒作用，消除無菌炎癥。目前研究表明中性粒細(xì)胞參與了動(dòng)脈粥樣硬化血栓的形成[12-13]，并在急性冠狀動(dòng)脈事件中有一定的預(yù)測作用[14]。此外，在缺血/再灌注損傷(IRI)的動(dòng)物模型中也描述了中性粒細(xì)胞和NETs[15]。NETs作為近年來發(fā)現(xiàn)的中性粒細(xì)胞發(fā)揮功能的一種新的形式，具有強(qiáng)有力的促炎、促血栓形成、細(xì)胞毒作用，并可通過多種途徑促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[16]。本研究檢測了AMI患者血漿中NETs主要成分CitH3、dsDNA的水平，結(jié)果顯示AMI組的CitH3、dsDNA水平明顯高于健康對(duì)照組，重度狹窄組血漿中CitH3、dsDNA水平明顯高于輕度狹窄組，且AMI患者血漿中NETs水平與Gensini評(píng)分呈正相關(guān)，Borissoff等[5]學(xué)者也發(fā)現(xiàn)血漿中與NETs的相關(guān)結(jié)構(gòu)，如dsDNA、核小體和MPO-DNA復(fù)合物在嚴(yán)重冠狀動(dòng)脈硬化或極鈣化的冠狀動(dòng)脈患者中顯著升高，這與本研究的結(jié)果一致，提示NETs可能與AMI患者冠脈病變的嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)AMI三支病變組與雙支病變組血漿NETs水平高于單支病變組，且血漿中NETs水平與冠脈病變血管支數(shù)呈正相關(guān)，提示NETs可能不僅參與了AMI罪犯血管病變的形成，還參與了非罪犯血管病變的形成。本研究中三支病變組與雙支病變組之間NETs水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮可能是由于NETs在所有冠脈病變血管中均發(fā)揮作用，從而導(dǎo)致兩組血漿中NETs的總體水平無明顯差異，此外本研究樣本量較少，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步探討。

研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)脈粥樣硬化的小鼠模型中，膽固醇晶體可觸發(fā)中性粒細(xì)胞釋放NETs，NETs引發(fā)巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，進(jìn)一步激活輔助性T細(xì)胞17(TH17)放大動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中免疫細(xì)胞的招募，引起慢性炎癥反應(yīng)[17]。同樣，在危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(如氧化低密度脂蛋白)存在的情況下，血漿中膽固醇的積累可能會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞炎癥小體激活，促進(jìn)動(dòng)脈中性粒細(xì)胞浸潤和NETs的釋放，從而加速硬化性病變的形成[18]，以上結(jié)果提示NETs可能參與了早期動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生及斑塊活動(dòng)中的炎癥反應(yīng)。Silvestre-Roig等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊部位，活化的血管平滑肌細(xì)胞可誘發(fā)NETs的形成，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定性增加，NETs的相關(guān)成分組蛋白可引起血管平滑肌細(xì)胞的極化，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性作用，進(jìn)一步加劇斑塊的不穩(wěn)定性。Stakos等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在STEMI過程中，血小板與斑塊破裂部位的中性粒細(xì)胞相互作用后，NETs被識(shí)別為表達(dá)功能性組織因子，并誘導(dǎo)血小板活化和進(jìn)一步的凝血酶生成，從而增加NETs促進(jìn)血栓生成的潛能。NETs通過為血小板，紅細(xì)胞，細(xì)胞外囊泡和促凝血分子提供支架來促進(jìn)血管閉塞，該支架提供了血栓形成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[16]。Langseth等[21]研究表明，STEMI患者血清中dsDNA、MPO-DNA和CitH3水平與白細(xì)胞計(jì)數(shù)均呈正相關(guān)，且血清中dsDNA水平與D-二聚體呈正相關(guān)，本研究也發(fā)現(xiàn)在重度狹窄組中白細(xì)胞計(jì)數(shù)和D-二聚體水平明顯升高，以上結(jié)果提示NETs可能參與了動(dòng)脈粥樣硬化過程中的急慢性炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致不穩(wěn)定斑塊的糜爛和破裂，進(jìn)而導(dǎo)致血栓的形成和AMI的發(fā)生，其有望成為評(píng)估AMI患者冠脈病變嚴(yán)重程度的有效指標(biāo)。

為了進(jìn)一步明確血漿中NETs與AMI患者冠脈病變嚴(yán)重程度的關(guān)系，本研究中將可能影響AMI患者冠脈重度狹窄的變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，血漿CitH3、dsDNA是冠脈重度狹窄的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；除此之外，ROC曲線結(jié)果也顯示，血漿CitH3、dsDNA對(duì)AMI冠脈重度狹窄的患者有一定的預(yù)測價(jià)值，且CitH3聯(lián)合dsDNA對(duì)重度冠脈狹窄的預(yù)測能力明顯優(yōu)于CitH3、dsDNA兩個(gè)指標(biāo)，其敏感度和特異度分別為88.5%和70.6%，預(yù)測效能較高。

綜上所述，AMI患者血漿CitH3、dsDNA水平過表達(dá)可能提示冠脈重度狹窄，病情較嚴(yán)重，早期可考慮通過檢測AMI患者血漿CitH3、dsDNA水平，并結(jié)合其他冠脈病變?cè)u(píng)估指標(biāo)預(yù)測患者冠脈病變程度，為AMI患者危險(xiǎn)分層及臨床診療工作提供重要參考。