侯敏娜，侯少平，王澤坤，賴普輝

(陜西國際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

紅薯(IpomoeabatatasLam.)又稱甘薯、番薯、紅苕、地瓜等，屬于旋花科番薯屬草本植物，在我國各地都有種植[1-2]。研究表明，紅薯葉中含有黃酮類、多酚類及類胡蘿卜素等多種成分，具有降低膽固醇、防止血管脂質(zhì)沉積、防止動脈硬化、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、促進新陳代謝等藥理作用，是一種優(yōu)質(zhì)的天然食品[3-6]。我國是世界上紅薯種植面積最大的國家，紅薯葉資源十分豐富，除少量紅薯葉作為蔬菜食用外，大多被丟棄或用作家畜飼料，造成巨大的資源浪費。因此，加強對紅薯葉資源的開發(fā)利用，具有重要的經(jīng)濟效益和社會效益。作者采用超聲輔助法提取紅薯葉多酚，以紅薯葉多酚提取率為評價指標(biāo)，以提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間為考察因素，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法[7-8]優(yōu)化紅薯葉多酚的超聲輔助提取工藝，并通過測定紅薯葉多酚對DPPH自由基、ABTS 自由基的清除能力，評價其抗氧化活性。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

紅薯葉，2020年9月采摘于陜西省咸陽市乾縣，品種為濟薯25號，經(jīng)陜西國際商貿(mào)學(xué)院中藥學(xué)教研室雷國蓮教授鑒定為旋花科番薯屬植物紅薯(IpomoeabatatasLam.)的干燥葉。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號110831-201906)，中國食品藥品檢定研究院；DPPH(批號S18M11M109858)、ABTS(批號C10947528)，上海麥克林生物科技有限公司；福林酚，上海荔達(dá)生物科技有限公司；乙醇，成都科隆化學(xué)有限公司；無水碳酸鈉，天津天力化學(xué)試劑有限公司；實驗所用試劑均為分析純。

TU-1810 型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CP225D型電子分析天平，賽多利斯；KQ5200DE型數(shù)控超聲波提取儀，昆山超聲儀器有限公司；FW100型高速萬能粉碎機，北京科偉永興儀器有限公司；HG-9075L型立式鼓風(fēng)干燥箱，北京亞太科隆技術(shù)有限公司。

1.2 紅薯葉多酚的提取

將曬干的紅薯葉除去莖和葉柄后于粉碎機中粉碎，置于干燥陰涼處保存[7]。稱取紅薯葉粉末1.0 g，置于100 mL錐形瓶中，按一定料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，超聲一定時間，過濾，收集濾液，即為紅薯葉多酚提取液。

1.3 紅薯葉多酚提取率的測定

1.3.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[8-11]

準(zhǔn)確稱取5 mg干燥的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用純化水制成濃度為0.1 mg·mL-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于10 mL容量瓶中，加入1 mL福林酚溶液和2 mL碳酸鈉溶液，用純化水定容至刻度，避光反應(yīng)1 h，以純化水為空白，測定765 nm處吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，擬合得線性回歸方程為：y=0.836x+0.0624，R2=0.9967。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2 多酚提取率的測定

移取1 mL紅薯葉多酚提取液，置于10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，按1.3.1測定吸光度，按式(1)計算多酚提取率：

(1)

式中：c為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得到的多酚濃度，mg·mL-1；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為紅薯葉粉末質(zhì)量，g。

1.4 提取工藝優(yōu)化

采用單因素實驗，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g∶mL,下同)、提取溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)、提取時間(30 min、35 min、40 min、45 min、50 min)對紅薯葉多酚提取率的影響。

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以紅薯葉多酚提取率為評價指標(biāo)，以提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間為自變量，利用 Design-Expert 8.0.6軟件進行4因素3水平響應(yīng)面實驗設(shè)計，以進一步優(yōu)化紅薯葉多酚的超聲輔助提取工藝。

1.5 抗氧化活性評價[9-12]

1.5.1 紅薯葉多酚對DPPH自由基清除率的測定

分別配制濃度為4 mg·mL-1、8 mg·mL-1、12 mg·mL-1、16 mg·mL-1、20 mg·mL-1的紅薯葉多酚溶液和VC對照溶液。準(zhǔn)確移取各濃度待測溶液2 mL，加入DPPH自由基溶液2 mL，搖勻，暗處反應(yīng)1 h，測定517 nm處吸光度，按式(2)計算DPPH自由基清除率：

(2)

式中：A0為2 mL DPPH自由基溶液+2 mL 72%乙醇的吸光度；A1為2 mL DPPH自由基溶液+2 mL待測溶液的吸光度；A2為2 mL 72%乙醇+2 mL待測溶液的吸光度。

1.5.2 紅薯葉多酚對ABTS自由基清除率的測定

參照文獻[10,12]方法測定734 nm處吸光度，按式(3)計算ABTS自由基清除率：

(3)

式中：A0為2 mL ABTS自由基溶液+2 mL 72%乙醇的吸光度；A1為2 mL ABTS自由基溶液+2 mL待測溶液的吸光度；A2為2 mL 72%乙醇+2 mL待測溶液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

在料液比為1∶25、提取時間為30 min、提取溫度為60 ℃的條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對紅薯葉多酚提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對紅薯葉多酚提取率的影響

由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，紅薯葉多酚提取率先升高后降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，多酚提取率達(dá)到最高。這是因為，乙醇體積分?jǐn)?shù)過小時，溶劑極性較大，而多酚不易溶于強極性溶劑，導(dǎo)致多酚提取率較低；乙醇體積分?jǐn)?shù)過大時，溶劑極性變小，多酚也不易溶于弱極性溶劑，且會引入較多弱極性雜質(zhì)，導(dǎo)致多酚提取率下降。故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)70%作為響應(yīng)面實驗的中心點。

2.1.2 料液比的選擇

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、提取時間為30 min、提取溫度為60 ℃的條件下，考察料液比對紅薯葉多酚提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對紅薯葉多酚提取率的影響

由圖3可知，隨著料液比的減小，即溶劑用量的增加，紅薯葉多酚提取率先逐漸升高而后降低，當(dāng)料液比為1∶25時，多酚提取率達(dá)到最高。這是因為，當(dāng)料液比為1∶25時， 大部分目標(biāo)成分已從紅薯葉中溶出，達(dá)到動態(tài)平衡即飽和狀態(tài)，再增加溶劑用量，反而會引入更多的雜質(zhì)，使得后續(xù)過濾、純化工序不但難度加大，還會將目標(biāo)成分包裹在內(nèi)而除掉， 導(dǎo)致多酚提取率降低。故選擇料液比1∶25作為響應(yīng)面實驗的中心點。

2.1.3 提取溫度的選擇

在料液比為1∶25、乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、提取時間為30 min的條件下，考察提取溫度對紅薯葉多酚提取率的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，紅薯葉多酚提取率先升高后降低，當(dāng)提取溫度為60 ℃時，多酚提取率達(dá)到最高?？赡苁怯捎?，提取溫度過低時提取程度不夠；但是提取溫度過高時，會導(dǎo)致紅薯葉多酚分解，多酚提取率降低。故選擇提取溫度60 ℃作為響應(yīng)面實驗的中心點。

圖4 提取溫度對紅薯葉多酚提取率的影響

2.1.4 提取時間的選擇

在料液比為1∶25、乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、提取溫度為60 ℃的條件下，考察提取時間對紅薯葉多酚提取率的影響，結(jié)果見圖 5。

圖5 提取時間對紅薯葉多酚提取率的影響

由圖 5可知，隨著提取時間的延長，紅薯葉多酚提取率先緩慢升高而后急劇降低，當(dāng)提取時間為35 min時，多酚提取率達(dá)到最高。故選擇提取時間35 min作為響應(yīng)面實驗的中心點。

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果(表1)

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.2 回歸模型的建立與方差分析

采用 Design-Expert 8.0.6 軟件對實驗結(jié)果進行分析，得到多元回歸方程：Y=0.90-(5.500E-003)A+0.012B-0.018C-(8.750E-003)D+0.025AB-(5.500E-003)AC+(4.250E-003)AD+0.014BC-0.021BD+0.034CD-0.012A2-0.028B2-0.018C2-0.055D2。

回歸模型的方差分析見表 2。

表2 方差分析

其中，一次項A、B、C、D對紅薯葉多酚提取率的影響顯著；交互項AB、BC、BD、CD，二次項A2、B2、C2、D2對紅薯葉多酚提取率的影響極顯著。從F值可知， 4個因素對紅薯葉多酚提取率的影響大小依次為：C(料液比)>B(乙醇體積分?jǐn)?shù))>D(提取時間)>A(提取溫度)。

2.2.3 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對紅薯葉多酚提取率影響的響應(yīng)面圖如圖6所示。

由圖 6可知：乙醇體積分?jǐn)?shù)的曲線平緩(圖6a)，變化幅度不大，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取率的影響較弱，當(dāng)升高提取溫度時，多酚提取率降低，影響較為明顯；提取溫度與料液比的曲線比較平緩(圖6b)，沒有明顯的升高或者降低，并且三維圖接近于圓形，故對多酚提取率的影響不顯著；提取時間的坡面較陡(圖6c)，說明提取時間對多酚提取率的影響大于提取溫度，與方差分析結(jié)果一致；乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時間均對多酚提取率的影響很大(圖6e)，這與方差分析中BD交互高度顯著性相吻合；隨著料液比的減小及提取時間的延長，多酚提取率均呈下降趨勢，且幅度很大，提取時間的曲線不平滑(圖6f)，說明對多酚提取率的影響顯著。

綜上，紅薯葉多酚提取工藝各參數(shù)的適宜范圍為：提取溫度 58～62 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù) 70%～74%、料液比1∶(20～22)、提取時間 30～35 min。經(jīng)軟件分析得到紅薯葉多酚的最佳提取工藝為：提取溫度60.97 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)71.98%、料液比1∶21.17、提取時間33.25 min，在此條件下，紅薯葉多酚提取率可達(dá)0.91006%。

2.3 工藝驗證

考慮實際操作性，將紅薯葉多酚的提取工藝調(diào)整為：提取溫度61 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)72%、料液比1∶21(g∶mL)、提取時間33 min。在此條件下進行3次平行驗證實驗，紅薯葉多酚提取率分別為：0.9081%、0.9072%、0.9048%，平均值為0.9066%，與理論值0.91006%很接近。說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取工藝可行。

2.4 抗氧化活性

紅薯葉多酚對DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力見圖7。

圖7 紅薯葉多酚對 DPPH 自由基(a)、ABTS自由基(b)的清除能力

由圖 7可知，隨著紅薯葉多酚和VC濃度的增大，兩者對 DPPH自由基、ABTS自由基的清除率均呈上升趨勢，且VC的清除率始終大于紅薯葉多酚的。當(dāng)紅薯葉多酚和VC的濃度為 20 mg·mL-1時，兩者對DPPH自由基的清除率分別為78%、93%，對ABTS自由基的清除率分別為69%、82%。說明紅薯葉多酚對DPPH自由基和ABTS自由基有較強的清除能力，但均弱于VC。

3 結(jié)論

以紅薯葉多酚提取率為評價指標(biāo)，以提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間為考察因素，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化紅薯葉多酚的超聲輔助提取工藝，并通過測定紅薯葉多酚對DPPH 自由基及ABTS自由基的清除能力，評價其抗氧化活性。確定紅薯葉多酚的最佳提取工藝為：提取溫度61 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)72%、料液比1∶21(g∶mL)、提取時間33 min，在此條件下，紅薯葉多酚提取率為0.9066%，與理論值0.91006%接近。紅薯葉多酚具有一定的抗氧化活性，但在實驗濃度范圍內(nèi)，其對DPPH自由基及ABTS自由基的清除率均低于VC。本研究為紅薯葉資源的進一步開發(fā)利用提供了依據(jù)。