付式杰，李愛民，吳曉磊，李子杰*

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122）（2.國珍健康科技(北京)有限公司，北京 102206）

蔓越莓為常綠小灌木矮蔓藤植物，主要生長于北半球涼爽地帶的酸性土壤中，表皮鮮紅，口感酸甜清爽，目前已獲得人們的青睞[1]。蔓越莓中具有較高含量的花青素、原花青素、花青苷、黃酮醇類以及酚酸類物質(zhì)，其中原花青素具有極強的清除人體內(nèi)自由基[2]、抑菌[3]和抗炎癥活性[4]，在國際上受到了廣泛關(guān)注。由于蔓越莓中含有大量具有生理活性的天然化學(xué)成分，其功能也被越來越多的學(xué)者進(jìn)行研究。有研究表明，P菌毛陽性大腸桿菌是導(dǎo)致尿路感染主要毒力因子之一[5]，甚至是導(dǎo)致急性腎盂腎炎的罪魁禍?zhǔn)譡6]，然而，服用蔓越莓汁可顯著降低兒童患尿路感染的風(fēng)險[7]。Liu等[8]通過熱力學(xué)方法計算并比較吉布斯自由能和界面張力的變化，也證明了當(dāng)P菌毛陽性大腸桿菌暴露在蔓越莓汁中時，其粘附性將會降低。詹凡等[9]的研究表明，是蔓越莓中大量活性成分使其具有較好的抗尿路感染的功能，并有研究通過UHPLC-DADMS/MS篩選出蔓越莓汁中的生物活性成分，發(fā)現(xiàn)其對多種致病菌均有較好的抗菌活性[10]。

另外，蔓越莓的抗炎癥功能也引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。Mary等[11]的研究表明野生蔓越莓中的總酚和原花青素含量均高于野生藍(lán)莓，且能對RAW 264.7細(xì)胞因脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激而分泌的IL-1β產(chǎn)生劑量依賴性抑制，且用蔓越莓提取物處理人單核細(xì)胞系THP-1并用LPS進(jìn)行刺激，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過蔓越莓提取物處理的細(xì)胞腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factorα，TNF-α）含量顯著低于對照組，且一些炎癥相關(guān)基因的表達(dá)也被顯著下調(diào)[12]，表明蔓越莓提取物中的生物活性成分具有較好的抗炎效果。為獲得生物活性較高的蔓越莓制品，本文比較評價了市售和從新時代健康產(chǎn)業(yè)（集團）有限公司獲得的三種蔓越莓制品。其中包括市售的高濃度蔓越莓精華（High Strength Cranberry）；將蔓越莓壓榨后，取其果汁凍干，制成的蔓越莓果汁粉（MYMFA）；壓榨后取其果汁與全果凍干得到的蔓越莓全果粉（MYMFB）和對蔓越莓中的原花青素進(jìn)行提取，制成蔓越莓提取物粉（MYMFC）四種蔓越莓制品。

目前常用的炎癥動物模型包括二甲苯致小鼠耳腫脹模型、大鼠足趾腫脹增加模型等[13]。然而由于嚙齒動物模型周期長，成本高，若大量使用很難滿足倫理要求。而斑馬魚模型由于具有繁殖快、成本低，身體透明且免疫細(xì)胞類型與人類相同等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌或病毒感染性模型中[14,15]。因此本文選用轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞熒光斑馬魚，構(gòu)建P菌毛陽性大腸桿菌感染模型，從而評價三種蔓越莓制品的抑菌與抗炎癥能力。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞熒光斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進(jìn)行。年齡為受精后 4 d（4 day post-fertilization，4 dpf），共900尾用于進(jìn)行濃度摸索實驗，每實驗組為30尾；共480尾用于抗感染作用評價實驗，每實驗組為30尾。

斑馬魚飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚用水中（水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480～510 μS/cm；pH為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3），由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司養(yǎng)魚中心繁殖提供，實驗動物使用許可證號為：SYXK（浙）2012-0171。飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC認(rèn)證的要求。

1.2 材料與試劑

三金片，綠色薄膜衣片，0.29 g/片，實驗前用超純水配制成100 mg/mL的母液，-20 ℃保存；“MYMFA”，暗紅色粉末，現(xiàn)配現(xiàn)用?！癕YMFB”，暗紅色粉末，現(xiàn)配現(xiàn)用?！癕YMFC”，暗紅色粉末，現(xiàn)配現(xiàn)用，上述藥品均由新時代健康產(chǎn)業(yè)（集團）有限公司提供；“High Strength Cranberry”（市售，SWISS公司），紅棕色膠囊，25 g/顆，除去膠囊殼，取其內(nèi)部粉末，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 儀器與設(shè)備

SMZ645解剖顯微鏡，Nikon公司；6孔板，Nest Biotech；CP214精密電子天平，奧豪斯；IM-300顯微注射儀，Narishige；PC-10拉針儀，日本Narishige；AZ100電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡，Nikon公司。

1.4 方法

1.4.1 蔓越莓制品無可見有害作用水平（No Observed Adverse Effect Level，NOAEL）的確定

隨機選取4 dpf轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞熒光斑馬魚，用養(yǎng)魚用水分別水溶給予檢測濃度為100、500、1000、1500和2000 μg/mL的三金片、High Strength Cranberry、MYMFA、MYMFB、MYMFC，同時設(shè)置正常對照組（即養(yǎng)魚用水處理斑馬魚），每實驗組為30尾斑馬魚，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至5 dpf。在實驗過程中，每天觀察記錄斑馬魚的死亡情況并移除死亡的斑馬魚。待測制品處理結(jié)束后，統(tǒng)計各實驗組的斑馬魚死亡數(shù)量，確定三金片與四種蔓越莓制品對斑馬魚的NOAEL。

1.4.2 蔓越莓制品抗感染作用評價實驗

1.4.2.1 蔓越莓制品評價濃度的確定

根據(jù)三金片與4種蔓越莓制品NOAEL摸索實驗的結(jié)果，選取NOAEL及其濃度的1/3、1/9作為后續(xù)實驗中三金片與4種蔓越莓制品的給藥濃度。

1.4.2.2 造模

將培養(yǎng)好的P菌毛陽性大腸桿菌，使用熒光染料CM-Dil標(biāo)記后，以吞咽的方式移植到4 dpf轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞熒光斑馬魚腸腔內(nèi)，建立斑馬魚細(xì)菌感染模型，并根據(jù)斑馬魚腸腔內(nèi)是否帶有熒光判別是否造模成功。

1.4.2.3 蔓越莓制品抗感染效果的評價

通過將三金片與4種蔓越莓制品溶于養(yǎng)魚水中分別對造模成功的斑馬魚進(jìn)行給藥，給藥濃度以1.4.2.1確定的濃度為準(zhǔn)，每個實驗組為30尾斑馬魚，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。另外對造模成功的30尾斑馬魚不進(jìn)行給藥處理，在相同條件下培養(yǎng)，作為模型對照組。培養(yǎng)至5 dpf時，每個實驗組隨機選擇10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照并保存圖片；利用尼康NIS-Elements D 3.10高級圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計算斑馬魚腸腔內(nèi)細(xì)菌的熒光強度（S）和中性粒細(xì)胞個數(shù)（N），分別定量評價5個樣品對細(xì)菌感染斑馬魚的抗菌消炎作用。

蔓越莓制品抑菌率和炎癥消退率計算公式如下：

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS通過Dunnett’sT-檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，p＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異，p＜0.01為具有顯著性差異，p＜0.001為具有極顯著差異；使用GraphPad Prism 8繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 三金片和蔓越莓制品NOAEL水平的確定

本研究將每個實驗組的30尾4 dpf轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞熒光斑馬魚，分別通過養(yǎng)魚用水，水溶給予檢測濃度為100、500、1000、1500和2000 μg/mL的三金片、High Strength Cranberry、MYMFA、MYMFB、MYMFC后，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至5 dpf。在此過程中，斑馬魚在正常對照組和給予100、500、1000、1500、2000 μg/mL濃度4種蔓越莓制品的實驗組中均未出現(xiàn)死亡的情況；三金片在檢測濃度為100、500和1000 μg/mL的實驗組中斑馬魚亦未出現(xiàn)死亡情況；而在1500 μg/mL濃度組斑馬魚死亡13尾，死亡率為43.33%；2000 μg/mL濃度組斑馬魚死亡19尾，死亡率為63.33%（詳見表1）。

表1 不同實驗組中的斑馬魚在不同給藥濃度（μg/mL）下的死亡率對照表Table 1 Mortality of zebrafish after given different concentrations (μg/mL) of different sample

根據(jù)上述結(jié)果，確定三金片對斑馬魚的NOAEL為1000 μg/mL，4種蔓越莓制品的NOAEL均為2000μg/mL。另外，斑馬魚在三金片濃度為1500 μg/mL、2000 μg/mL時均出現(xiàn)死亡，且濃度越高，死亡率越高，表明高濃度的三金片對斑馬魚具有毒副作用，而4種蔓越莓制品在相同濃度下并未并對斑馬魚的活力產(chǎn)生影響，與三金片相比，四種蔓越莓制品均具有更高的安全性。

2.2 蔓越莓制品抗感染效果的評價

2.2.1 給藥濃度的選取

在之前研究的基礎(chǔ)上分別選取斑馬魚對不同樣品的NOAEL及其1/3、1/9的濃度進(jìn)行給藥，由此評價蔓越莓制品的抗感染效果。最終確定，三金片給藥的低、中、高劑量分別為111、333和1000 μg/mL；4種蔓越莓制品給藥的低、中、高劑量分別為222、667和2000 μg/mL。

2.2.2 抑菌作用效果評價

對通過吞咽方式移植P菌毛陽性大腸桿菌的轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞斑馬魚分別給予三金片和4種蔓越莓制品后，斑馬魚體內(nèi)的熒光情況及熒光強度如圖1、圖2所示。圖中橙色熒光標(biāo)記為P菌毛陽性大腸桿菌，綠色為中性粒細(xì)胞，白色虛線部分為斑馬魚的腸道區(qū)域，此區(qū)域為分析細(xì)菌感染和炎癥的主要區(qū)域。由圖2可知，相對于模型組，經(jīng)過三金片和4種蔓越莓制品給藥的斑馬魚腸腔內(nèi)部熒光強度均有所降低，并且在給予低濃度（222 μg/mL）的MYMFB與MYMFC樣品后，腸腔內(nèi)部熒光強度分別降至11919和11432像素，與模型組相比呈現(xiàn)極顯著差異（***p＜0.001），且降低程度隨著給藥濃度的增加而增加，體現(xiàn)出了較好的劑量依賴關(guān)系。

經(jīng)過分析，三金片與4種蔓越莓制品的抑菌率如圖3所示，5種樣品均具有一定的抑菌能力，且抑菌能力呈現(xiàn)劑量依賴性。其中三金片的抑菌能力較好，在以高劑量（1000 μg/mL）進(jìn)行給藥時，抑菌率可以達(dá)到53.84%。然而，MYMFC在以相同NOVEL水平進(jìn)行給藥時，抑菌率達(dá)到了60.38%，高于三金片、High Strength Cranberry與MYMFA，表現(xiàn)出極強的抑菌能力。Rodríguez等[16]將蔓越莓中的活性物質(zhì)提取后，發(fā)現(xiàn)其具有極強的抑菌作用，并在進(jìn)行分離純化后證明原花青素A二聚體是其中抑菌活性最強的組分，可有效降低細(xì)菌粘附，其生物膜形成率和表面疏水性分別達(dá)到了3.52%和91%。Alejo等[17]研究了不同濃度的原花青素的抑菌效果并發(fā)現(xiàn)當(dāng)其濃度為0.1μg/mL時，對大腸桿菌生物膜形成的抑制率可達(dá)到30%。Silvan等[18]的研究表明，原花青素對幽門螺桿菌的生長有極強的抑制作用，與本研究中，含有最高原花青素含量的MYMFC具有最強的抑菌活性相符。因此，MYMFC極強的抑菌能力可能與其中高含量的原花青素有關(guān)。

2.2.3 蔓越莓制品炎癥消退作用效果的評價

中性粒細(xì)胞在炎癥過程中將遷移并聚集在炎癥部位，激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，從而激活炎癥小體[19]，并釋放大量炎癥因子及活性氧[20]，是參與組織炎癥損傷的主要細(xì)胞之一，其數(shù)量的變化是用來評估個體炎癥反應(yīng)的重要依據(jù)。本研究通過比較不同實驗組斑馬魚腸道區(qū)域中性粒細(xì)胞的數(shù)量評價蔓越莓制品的抗炎效果。

給予不同藥品及藥量的斑馬魚體內(nèi)的中性粒細(xì)胞數(shù)量如圖4所示。結(jié)果表明，在給予低、中、高濃度的High Strength Cranberry與MYMFA后，斑馬魚體內(nèi)的平均中性粒細(xì)胞數(shù)量分別39、37、30和40、38、31個，均小于模型對照組（43個），但均大于給予三金片、MYMFB和MYMFC后的平均中性粒細(xì)胞數(shù)量。其中斑馬魚在被給予高劑量的三金片后，其體內(nèi)的中性粒細(xì)胞平均數(shù)量降至23個，與模型組相比呈現(xiàn)出極顯著差異（***p＜0.001）。MYMFB雖然在高濃度給藥后，將斑馬魚中性粒細(xì)胞數(shù)量降至25個，稍高于三金片給藥組，但在中、低濃度給藥時均使斑馬魚中性粒細(xì)胞數(shù)量低于相同水平的三金片給藥組，展現(xiàn)出良好的抗炎能力。而MYMFC在各個濃度上的抗炎表現(xiàn)都優(yōu)于同NOAEL水平的三金片，在高劑量給藥后使中性粒細(xì)胞平均數(shù)量降至21個。

此外，四種樣品對斑馬魚的炎癥消退率如圖5所示，由圖可知三金片與4種蔓越莓制品均呈現(xiàn)出較好的炎癥消退作用，其炎癥消退率呈劑量依賴性。其中，三金片依然具有極顯著的炎癥消退作用（***p＜0.001），在給藥濃度為1000 μg/mL時，炎癥消退率達(dá)到46.51%；而在高、中、低三個劑量組中，MYMFB的炎癥消退率只在2000 μg/mL時略遜于同NOAEL水平的三金片（46.51%），明顯高于MYMFA（27.91%）與High Strength Cranberry（30.23%）；MYMFC樣品在各個給藥濃度均呈現(xiàn)出比同NOAEL水平的三金片更好的炎癥消退效果，當(dāng)給藥劑量為2000 μg/mL時炎癥消退率更是達(dá)到了51.16%。目前，多個研究已表明原花青素中的各種成分均具有較好的抗炎作用。Wang等[21]證明了原花青素A2可通過靶向核因子-κB、絲裂原活化蛋白激酶和NF-E2相關(guān)因子2通路抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激。Tian等[22]的研究證明了原花青素B2可通過激活PPARγ調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M2極化從而發(fā)揮其抗炎癥作用。在本文中，MYMFC由于具有最高含量的原花青素含量，故具有最為優(yōu)秀的炎癥消退能力，與已有的研究結(jié)果相符。而MYMFB雖然在抑菌方面表現(xiàn)一般，但卻具有三金片相仿的炎癥消退能力，其原因可能同樣歸結(jié)于原花青素。與MYMFA相比，MYMFB添加了蔓越莓原果壓榨后的果渣，有研究表明，原花青素與細(xì)胞壁多糖結(jié)合后可大大減緩其降解速率[23]，也正是因此，MYMFB的抗炎能力與MYMFA相比有了及其明顯的提高。

3 結(jié)論

3.1 本研究通過使用不同濃度的三金片和四種蔓越莓制品對4 dpf的斑馬魚進(jìn)行給藥，并將其培養(yǎng)至5 dpf。在此過程中，給予斑馬魚1500和2000 μg/mL三金片后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，而被給予蔓越莓制品的斑馬魚活力正常，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，表明三金片具有毒副作用，而蔓越莓制品相比于三金片，具有極高的安全性。3.2 此外相比于模型對照組，在經(jīng)過三金片與4種蔓越莓制品的給藥后，P菌毛陽性大腸桿菌感染的斑馬魚體內(nèi)的大腸桿菌與中性粒細(xì)胞熒光均有所減少，表明三金片與四種蔓越莓制品均具有顯著的抑菌與炎癥抑制作用（***p＜0.001）。其中原花青素含量最高的MYMFC的抑菌率和炎癥消退率最高，高于三金片和市售的High Strength Cranberry產(chǎn)品，表現(xiàn)出極佳的抗炎抑菌能力。相比于MYMFA，添加了原果的MYMFB明顯具有更好的抗炎抑菌活性，這可能得益于原花青素與蔓越莓原果細(xì)胞壁的結(jié)合，這種結(jié)合延緩了原花青素的降解。

3.3 綜上所述，蔓越莓制品具有良好的抗炎抑菌活性，且原花青素可能在其中起到了關(guān)鍵性作用，但具體機制仍需更深入的研究。