陳穎，李康路，鄭立△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021；3.廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心 廣西—東盟重大疾病預(yù)防協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530021）

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種漸進(jìn)性、致殘性疾病，影響患者的關(guān)節(jié)軟骨及滑膜關(guān)節(jié)。軟骨細(xì)胞、滑膜及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中的異常關(guān)節(jié)組織會(huì)導(dǎo)致軟骨退化、滑膜炎癥以及骨贅和軟骨下囊腫的形成[1]。研究表明，活性氧（ROS）是OA發(fā)展過程中的重要因素。據(jù)報(bào)道，正常關(guān)節(jié)中維持低水平的ROS，而在OA患者的關(guān)節(jié)中ROS的過度產(chǎn)生引起過氧化、蛋白質(zhì)羰基化和DNA損傷，被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞丟失和組織損傷的主要機(jī)制[2]。聚多巴胺（PDA）是一種由多巴胺（DA）自聚合產(chǎn)生的多功能納米顆粒（NP），具有清除ROS的能力，具有豐富的還原基團(tuán)，如兒茶酚和醌[3-4]。然而，目前很少有研究評(píng)估PDA在OA治療中的應(yīng)用，此外，PDA能否調(diào)控細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生及其特異性調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討PDA在炎癥環(huán)境下通過清除ROS促進(jìn)OA修復(fù)的作用，以期為OA的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD乳鼠，3～7日齡，體重10～15 g，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（桂）2020-0003，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（桂）2020-0004。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及處置均已取得廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，審批號(hào)：202112004。

1.2主要試劑 鹽酸多巴胺（Aladdin，中國(guó)）；無水乙醇、氨水（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)）；總抗氧化能力（T-AOC）檢測(cè)試劑盒（Solarbio，中國(guó)）；75%酒精（廣西博恒醫(yī)療用品有限公司）；胎牛血清、高糖培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；鈣黃綠素（Calcein-AM）、30%過氧化氫（H2O2）（成都金山化學(xué)試劑有限公司）；CCK-8試劑盒（賽國(guó)生物科技有限責(zé)任公司，中國(guó)）；ROS檢測(cè)試劑盒（Beyotime，中國(guó)）；白細(xì)胞介素-6（IL-6）抗體、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（博士德生物工程有限公司，美國(guó)）；山羊血清（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；總RNA提取試劑盒（Magon，美國(guó)）；基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-3、MMP-13、一氧化氮合成酶（iNOS）、Ⅱ型膠原纖維α1（COL2A1）PCR引物（金開瑞，中國(guó)）。

1.3 PDA的制備[5]在130 mL去離子水和無水乙醇的混合溶液（40 mL無水乙醇+90 mL去離子水）中加入3 mL氨水，調(diào)節(jié)pH至8.5，攪拌30 min，加入含0.5 g鹽酸多巴胺的去離子水10 mL，攪拌后靜置24 h；10 000 r/min離心5 min，收集沉淀，用超純水洗滌3～4次，最后將PDA放入冷凍干燥機(jī)中干燥24 h，備用。

1.4 PDA的表征 取部分干燥后的PDA進(jìn)行SEM、XRD和FTIR表征，另外取少量PDA通過超聲使其均勻分散于超純水中，用于TEM檢測(cè)。

1.5 T-AOC的檢測(cè) 配置不同濃度（0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200μg/mL）的PDA溶液。按照T-AOC試劑盒說明書步驟檢測(cè)PDA的抗氧化能力。

1.6軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死乳鼠，75%酒精浸泡消毒；在無菌條件下取雙側(cè)股骨頭和膝關(guān)節(jié)，置于含2%青—鏈霉素的PBS緩沖液中，去除軟骨周圍肌肉、血管等；將軟骨剪為0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm小塊，用0.2%胰蛋白酶消化30～40 min后，用0.02%的Ⅱ型膠原酶消化過夜，1 000 r/min離心5 min，分離出游離的軟骨細(xì)胞；置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換1次DMEM（高糖）培養(yǎng)基，細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。使用第3～4代軟骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.7 CCK-8法檢測(cè)軟骨細(xì)胞增殖 將軟骨細(xì)胞接種于96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為8×103個(gè)/孔，培養(yǎng)12 h后，去除培養(yǎng)基，加入100μL不同濃度的PDA（實(shí)驗(yàn)組），并設(shè)空白組，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；去除培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗2次，加入100μL含CCK-8溶液的無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處各孔的吸光度（OD）值。計(jì)算細(xì)胞增殖率，即（OD值實(shí)驗(yàn)組-OD值空白組）/（OD值對(duì)照組-OD值空白組）×100%。

1.8鈣黃綠素（Calcein-AM）染色檢測(cè)細(xì)胞活性

將軟骨細(xì)胞分為正常組、模型組和處理組。模型組加入1 mL含H2O2的無血清培養(yǎng)基，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)0.5 h。處理組加入PDA處理24 h。PBS緩沖液清洗2次，加入0.03% Calcein-AM、0.15%EthD-I染色試劑，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育5 min，PBS緩沖液清洗3～4次去除過量的熒光試劑，熒光正置顯微鏡下觀察細(xì)胞情況并拍照。Image J軟件統(tǒng)計(jì)活死細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算軟骨細(xì)胞增殖率。

1.9 DCFH-DA熒光探針檢測(cè)軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS水平 分組處理細(xì)胞后，PBS緩沖液清洗，加入10μmol/L DCFH-DA熒光探針稀釋液（1∶1 000）1 mL，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，用無血清培養(yǎng)基輕輕吹洗去除過量熒光試劑，熒光正置顯微鏡下觀察、拍照。用Image J軟件分析綠色熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度越高，表明細(xì)胞ROS水平越高。

1.10免疫熒光染色檢測(cè)軟骨細(xì)胞中IL-6的表達(dá)

分組處理細(xì)胞后，加入4%多聚甲醛固定10 min，3%H2O2孵育15 min，山羊血清孵育30 min；滴加一抗（IL-6，1∶200）4℃冰箱孵育過夜，PBS緩沖液清洗2次，滴加二抗（1∶200）37℃避光孵育1.5 h，PBS緩沖液清洗2次；用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核（藍(lán)色），室溫下避光孵育10 min，PBS緩沖液清洗2次。熒光顯微鏡下觀察、拍照。Image J軟件分析綠色熒光強(qiáng)度，即IL-6的表達(dá)水平。

1.11 RT-qPCR法檢測(cè)炎癥相關(guān)基因及軟骨特異性基因的表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，Light Cycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行qPCR反應(yīng)。以GAPDH作為內(nèi)參，檢測(cè)炎癥基因MMP-3、MMP-13和iNOS和軟骨特異性基因COL2A1的表達(dá)。引物序列見表1，使用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 8.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SEM和TEM表征SEM和TEM的結(jié)果表明PDA納米粒子成功合成，且在水溶液中具有良好分散性。PDA呈大小均一的球形，直徑在100～150 nm左右，見圖1。

圖1 PDA電鏡圖

2.2 XRD和FTIR表征XRD對(duì)PDA的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，在2θ=22.9o處出現(xiàn)窄而強(qiáng)的峰（圖2A），代表PDA的成功合成；FTIR進(jìn)一步驗(yàn)證，3 356 cm-1處的波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)—OH和—NH峰，1 606 cm-1、1 415 cm-1和1 288 cm-1處的波長(zhǎng)分別代表C=O、C=C和C—O。在約700 cm-1處的吸收帶PDA明顯弱于DA，表明在PDA中芳香族結(jié)構(gòu)的減少和預(yù)期的聚合反應(yīng)的減少，見圖2B。

圖2 PDA的XRD和FTIR表征

2.3 PDA的抗氧化能力當(dāng)PDA濃度為20μg/mL時(shí)，總抗氧化能力提高，且其總抗氧化水平隨著PDA濃度的增加而升高，見圖3。

圖3 PDA的T-AOC檢測(cè)結(jié)果

2.4 PDA對(duì)軟骨細(xì)胞的毒性作用CCK-8結(jié)果顯示：當(dāng)PDA的濃度低于100 μg/mL時(shí)，對(duì)軟骨細(xì)胞無明顯毒性作用，見圖4。因此，選擇100μg/mL的PDA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖4 CCK8檢測(cè)PDA對(duì)軟骨細(xì)胞的毒性作用

2.5 3組軟骨細(xì)胞活性及細(xì)胞內(nèi)ROS水平比較

與正常組比較，模型組軟骨細(xì)胞增殖率降低，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高；而經(jīng)PDA處理后，細(xì)胞增殖率升高，細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低，見圖5。

圖5 3組軟骨細(xì)胞活性及細(xì)胞內(nèi)ROS水平比較

2.6 3組軟骨細(xì)胞中IL-6蛋白表達(dá)比較 與正常組比較，模型組IL-6蛋白表達(dá)升高；而經(jīng)PDA處理后，IL-6蛋白表達(dá)降低，見圖6。

圖6 免疫熒光顯示IL-6的表達(dá)情況（×100）

2.7 3組軟骨細(xì)胞中MMP-3、MMP-13、COL2A1、iNOS基因表達(dá)比較 模型組MMP-3、MMP-13及iNOS的基因表達(dá)均高于正常組，而COL2A1表達(dá)低于正常組；與模型組比較，處理組MMP-3、MMP-13和iNOS表達(dá)下降，而COL2A1表達(dá)上升，見圖7。

圖7 炎癥相關(guān)基因和軟骨特異性基因的表達(dá)

3 討論

PDA來自海洋貽貝，具有獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)，包括高光熱轉(zhuǎn)移效率、良好的藥物結(jié)合能力、廣泛的黏附能力以及良好的生物相容性和生物降解性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展示出巨大潛力[6]。本研究中，電鏡結(jié)果顯示PDA呈均一球形，XRD在22.9o出現(xiàn)特征峰，表明PDA的成功合成[7]；FTIR在3 356 cm-1、1 616 cm-1、1 415 cm-1、1 288 cm-1出現(xiàn)的特征峰進(jìn)一步得到驗(yàn)證[8]。

OA中過量ROS的產(chǎn)生會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，縮短軟骨細(xì)胞生命周期，降低軟骨基質(zhì)代謝，并導(dǎo)致滑膜炎癥和軟骨細(xì)胞功能障礙[9]。因此，清除過量ROS可作為治療OA的策略。本研究結(jié)果顯示，PDA能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，降低軟骨細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。表明PDA對(duì)軟骨細(xì)胞具有保護(hù)作用。炎癥因子的過表達(dá)會(huì)造成骨組織及軟骨組織的破壞[10]。降低炎癥因子的過度表達(dá)在延緩OA的進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，PDA能夠下調(diào)MMP-3、MMP-13、iNOS基因及IL-6蛋白表達(dá)，上調(diào)軟骨特異性基因COL2A1表達(dá)。表明PDA能抑制H2O2誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，促進(jìn)Ⅱ型膠原的合成。此外，T-AOC檢測(cè)結(jié)果表明，PDA具有一定的抗氧化能力，這與DCFH-DA熒光探針檢測(cè)軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS水平的結(jié)果相一致，且隨著PDA濃度增加，其抗氧化水平升高。

綜上所述，PDA能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞氧化損傷和炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞存活，有望成為治療OA的一種新型生物材料。