宋穎，諸佩超，周維，繆穎波，徐翀

（上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海，200126）

抗凝血酶是血漿中重要的生理性抗凝蛋白,主要由肝臟合成?？鼓甘悄傅闹饕种莆?它還可以中和凝血途徑中的其他絲氨酸蛋白酶,如凝血因子IXa、Xa、XIa、XIIa 等?？鼓甘强鼓鞍讬z測(cè)系統(tǒng)中的一個(gè)重要的檢測(cè)項(xiàng)目,目前不僅限于獲得性或遺傳性抗凝血酶缺陷的診斷,也廣泛地應(yīng)用于早期DIC 監(jiān)測(cè)、靜脈血栓高風(fēng)險(xiǎn)人群的篩查、感染性和過(guò)敏性炎癥的監(jiān)測(cè)、抗凝血酶替代療法的監(jiān)測(cè)、肝素類藥物監(jiān)測(cè)等。[1]近年來(lái)開(kāi)展抗凝血酶檢測(cè)項(xiàng)目的醫(yī)療機(jī)構(gòu)呈逐年增多趨勢(shì)。

抗凝血酶的分析可分為抗凝血酶活性檢測(cè)和含量檢測(cè),分別采用發(fā)色底物法和酶聯(lián)免疫法(ELISA)。目前在全自動(dòng)血凝分析儀上,采用發(fā)色底物法檢測(cè)抗凝血酶活性的臨床實(shí)驗(yàn)室占主流。

國(guó)際上多家室間質(zhì)評(píng)機(jī)構(gòu)如:英國(guó)國(guó)家室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃(The United Kingdom National External Quality Assessment Scheme,UK NEQAS),荷蘭診斷分析與檢測(cè)外部質(zhì)控(External quality Control of diagnostic Assays and Tests,ECAT)[2]、美國(guó)臨床病理家學(xué)會(huì)(College of American Pathologists,CAP)[3]均開(kāi)展了抗凝血酶室間質(zhì)評(píng)。上海市臨床檢驗(yàn)中心(Shanghai Center for Clinical Laboratory,SCCL)是上海市臨床檢驗(yàn)質(zhì)量控制組織評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu),為了加強(qiáng)抗凝血酶檢測(cè)項(xiàng)目的質(zhì)量管理,從2016年開(kāi)展此項(xiàng)目的室間質(zhì)評(píng)和地區(qū)性室內(nèi)質(zhì)控室間化工作。本研究旨在通過(guò)分析2016—2021年12 次室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)反饋結(jié)果,了解上海市及部分其他地區(qū)抗凝血酶檢測(cè)開(kāi)展情況及檢測(cè)質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 室間質(zhì)評(píng)樣本制備 采用商品化制品(上?；葜猩锟萍加邢薰綪retrol 凝血七項(xiàng)非定值質(zhì)控品),以人血漿為基礎(chǔ),添加了高純度生物提取物、穩(wěn)定劑等,性狀為真空冷凍干燥制品。配制的抗凝血酶活性范圍為(低值17%～29%,中值34%～56%,高值74%～110%)。每次室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)使用的質(zhì)評(píng)樣本均經(jīng)均勻性和穩(wěn)定性評(píng)估,以排除質(zhì)評(píng)樣本本身質(zhì)量對(duì)質(zhì)量評(píng)價(jià)的影響。

1.2 室間質(zhì)評(píng)方案設(shè)計(jì) 每年進(jìn)行2 次室間質(zhì)評(píng)活動(dòng),每次發(fā)放5 個(gè)不同水平樣本。要求參加實(shí)驗(yàn)室根據(jù)臨床標(biāo)本的常規(guī)操作方法進(jìn)行檢測(cè),并在規(guī)定日期內(nèi)(樣本接收后3 天內(nèi))將檢測(cè)結(jié)果通過(guò)網(wǎng)絡(luò)端口上報(bào)至SCCL 數(shù)據(jù)庫(kù),超過(guò)規(guī)定時(shí)間系統(tǒng)將不再接收數(shù)據(jù)。

1.3 結(jié)果評(píng)價(jià) 依據(jù)回報(bào)結(jié)果評(píng)價(jià)各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果間的一致性,按照兩種統(tǒng)計(jì)匯總方式進(jìn)行分析。(1)分組原則:一種按所有參加調(diào)查的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)匯總,即不分組;另一種按檢測(cè)試劑品牌分組。(2)統(tǒng)計(jì)分析采用一般統(tǒng)計(jì)描述:檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布,并計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差(s)及變異系數(shù)(CV%)。(3)合格評(píng)價(jià):靶值:格拉布斯準(zhǔn)則剔除離群值后的平均值。各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果與靶值的相對(duì)偏差小于TEA(15%)為符合。以總成績(jī)≥80 分(即5 個(gè)樣本中4個(gè)符合)為合格。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總,并對(duì)超出范圍的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)方式 本文采用SPSS Statistics 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)6年的室間質(zhì)評(píng)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并采用正態(tài)分布對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行描述。

2 結(jié) 果

2.1 總體分布情況 2016—2021年參加抗凝血酶檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室數(shù)增長(zhǎng)情況見(jiàn)表1,參加的實(shí)驗(yàn)室數(shù)成顯著增加趨勢(shì)。參加實(shí)驗(yàn)室以上海本地實(shí)驗(yàn)室為主,占所有參加實(shí)驗(yàn)室的98%。

表1 2016—2021年參加抗凝血酶檢測(cè)項(xiàng)目室間質(zhì)評(píng)的實(shí)驗(yàn)室數(shù)

2.2 按照室間質(zhì)評(píng)樣本活性分類,每次參與室間質(zhì)評(píng)的實(shí)驗(yàn)室回饋的總均值、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)、變異系數(shù)(CV)%見(jiàn)表2。

表2 2016—2021年抗凝血酶檢測(cè)所有樣本的總均值、SD 和CV%匯總情況

不對(duì)儀器和試劑分組,數(shù)據(jù)結(jié)果匯總高值樣本的CV%值為3.2～7.0,中位數(shù)為4.3;中值樣本的CV%為4.3～8.3,中位數(shù)為6.3;低值樣本的CV%為6.6～13.9,中位數(shù)為9.0。2016年至2021年總體CV 值呈逐步降低趨勢(shì)。此結(jié)果為剔除離群值后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

經(jīng)與離群值所在實(shí)驗(yàn)室溝通,產(chǎn)生離群值的原因?yàn)闄z測(cè)前未對(duì)更換試劑批號(hào)后的儀器進(jìn)行定標(biāo)操作。

2.3 各檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室所采用的檢測(cè)系統(tǒng)分布情況見(jiàn)表3

表3 各檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室所采用的檢測(cè)系統(tǒng)分布情況

其中SYS 系統(tǒng)與I 系統(tǒng)的市場(chǎng)占有率較高。其余檢測(cè)系統(tǒng)也呈現(xiàn)逐年增多的趨勢(shì)。

2．4 兩種具有代表性的檢測(cè)系統(tǒng)間的一致性比較通過(guò)各檢測(cè)系統(tǒng)的平均值，標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV%）三個(gè)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)反映兩個(gè)主流檢測(cè)系統(tǒng)間的一致性（SYS 檢測(cè)系統(tǒng)和I 檢測(cè)系統(tǒng)），共計(jì)60 次調(diào)查數(shù)據(jù)（每個(gè)調(diào)查發(fā)放5 個(gè)樣本，一年發(fā)放2 批，共計(jì)6年）。參見(jiàn)圖1?3。

圖1 兩個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)間平均值比較

圖2 兩個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)間SD 比較

由圖所示,兩個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的抗凝血酶檢測(cè)結(jié)果間有較好的一致性,I 檢測(cè)系統(tǒng)每次調(diào)查的平均值略高于SYS 檢測(cè)系統(tǒng)。室間質(zhì)評(píng)低值樣本系統(tǒng)間的CV%分別為(檢測(cè)系統(tǒng)1:5.5～12.4,中位數(shù)8.0;檢測(cè)系統(tǒng)2:4.2～17.0,中位數(shù)為4.2)。室間質(zhì)評(píng)中值樣本系統(tǒng)間的CV%分別為(檢測(cè)系統(tǒng)1:3.3～9.2,中位數(shù)5.5;檢測(cè)系統(tǒng)2:2.9～8.9,中位數(shù)為2.9)。室間質(zhì)評(píng)高值樣本系統(tǒng)間的CV%分別為(檢測(cè)系統(tǒng)1:2.2～7.1,中位數(shù)3.2;檢測(cè)系統(tǒng)2:2.3～6.3,中位數(shù)為3.5)。兩個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),其組均值、SD 和CV%的p 值分別為P＜0.0001、P=0.0741、P=0.2512(以P＞0.05)。兩個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)間的均值存在顯著性差異外(SYS 檢測(cè)系統(tǒng)與I 檢測(cè)系統(tǒng)之間的偏倚為4.5%),SD 和CV%均無(wú)顯著性差異。

圖3 兩個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)間CV%比較

將兩個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的60 次調(diào)查數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析后得出圖4。

圖4 兩檢測(cè)系統(tǒng)間60 次調(diào)查數(shù)據(jù)回歸分析

由圖所示,兩者間的相關(guān)系數(shù)R2=0.9935,回歸方程為y=1.076x－1.451。

由此可見(jiàn),兩種檢測(cè)系統(tǒng)間的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)較好相關(guān)性。

3 討 論

抗凝血酶檢測(cè)作為抗凝蛋白系統(tǒng)的重要組成部分,其檢測(cè)價(jià)值越來(lái)越得到臨床醫(yī)生的關(guān)注。從參與室間調(diào)查開(kāi)展的實(shí)驗(yàn)室數(shù)量來(lái)看5年來(lái)呈逐年增加趨勢(shì)。從2016年開(kāi)始,上海市臨床檢驗(yàn)中心在室間質(zhì)評(píng)中增加抗凝血酶項(xiàng)目并在此基礎(chǔ)上又開(kāi)展蛋白C 和蛋白S 兩個(gè)項(xiàng)目的室間質(zhì)評(píng),目的在于為上海地區(qū)或其他地區(qū)的實(shí)驗(yàn)室提供能力驗(yàn)證服務(wù)。從5年來(lái)匯總的情況看,各實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)均小于15%,屬于一致性較好的項(xiàng)目之一。分析原因可能有以下幾點(diǎn):1.抗凝血酶項(xiàng)目具有可以溯源的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品,此標(biāo)準(zhǔn)品可以從NIBSC 的官網(wǎng)獲得(NIBSC code:06/166)。2.各儀器和試劑生成廠家通過(guò)溯源鏈建立各自的檢測(cè)系統(tǒng),提供相應(yīng)的定標(biāo)品、檢測(cè)儀器和試劑。3.實(shí)驗(yàn)室操作人員遵照質(zhì)量管理要求按操作規(guī)程在檢測(cè)前對(duì)儀器進(jìn)行定標(biāo)操作。依據(jù)CLSI H57-A 文件要求,血凝分析儀在臨床標(biāo)本檢測(cè)前應(yīng)進(jìn)行性能驗(yàn)證,并在使用新批號(hào)檢測(cè)試劑或質(zhì)控結(jié)果失控等情況下進(jìn)行定標(biāo)操作。[4]4.實(shí)驗(yàn)室操作人員質(zhì)量控制意識(shí)增強(qiáng),遵照質(zhì)量管理要求進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控,參加室間質(zhì)評(píng),提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心(原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心)已于2017年開(kāi)展抗凝蛋白檢測(cè)現(xiàn)狀全國(guó)性調(diào)查和分析。從統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來(lái)看,參加抗凝血酶調(diào)查的實(shí)驗(yàn)室為194 家,正常水平質(zhì)控物檢測(cè)結(jié)果的CV 范圍為5.7%-12.9%;異常水平質(zhì)控物的CV 范圍為13.3%～38.3%。不同實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果可比性較差。[5]

抗凝血酶試劑檢測(cè)的技術(shù)路線采用兩種方式,一種基于牛凝血酶(Bovine Thrombin),另一種基于凝血因子X(jué)a(Factor Xa),各儀器、試劑生產(chǎn)廠商提供相應(yīng)的試劑種類用于檢測(cè)。目前上海地區(qū)使用的兩個(gè)主要的檢測(cè)系統(tǒng)分別采用這兩種方式,兩個(gè)主要檢測(cè)系統(tǒng)相關(guān)性數(shù)據(jù)分析,相關(guān)性很好R2=0.9935回歸方程為y=1.076x－1.451,但系統(tǒng)間平均值存在顯著性差異,偏倚中位數(shù)為4.9%。

本中心為了提升自身檢測(cè)能力參加世界衛(wèi)生組織(WHO)委托英國(guó)能力驗(yàn)證提供機(jī)構(gòu)UK NEQAS 組織的抗凝血酶室間質(zhì)評(píng),從回饋的結(jié)果分析,本實(shí)驗(yàn)室具備抗凝血酶檢測(cè)能力。UK NEQAS 按照試劑品牌將參加實(shí)驗(yàn)室分為不同組別。我們所參加的UK NEQAS 將近14 次室間質(zhì)評(píng)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析,SYS 系統(tǒng)與I 系統(tǒng)回歸方程為y=1.2595x－19.453,R2=0.9756,P＜0.0001,偏倚的中位數(shù)為3.9%,與本中心組織的室間質(zhì)評(píng)的結(jié)果基本一致。參加UK NEQAS 室間質(zhì)評(píng)的實(shí)驗(yàn)室數(shù)共計(jì)330 家,其中采用牛凝血酶的實(shí)驗(yàn)室為110 家,采用凝血因子X(jué)a 的實(shí)驗(yàn)室為217 家,其他方法的3 家。

基于抗凝血酶檢測(cè)項(xiàng)目具有可溯源的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品,UK NEQAS 在能力驗(yàn)證報(bào)告中還提供抗凝血酶活性檢測(cè)項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)不確定度中位數(shù)的結(jié)果。此外,在荷蘭一個(gè)名為“校準(zhǔn)2000”的室間質(zhì)評(píng)項(xiàng)目中,研究了抗凝血酶活性測(cè)定的一致性。通過(guò)多中心互換性研究設(shè)計(jì),分析了新鮮冷凍的患者血漿和三個(gè)候選的校準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果,比較30 個(gè)實(shí)驗(yàn)室(荷蘭)組成15對(duì)抗凝血酶檢測(cè)結(jié)果,并根據(jù)最佳標(biāo)準(zhǔn)殘差(SDSA)評(píng)估候選校準(zhǔn)品的互換性。所得的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行回歸線分析,呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)按照3SD 確定范圍。這些候選校準(zhǔn)品可用于一致性研究,調(diào)整抗凝血酶檢測(cè)結(jié)果。使用這些校準(zhǔn)品后,抗凝血酶結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室間變異系數(shù)(CV)從6.9%～13.2%(調(diào)整前)減小至5.6%～9.8%。[6]目前上海市臨床檢驗(yàn)中心尚未開(kāi)展凝血項(xiàng)目相關(guān)的溯源性研究,缺乏溯源性的體系和算法,這六年的室間調(diào)查數(shù)據(jù)也為今后的標(biāo)準(zhǔn)化工作提供數(shù)據(jù)支持,有助于提高抗凝血酶檢測(cè)的一致性。