張貴，尚蕾，李曉玲，代文意，李穎

鼻咽癌（NPC）是東南亞及我國南部發(fā)病率較高的頭頸部惡性腫瘤疾?。?］。鼻咽部結(jié)構(gòu)隱匿，發(fā)病一般源于鼻咽部的咽隱窩和頂后壁，早期臨床癥狀不明顯，一旦確診大多數(shù)發(fā)展為中晚期，臨床癥狀復(fù)雜多樣［2］。頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是較常見，放化療是鼻咽癌治療的首選方案，但局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率仍較高，是影響預(yù)后的主要因素［3-4］。NPC 發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的作用，尋找能準(zhǔn)確反應(yīng)鼻咽癌診斷、病情發(fā)展程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期等分析診斷標(biāo)志物是臨床熱點(diǎn)。有研究報(bào)道［5-6］MAPK/MnK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而MnK1 激酶磷酸化是該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活的關(guān)鍵。為進(jìn)一步確定MAPK/MnK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在鼻咽癌發(fā)病機(jī)制中的作用，本研究對比分析鼻咽癌病人與對照組血清pMnK1蛋白陽性率差異及與TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015 年1 月至2017 年7 月南陽市中心醫(yī)院收集的90 例鼻咽癌病理學(xué)標(biāo)本為鼻咽癌組、90 例經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)鼻部慢性炎癥的鼻黏膜組織為對照組。鼻咽癌組，年齡（58.2±9.1）歲，范圍為44～75歲，男74例、女16例；TNMⅠ期20例、Ⅱ期35例、Ⅲ期28例、Ⅳ期7例；分化型非角化型癌18 例、未分化癌72 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性44 例、陰性46 例。對照組年齡（59.0±12.0）歲，范圍為42～75歲；男70 例、女20 例。兩組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) （1）鼻咽癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2015年NCCN 臨床實(shí)踐指南中鼻咽癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）納入對象的年齡≤75 歲；（3）病人經(jīng)鼻咽喉鏡取鼻咽部組織進(jìn)行病理學(xué)活檢證實(shí)；（4）病人或其近親屬知情同意；（5）本研究符合《赫爾透辛基宣言》相關(guān)倫理及保密原則。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）轉(zhuǎn)移性、復(fù)發(fā)性鼻咽癌病人；（2）在獲取標(biāo)本前具有放化療史、免疫學(xué)治療病史；（3）伴有其他系統(tǒng)的重大疾病；（4）免疫疾病或長期使用糖皮質(zhì)激素治療的病人。

1.4 免疫組化染色方法及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) （1）用二甲苯將石蠟切片透明5 min，并泡2 次；依次用100%，95%，75%，50%乙醇梯度復(fù)水，每次浸泡2 min，最后用自來水沖洗。（2）檸檬酸高壓1.5 min 以修復(fù)組織。（3）PBS沖洗3次，每次3～5 min。除去PBS液，向每張切片中加50μL 3%過氧化氫以阻斷內(nèi)源性過氧化物，并在室溫條件下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min，除去PBS 液。（4）50μL 非免疫山羊血清分別滴加至每張切片，室溫下孵育10 min，直接甩去血清。（5）均向每張切片中加入50 μL 的第一抗體pMnK1 抗體（美國Abcam 公司，1∶100稀釋），置于室溫條件下孵育60 min。PBS沖洗3次，每次3～5 min。除去PBS 液，再加入50 μL 即用型MaxVision 試劑，室溫下孵育15 min。（6）PBS 沖洗3 次，每次3 min。（7）除去PBS液，加100μL DAB顯色液（新配制），作用5 min，顯微鏡下觀察。（8）自來水沖洗，并用蘇木素復(fù)染，自來水沖洗后返藍(lán)，濃度梯度乙醇以脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。（9）鏡下閱片、攝像。

免疫組化結(jié)果判定：pMnK1 蛋白陽性著色表達(dá)于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)，呈黃色、棕黃色、褐色表達(dá)，（1）根據(jù)著色強(qiáng)度：0 分為無色、1 分為淡黃色、2 分為棕黃色、3 分為褐色、黑色；（2）根據(jù)陽性細(xì)胞比例：陽性細(xì)胞數(shù)目所占比例≤10%為1分、陽性細(xì)胞所占比例11%～50%為2 分、陽性細(xì)胞數(shù)51%～75%為3分、陽性細(xì)胞數(shù)所占比例＞75%為4 分，兩種積分相乘總分＜3分為陰性、≥3分為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0 版本對本研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用±s表示符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，兩組間分析采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間分析采用χ2檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier法，生存時(shí)間比較采用Log-rank 法；P＜0.05 說明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌組織與對照組的pMnK1蛋白陽性率比較鼻咽癌組的pMnK1 蛋白陽性率74.44%高于對照組的26.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=41.10，P＜0.05）。見表1。

表1 鼻咽癌組織與對照組的pMnK1蛋白陽性率比較/例（%）

2.2 鼻咽癌組織pMnK1蛋白陽性率表達(dá)與病理學(xué)特征的關(guān)系不同TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組的pMnK1蛋白陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在不同年齡、性別、不同組織學(xué)類型的鼻咽癌組的pMnK1 蛋白陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 鼻咽癌組織pMnK1蛋白陽性率表達(dá)與病理學(xué)特征的關(guān)系

2.3 預(yù)后情況分析經(jīng)2 年隨訪，pMnK1 蛋白陽性的鼻咽癌病人失訪4 例、陰性病人失訪1 例，pMnK1蛋白陽性的鼻咽癌病人2 年生存率61.90%與陰性病人的77.27% 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.71，P=0.191）。見表3。pMnK1 蛋白陽性的鼻咽癌病人的生存時(shí)間20.0 個(gè)月短于陰性組23.0 個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［Log-rank（Mantel-Cox）=3.285，P＜0.05］。見圖1。

表3 鼻咽癌組織pMnK1蛋白表達(dá)與2年生存率的關(guān)系/例（%）

圖1 pMnK1蛋白不同表達(dá)程度病人的生存函數(shù)圖

3 討論

鼻咽癌是源于鼻黏膜上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。影響鼻咽癌發(fā)病的因素復(fù)雜，包括：環(huán)境、飲食習(xí)慣、生活方式等，鼻咽癌發(fā)病率與地區(qū)有關(guān)，一般好發(fā)于東南亞和中國南部，男性發(fā)病率約為女性的2 倍，集中于40～50 歲［7-8］。由于鼻咽部結(jié)構(gòu)隱匿，故早起臨床癥狀不明顯，部分病人早期偶有涕中帶血，時(shí)有時(shí)無，瘤體增大可阻塞鼻孔后出現(xiàn)單側(cè)性鼻塞，繼而表現(xiàn)為雙側(cè)。若鼻咽癌起源于咽隱窩，隨著瘤體增大可阻塞壓迫咽鼓管咽口，表現(xiàn)為耳鳴、聲音嘶啞、耳悶、聽力下降。瘤體通過咽隱窩處的破裂口可轉(zhuǎn)移至顱內(nèi)，首先侵襲第Ⅴ、Ⅵ腦神經(jīng)，接著侵襲第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ腦神經(jīng)，表現(xiàn)為面部麻木、眼球活動(dòng)受限、上瞼下垂等一系列神經(jīng)累及癥狀。瘤體進(jìn)一步侵犯、轉(zhuǎn)移，可侵襲第Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ腦神經(jīng)，臨床表現(xiàn)為軟腭癱瘓、嗆咳、伸舌偏斜等癥狀［9-10］。臨床診斷一般以臨床癥狀為基礎(chǔ)結(jié)合可全面、精確顯示瘤體大小、范圍、部位的CT等影像學(xué)檢查、病理學(xué)檢查結(jié)果確診，且正確率較高。尋找新的靈敏度高、特異性好的血清學(xué)診斷指標(biāo)輔助診斷鼻咽癌，對提高鼻咽癌診斷正確率，降低診斷陰性率、誤診率、漏診率等具有重要意義。

鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展是由多基因多步驟進(jìn)行的動(dòng)態(tài)過程，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。真核細(xì)胞翻譯起始因子-4E（eIF4E）是AKT/mTOR 信號(hào)通道、MAPK/MnK 信號(hào)通路的中心集結(jié)點(diǎn)，AKT/mTOR信號(hào)通路激活可誘導(dǎo)eIF4E活性異常表達(dá)，進(jìn)一步激活腫瘤相關(guān)蛋白（VEGF、MMP-9、bcl-2 等）的表達(dá)，促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［11］。有研究報(bào)道［12］eIF4E 的異常表達(dá)與多種人類惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、鼻咽癌等。MAPK作用激酶1（pMnK1）是催化eIF4E 磷酸化的主要激酶。pMnK1通過促進(jìn)與eIF4E 相互結(jié)合，形成pMnK1-eIF4E 復(fù)合物，促進(jìn)eIF4E Ser-209 磷酸化，增強(qiáng)與mRNA 帽型結(jié)構(gòu)的親和力，提高mRNA 帽性依賴蛋白的翻譯效率，最終促進(jìn)腫瘤相關(guān)蛋白合成，是腫瘤生長增殖的關(guān)鍵過程。有研究報(bào)道［13］eIF4E 磷酸化活性異常高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞因子、炎癥因子的表達(dá)，是多種惡性腫瘤預(yù)后差的標(biāo)志。有研究通過給予MnK1抑制劑發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的生長速度減慢，腫瘤轉(zhuǎn)移得到控制。說明MnK1抑制劑可通過MnK1失活，特異性靶向抑制eIF4E 磷酸化，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腸癌移植瘤的生長和黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌病人較對照組病人相比，pMnK1蛋白陽性率顯著上升，且與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。與既往研究報(bào)道一致［14-15］。說明MnK1 磷酸化水平與鼻咽癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、生存期密切相關(guān)。提示，臨床可針對抑制MnK1 磷酸化活性藥物靶向抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖分化，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而特異性抗癌，提高治療效果的同時(shí)，降低不良反應(yīng)的發(fā)生。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，pMnK1蛋白表達(dá)陽性的鼻咽癌病人其生存時(shí)間顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明抑制MnK1 磷酸化是治療鼻咽癌延長病人生存期的重要治療思路。

綜上所述，鼻咽癌組織中pMnK1 蛋白呈高表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及不良預(yù)后關(guān)系密切。本研究創(chuàng)新處，不僅從分子機(jī)制確定pMnK1 蛋白水平在鼻咽癌診斷和病情評估中的臨床價(jià)值，且為鼻咽癌的靶向治療提供新的思路，具有重要的臨床指導(dǎo)意義。