武安琪，衣春敏，趙學(xué)旭，馬培軒，武蕊，單良

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）（2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122）

糖尿?。―iabetes mellitus，DM）是一種由胰島素代謝障礙或分泌不足引起的以血糖濃度偏高為特征的代謝性疾病[1]，作為威脅人類健康的三大慢性疾病之一，糖尿病的患病人群已超過2億，而我國是全球糖尿病患者人數(shù)最多的國家，因此，預(yù)防及治療糖尿病已刻不容緩[2,3]。市面上現(xiàn)已存在阿卡波糖等降血糖藥物，雖然治療效果較好，但其存在著價格昂貴和有惡心嘔吐的不良反應(yīng)[4]。因此，許多具有生物親和性的天然活性物質(zhì)被用于治療糖尿病，其中酶解制備生物活性肽是當前研究的熱點。張燦等[5]利用木瓜蛋白酶對銀杏蛋白進行酶解制備α-葡萄糖苷酶抑制肽，測得其抑制率為17.18%；鄧艷群[6]采用復(fù)合酶酶解牡蠣，并進一步利用葡聚糖凝膠層析法對牡蠣肽進行分離純化，測得其IC50值為20.62 mg/mL；李艷敏[7]利用堿性蛋白酶酶解裙帶菜，在最佳工藝條件下制備的酶解肽IC50值為46.079 mg/mL。王晟等[8]利用木瓜蛋白酶對苦杏仁粗蛋白進行酶解制備α-葡萄糖苷酶抑制肽，該試驗證明苦杏仁蛋白經(jīng)酶解之后得到的肽具有降血糖活性，但抑制效果較低，IC50值僅為80 mg/mL。

有研究表明，疏水性氨基酸在許多具有降血糖功能活性的多肽中發(fā)揮較為顯著的作用。袁曉晴[9]對癩葡萄蛋白及其酶解產(chǎn)物癩葡萄降血糖肽進行氨基酸檢測，發(fā)現(xiàn)二者氨基酸組成差別不大，且都含有高比例的疏水性氨基酸。包美麗[10]通過對馬鹿茸降血糖肽進行氨基酸序列分析得出，降血糖肽與氨基酸的疏水性可能有一定的關(guān)系。趙紅星[11]對制備的大豆多肽進行了氨基酸分析，結(jié)果顯示該多肽的疏水性氨基酸含量占比較高為27.57%，從而推斷疏水性氨基酸對于多肽α-葡萄糖苷酶抑制活性有重要作用。因此，選用疏水性氨基酸含量高的原料制備降血糖肽具有重要意義?？嘈尤实鞍字惺杷园被幔ū彼帷惲涟彼?、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸等）含量為9.374%[12-17]，其主要存在于苦杏仁醇溶蛋白中[18,19]，這些氨基酸的存在可能使得苦杏仁醇溶蛋白成為制備降血糖肽的良好原料。由此可見，提取苦杏仁醇溶蛋白進行酶解制備降血糖肽有望提高其降血糖活性。

因此，本研究以苦杏仁醇溶蛋白為原料、α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度為評價指標，篩選適宜的蛋白酶，采用響應(yīng)面法進行工藝優(yōu)化，制備具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的苦杏仁醇溶蛋白水解物，然后研究溫度、pH和模擬胃腸道消化對制得α-葡萄糖苷酶抑制酶解物（AGIH）活性的影響，為開發(fā)和利用苦杏仁蛋白的降血糖肽提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

苦杏仁，購自蔚縣豐潤農(nóng)產(chǎn)品加工有限公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）、風(fēng)味蛋白酶（20 U/mg）、復(fù)合蛋白酶（120 U/mg）、菠蘿蛋白酶（300 U/mg）、胃蛋白酶（1:15000）、胰蛋白酶（2.5 U/mg）、α-葡萄糖苷酶（25.4 U/mg）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG），均購自上海源葉生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

DZKW-S-4恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；TD5.5低速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；TGL-16高速冷凍離心機，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；THYS-15數(shù)控恒溫槽，寧波天恒儀器廠；ST3100 pH計、e-G51HSRDM加熱磁力攪拌器，奧克斯儀器（常州）有限公司；LCJ-10D冷凍干燥機，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；UV-1200紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；Multiskan GO全波長酶標儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦杏仁醇溶蛋白的制備

（1）脫脂脫苷苦杏仁粉的制備[20]。

（2）苦杏仁粗蛋白的制備，具體參考堿溶酸沉法[21]。

（3）醇溶蛋白的制備，具體參考Osborne方法[22]。

1.2.2α-葡萄糖苷酶活性抑制酶解物的制備工藝優(yōu)化

1.2.2.1 蛋白酶的篩選

稱取適量苦杏仁醇溶蛋白，配制成4.0%（m/V）的蛋白溶液。95 ℃加熱10 min，后調(diào)節(jié)溶液的pH值和溫度至所添加酶的最適酶解條件，加入一定量的酶，使酶/底物比值（E/S）為6000 U/g。整個酶解過程需維持恒定最適條件。最后將溶液pH值回調(diào)至7.0，沸水浴滅酶后高速離心（8000×g，15 min）取上清液（酶解產(chǎn)物），并以α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度為評價指標，篩選最佳蛋白酶。每種蛋白酶的用量（加酶量以底物蛋白含量計）和反應(yīng)的最適作用條件見表1。

表1 不同蛋白酶的最適作用條件Table 1 Optimal enzymatic reaction conditions for various proteases

1.2.2.2 苦杏仁蛋白酶解單因素試驗

選取上述最佳蛋白酶進行酶解，并選定溫度、pH值、底物濃度、加酶量、酶解時間為單因素，以α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度為評價指標，篩選最佳酶解條件。

1.2.2.3 苦杏仁蛋白酶解工藝優(yōu)化

根據(jù)上述實驗結(jié)果，選定酶解反應(yīng)時間為6 h，并選取其余單因素變量進行Box-Behnken響應(yīng)面實驗設(shè)計，具體實驗設(shè)計如表2所示，響應(yīng)值為苦杏仁醇溶蛋白酶解產(chǎn)物的α-葡萄糖苷酶抑制率，分析各試驗因素及交互作用對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響，對酶解工藝進行優(yōu)化。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平表Table 2 Factors and levels in Box-Behnken experimental design

1.2.3 測定方法

（1）水解度的測定

采用pH-stat法進行水解度的測定[23]。

（2）α-葡萄糖苷酶活性抑制率的測定

參照Boath等[24]和Raju等[25]的測定方法，略加修改。用0.2 mol/L，pH 6.8的磷酸鹽緩沖液將α-葡萄糖苷酶和D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）分別配制成0.2 U/mL和1 mg/mL的溶液。移取50 μL磷酸鹽緩沖液，50 μL pNPG溶液及50 μL酶解物溶液于96孔酶標板中，在37 ℃下孵育10 min，充分混合，然后再加入100 μLα-葡萄糖苷酶溶液啟動反應(yīng)，相同溫度下繼續(xù)孵育30 min，完成后終止此次酶解，所用到的溶液為150 μL 0.2 mol/L Na2CO3溶液。空白組用去離子水代替樣品溶液，在405 nm波長下測定吸光值并記錄。測定反應(yīng)體系如表3所示。抑制率計算公式為：

表3 α-葡萄糖苷酶抑制率檢測反應(yīng)體系的組成Table 3 The composition of α-glycosidase inhibition testing system

式中：

A空白——空白組對應(yīng)的吸光度值；

A樣品——樣品組對應(yīng)的吸光度值。

（3）α-葡萄糖苷酶抑制酶解物的熱穩(wěn)定性表征

將AGIH配制成一定濃度的溶液，調(diào)節(jié)酶解物溶液的pH至7.0后進行加熱保溫30 min，加熱溫度分別是37、50、70、90、110、121 ℃，測定所采集反應(yīng)液的α-葡萄糖苷酶抑制率，計算AGIH活性的保留率。

（4）α-葡萄糖苷酶抑制酶解物的酸堿穩(wěn)定性表征

將AGIH溶液調(diào)節(jié)至不同的pH值（1.0、3.0、5.0、7.0、9.0和11.0），然后在室溫下反應(yīng)30 min，測定所采集反應(yīng)液的α-葡萄糖苷酶抑制率，計算AGIH活性的保留率。

（5）α-葡萄糖苷酶抑制酶解物的體外消化穩(wěn)定性表征

參考Wu等[26]的方法，根據(jù)試驗情況略加調(diào)整。先將AGIH溶液的pH值調(diào)至2.0，溫度調(diào)到37 ℃，添加一定量胃蛋白酶進行酶解反應(yīng)，2 h后，胃模擬消化結(jié)束；隨后將反應(yīng)體系的pH調(diào)至7.0，添加一定量胰蛋白酶進行酶解反應(yīng)，4 h后，腸道模擬消化結(jié)束，在95 ℃下進行滅酶，時間10 min，整個反應(yīng)過程中每30 min采集一次反應(yīng)液樣品，測定所采集反應(yīng)液的α-葡萄糖苷酶抑制率，計算AGIH活性的保留率。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics Base 20、Origin Pro 2019b、Design Expert 8.0.5進行分析處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶的篩選

由于不同蛋白酶的酶切作用方式及酶切位點不同，苦杏仁蛋白酶解產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶抑制率強弱也有很大的差異，短肽容易以完整的形式被吸收進入人體代謝循環(huán)中，從而其生物活性較容易保持[27]。蛋白的酶解效果與生成產(chǎn)物中肽鏈的長短直接相關(guān)[23]，因而，要制備大量的小分子肽，就必須達到一定的酶解程度。此次篩選所用到的指標為α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度，結(jié)果見圖1。

本研究選取的6種蛋白酶均具有制備抑制α-葡萄糖苷酶活性酶解物的功效，其中木瓜蛋白酶催化水解產(chǎn)物的α-葡萄糖苷酶抑制率顯著高于其它五種酶，抑制率為18.82%，其次是堿性蛋白酶催化水解產(chǎn)物，抑制率為13.42%；堿性蛋白酶的水解度顯著高于其它五種酶為39.78%，木瓜蛋白酶位居第二，水解度為26.45%。因而，綜合功能活性和水解效果，本研究選取木瓜蛋白酶作為最佳用酶。

2.2 單因素實驗

2.2.1 pH對酶解產(chǎn)物抑制活性的影響

pH值在5.0～9.0范圍內(nèi)時，酶解產(chǎn)物的α-葡萄糖苷酶抑制率總體表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。其中，在酸性條件下（pH 5.0～7.0），酶解產(chǎn)物的整體抑制效果隨酸性的減弱而逐步增強，在中性條件下，抑制率達到最大值，而當pH值在7.0～9.0范圍內(nèi)時，抑制率顯著降低（圖2）。這種現(xiàn)象的原因可能是酸或堿環(huán)境會影響酶的活性和底物的構(gòu)象[28]，從而導(dǎo)致抑制率低。因而，pH 7.0為木瓜蛋白酶最佳酶解pH。

2.2.2 酶解溫度對酶解產(chǎn)物抑制活性的影響

當溫度在40～55 ℃之間時，酶解產(chǎn)物的α-葡萄糖苷酶抑制率與溫度的升高呈正相關(guān)，并在55 ℃時達到最大值，繼續(xù)升高溫度則抑制率呈現(xiàn)下降趨勢（圖3）?？赡苁怯捎跍囟冗^高，酶分子吸收了過多的能量，使得維持酶分子結(jié)構(gòu)的肽鍵斷裂，導(dǎo)致酶的構(gòu)型發(fā)生改變，進一步導(dǎo)致酶變性失活，從而影響了酶解速率[29]。因此，55 ℃為最適酶解溫度。

2.2.3 酶解時間對酶解產(chǎn)物抑制活性的影響

整個反應(yīng)階段，酶解產(chǎn)物的α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈現(xiàn)先逐漸升高，6 h時達到頂點值，隨后降低的趨勢，（圖4）。在0～6 h時，蛋白酶不斷切割目標肽鍵，隱藏于蛋白序列內(nèi)部的活性肽段被逐步釋放[30]，因而，酶解產(chǎn)物所具備的抑制α-葡萄糖苷酶活性呈現(xiàn)逐步上升趨勢。而在酶解6 h后，酶解產(chǎn)物的抑制效果顯著性降低，原因可能是，酶解時間過長，原本具有功能活性的肽段受到了蛋白酶的進一步切割，從而破壞了肽序列的結(jié)構(gòu)，進而導(dǎo)致了酶解產(chǎn)物的抑制活性大大降低。因此，6 h為最佳木瓜蛋白酶最佳酶解時間。

2.2.4 底物濃度對酶解產(chǎn)物抑制活性的影響

底物濃度在4.0%時，產(chǎn)物的抑制活性達到最高點，當?shù)孜餄舛却笥?.0%后，抑制率反而呈下降趨勢（圖5）?？赡艿脑蚴?，在整個酶解體系中，木瓜蛋白酶添加量固定，當?shù)孜餄舛冗^高時，酶的含量不足以與底物充分接觸，進而無法發(fā)揮較高的酶切作用[28]，甚至可能出現(xiàn)酶活性鈍化的現(xiàn)象。因而，4.0%為最佳底物添加濃度。

2.2.5 加酶量對酶解產(chǎn)物抑制活性的影響

加酶量為6000 U/g時，酶解產(chǎn)物的抑制活性達到最高點，高于6000 U/g時，抑制活性反而下降（圖6）。這可能是因為加酶量在過高時，生成的α-葡萄糖苷酶抑制酶解物被酶過度切割，從而導(dǎo)致酶解物的抑制活性降低。因此，選擇最佳加酶量為6000 U/g。

2.3 酶解工藝條件優(yōu)化

2.3.1 Box-Behnken試驗結(jié)果

結(jié)合制備AGIH所篩選的試驗結(jié)果，響應(yīng)值為α-葡萄糖苷酶抑制率，對pH值、溫度、加酶量和底物濃度進行考察，通過Box-Behnken試驗進一步優(yōu)化酶解條件，使其具備較高的制備效率和工業(yè)應(yīng)用價值。具體試驗方案及結(jié)果如表4所示。

2.3.2 Box-Behnken試驗結(jié)果方差分析

利用Design expert軟件對表4數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到響應(yīng)值Y對α-葡萄糖苷酶抑制率為響應(yīng)關(guān)鍵因素的二次多項回歸模型為：Y=17.85+0.30A-0.39 B+0.96C-0.39D-0.025AB+0.071AC+0.24AD-0.075BC-0.057BD-0.050CD-1.96A2-2.64B2-1.10C2-1.44D2

表4 Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 The design and results of the Box-Behnken experiment

回歸模型方差分析結(jié)果如表5所示。該回歸方程的決定系數(shù)為0.9481，表明采用該回歸模型能夠反映整個酶解過程中94.81%的變化，因而該回歸模型具有較高的準確度。且p＜0.0001，表明該模型是極顯著的。一次項中，C影響極顯著，B、D影響顯著，二次項中，A2、B2、C2、D2影響極顯著，而交互項的影響相對較小。各因素對酶解所得AGIH的活性影響的大小各不相同，具體表現(xiàn)為：XC＞XD＞XB＞XA，即加酶量＞底物濃度＞溫度＞pH。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Significance test of the regression model

2.3.3 響應(yīng)面分析及最佳酶解工藝條件的確定

酶解產(chǎn)物的α-葡萄糖苷酶活性抑制率對pH（A）、溫度（B）、加酶量（C）、底物濃度（D）的響應(yīng)見圖7～圖12。

利用Design Expert 8.0.5軟件對工藝條件進行優(yōu)化，得到的苦杏仁AGIH的最佳酶解條件為：底物濃度3.73%，加酶量6447.15 U/g，pH 7.08，溫度54.61 ℃；在此條件下，產(chǎn)物抑制活性的預(yù)測值為18.12%。實際操作過程中酶解設(shè)備往往不具備極高的分辨度，因而將上述最佳工藝條件修正為：底物濃度4.0%，加酶量6000 U/g，pH 7.0，溫度55 ℃。通過多次平行實驗對其結(jié)果進行驗證，得出酶解產(chǎn)物的α-葡萄糖苷酶活性抑制率為18.10%，與模擬預(yù)測值十分接近。將此條件下得到的酶解液凍干復(fù)配后，測得其IC50值為17.66 mg/mL。王晟等[8]利用木瓜蛋白酶酶解山杏仁蛋白同樣制得了α-葡萄糖苷酶抑制酶解物，其抑制率和IC50值分別為14.22%、80 mg/mL，與本研究相比，抑制率低3.90%、IC50值高62.34 mg/mL，可見，本研究制備的AGIH具有更高的抑制活性。

2.4 α-葡萄糖苷酶抑制酶解物的穩(wěn)定性分析

2.4.1 熱穩(wěn)定性

當將酶解液置于37 ℃環(huán)境時，AGIH的抑制活性的保留率為97.89%，當環(huán)境溫度為50、70、90、121 ℃時，AGIH活性有所降低，且溫度越高，抑制率越低，最低的為121 ℃，但此時AGIH的抑制活性的保留率為90.17%（圖13），表明AGIH有較好的熱穩(wěn)定性。

2.4.2 pH穩(wěn)定性

當酶解液的pH值為7.0時，AGIH的抑制率幾乎保持不變，抑制活性高保留率為98.80%（圖14）。而在pH 1.0和pH 11.0時，AGIH的抑制效果最低，保留率分別為81.45%和83.02%?？梢?，強酸和強堿條件會在一定程度上破壞酶解物的功能活性，甚至使酶解物結(jié)構(gòu)發(fā)生降解[31]。而AGIH的活性在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)較為穩(wěn)定，表明AGIH具有較好的pH穩(wěn)定性。

2.4.3 體外模擬胃腸道消化穩(wěn)定性

在模擬消化過程中，AGIH對α-葡萄糖苷酶的抑制效果會發(fā)生一定程度的改變。在模擬胃階段時，AGIH的抑制活性保留率為75.29%，而在模擬腸道階段時，AGIH的抑制活性保留率有所上升，為原來的82.24%（圖15）。這說明酶解物在這兩種酶的作用下一定程度上被降解[32,33]，在胃消化后，可能產(chǎn)生了一些新的活性酶解物，這些酶解物具有較高的α-葡萄糖苷酶活性，因此在進入腸道消化后，抑制率有所上升。因此，可以認為AGIH可以抗胃腸道消化。

3 結(jié)論

基于苦杏仁醇溶蛋白制備α-葡萄糖苷酶抑制酶解物的最佳工藝條件為：底物濃度4.0%（m/V），加酶量6000 U/g，酶解溫度55 ℃，酶解pH 7.0，酶解時間6 h。此時得到的AGIH的抑制率為18.10%，IC50值為17.66 mg/mL。AGIH在極端高溫、低pH、高pH或胃腸道模擬消化條件下，其抑制活性保留率較高，具有較好的穩(wěn)定性。本研究制備的苦杏仁酶解物因其α-葡萄糖苷酶活性抑制作用，通過后續(xù)分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、功效學(xué)評價，可望在天然降血糖保健食品或者藥物開發(fā)方面得到應(yīng)用。