劉 祺，馮菊紅*，張朵朵，陳雅婷，汪 濤，盛余豪，胡學(xué)雷

(1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074)

達(dá)沙替尼(Dasatinib)是美國(guó)百時(shí)美施貴寶公司研制的一款酪氨酸激酶抑制劑(TKI)[1]，商品名為施達(dá)賽(SPRYCEL)，劑型為片劑，于2006年通過(guò)了美國(guó)FDA的優(yōu)先審批，在中國(guó)等國(guó)陸續(xù)上市。在國(guó)內(nèi)由正大天晴公司仿制，商品名為依尼舒[2]。達(dá)沙替尼用于治療慢性髓細(xì)胞白血病(CML)，體外試驗(yàn)表明，與第一代TKI伊馬替尼相比，達(dá)沙替尼的作用效果約是其300倍，更重要的是達(dá)沙替尼可以與更多突變激酶點(diǎn)結(jié)合，因此對(duì)于伊馬替尼耐藥的患者，通常選擇達(dá)沙替尼進(jìn)行治療[3]。

與其它替尼類藥物一樣，達(dá)沙替尼的水溶性較差，原料藥在中性環(huán)境中的累積溶出度很低[4-5]，因此改善達(dá)沙替尼的溶解性對(duì)于提高人體對(duì)其的吸收效率具有重要意義。常見(jiàn)的改善溶解性的方法有微晶化、固體分散技術(shù)、包合技術(shù)和成鹽[6-9]等，其中固體分散技術(shù)操作簡(jiǎn)單、對(duì)設(shè)備要求不高且效果較好。因此，作者采用溶劑法制備達(dá)沙替尼固體分散體(SD)，通過(guò)考察載體種類、藥載比(達(dá)沙替尼與載體的質(zhì)量比)、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)累積體外溶出度的影響優(yōu)化制備工藝，并通過(guò)傅立葉變換紅外光譜儀(FTIR)、X-射線衍射儀(XRD)、掃描電鏡(SEM)對(duì)達(dá)沙替尼固體分散體進(jìn)行表征。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

達(dá)沙替尼，樂(lè)研試劑(上海)有限公司；羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)、羥丙基-γ-環(huán)糊精(HP-γ-CD)，武漢格奧化學(xué)有限公司；無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸、乙酸乙酯、異丙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

RCZ-6B1型溶出儀，上海黃海藥檢儀器公司；UV2600i型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；Nicolet Nexus 470型傅立葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Nicolet公司；Ultima Ⅳ型X-射線衍射儀，日本理學(xué)株式會(huì)社；TESCAN MIRA4型掃描電鏡，泰思肯貿(mào)易(上海)有限公司。

1.2 達(dá)沙替尼固體分散體及物理混合物的制備

固體分散體的制備[10]：稱取適量達(dá)沙替尼與載體(HP-β-CD、HP-γ-CD)；將載體溶于20 mL無(wú)水甲醇中，按一定藥載比加入達(dá)沙替尼，加熱至設(shè)定溫度后持續(xù)攪拌一段時(shí)間；反應(yīng)結(jié)束后除去甲醇并真空干燥2 h，研磨，過(guò)80目篩，即得達(dá)沙替尼固體分散體。根據(jù)載體的不同，分別標(biāo)記為SD-1(HP-β-CD為載體)、SD-2(HP-γ-CD為載體)。

物理混合物(PM)的制備：稱取適量達(dá)沙替尼，按一定藥載比與載體(HP-β-CD、HP-γ-CD)于研缽中研磨均勻，過(guò)80目篩，即得達(dá)沙替尼物理混合物。根據(jù)載體的不同，分別標(biāo)記為PM-1(HP-β-CD為載體)、PM-2(HP-γ-CD為載體)。

1.3 體外溶出實(shí)驗(yàn)

按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版第四部通則(0931)溶出度與釋放度測(cè)定方法(槳法)進(jìn)行體外溶出實(shí)驗(yàn)。稱取10 mg達(dá)沙替尼，研磨均勻后過(guò)80目篩，加入到裝有900 mL溶出介質(zhì)的溶出杯中，于(37.0±0.5) ℃、75 r·min-1下進(jìn)行體外溶出實(shí)驗(yàn)；分別于5 min、10 min、20 min、30 min、45 min、60 min時(shí)用注射器抽取3 mL溶出液，并同時(shí)補(bǔ)充同溫同體積新鮮溶出介質(zhì)；迅速使用0.45 μm水系抽濾頭過(guò)濾，測(cè)定濾液在322 nm處吸光度，依據(jù)線性回歸方程計(jì)算累積體外溶出度。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑的選擇

按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版第四部凡例溶解度測(cè)定方法，稱取100 mg達(dá)沙替尼若干份，研磨均勻后過(guò)80目篩，分別加入適量溶劑(水、無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、異丙醇、乙酸、丙酮)，于(25±2) ℃下每5 min 振搖溶液30 s，觀察其在30 min內(nèi)的溶解情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，達(dá)沙替尼不溶于水、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯，微溶于乙酸、無(wú)水甲醇、丙酮、異丙醇、二氯甲烷。綜合考慮，選擇無(wú)水甲醇作為溶劑制備達(dá)沙替尼固體分散體。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別以HP-β-CD和HP-γ-CD為載體，將達(dá)沙替尼與載體溶于pH值6.8的磷酸緩沖溶液中，于200～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。結(jié)果顯示，達(dá)沙替尼在多處有強(qiáng)吸收峰，而位于322 nm處的吸收峰不受2種載體吸收峰的干擾。因此，選擇322 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 線性回歸方程

稱取達(dá)沙替尼24 mg，溶于適量無(wú)水甲醇中，移至100 mL容量瓶中定容，得到240 μg·mL-1的達(dá)沙替尼標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確移取0.025 mL、0.150 mL、0.275 mL、0.400 mL、0.525 mL達(dá)沙替尼標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于10 mL容量瓶中，用pH值6.8的磷酸緩沖溶液定容，得到濃度分別為0.60 μg·mL-1、3.60 μg·mL-1、6.60 μg·mL-1、9.60 μg·mL-1、12.60 μg·mL-1的達(dá)沙替尼溶液，測(cè)定溶液在322 nm處的吸光度。以達(dá)沙替尼溶液濃度(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到線性回歸方程：A=0.0704c+0.0103，R2=0.9992。表明，達(dá)沙替尼在0.60～12.60 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度呈線性相關(guān)。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

精密度測(cè)試：配制10.00 μg·mL-1達(dá)沙替尼溶液，測(cè)定322 nm處吸光度。連續(xù)測(cè)定6次，吸光度幾乎無(wú)變化，RSD值為0.19%。表明儀器精密度良好，對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響可忽略。

重復(fù)性測(cè)試：取適量達(dá)沙替尼標(biāo)準(zhǔn)溶液，用溶出介質(zhì)定容，得到6.60 μg·mL-1達(dá)沙替尼溶液，取樣3份，測(cè)定322 nm處吸光度，RSD值為0.53%。表明該方法重復(fù)性較好，對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響可忽略。

回收率測(cè)試：取適量達(dá)沙替尼與載體配制成濃度分別為3.60 μg·mL-1、6.60 μg·mL-1、9.60 μg·mL-1的溶液，測(cè)定322 nm處吸光度(n=3)，計(jì)算回收率分別為98.80%、99.65%、99.45%，RSD值分別為0.43%、0.25%、0.12%。表明該方法準(zhǔn)確度較好，載體對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響可忽略。

2.5 溶出介質(zhì)的選擇

達(dá)沙替尼的吸收部位在腸道，為了模擬腸道環(huán)境，在3個(gè)溶出杯中分別加入900 mL溶出介質(zhì)(pH值6.8的磷酸緩沖溶液、pH值7.0的二次蒸餾水、pH值7.4的磷酸緩沖溶液)；稱取3份達(dá)沙替尼，每份10 mg，研磨均勻后過(guò)80目篩，分別加入到上述3個(gè)溶出杯中，按1.3方法進(jìn)行體外溶出實(shí)驗(yàn)，比較累積體外溶出度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在3種溶出介質(zhì)中，達(dá)沙替尼的累積體外溶出度幾乎沒(méi)有差異。綜合考慮，選擇pH值6.8的磷酸緩沖溶液作為溶出介質(zhì)。

2.6 達(dá)沙替尼固體分散體的制備工藝優(yōu)化

2.6.1 載體種類對(duì)累積體外溶出度的影響

藥載比為1∶7的達(dá)沙替尼固體分散體SD-1、SD-2及達(dá)沙替尼物理混合物PM-1、PM-2的累積體外溶出度如圖1所示。

圖1 載體種類對(duì)累積體外溶出度的影響

由圖1可知，達(dá)沙替尼原料藥在溶出介質(zhì)中的累積體外溶出度僅為11.66%，溶出效果很差；與載體研磨混合后，累積體外溶出度略有提高，PM-1和PM-2分別達(dá)到18.92%和16.84%；達(dá)沙替尼與不同載體制成固體分散體后，累積體外溶出度顯著提高，SD-1和SD-2分別達(dá)到59.77%和52.61%。表明，以親水性的環(huán)糊精為載體可以有效提高達(dá)沙替尼的累積體外溶出度，且HP-β-CD比HP-γ-CD更有利于提高藥物的溶解性，因此，選擇HP-β-CD作為載體。

2.6.2 藥載比對(duì)累積體外溶出度的影響

分別按藥載比1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13稱取達(dá)沙替尼和HP-β-CD并制備固體分散體，考察藥載比對(duì)累積體外溶出度的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 藥載比對(duì)累積體外溶出度的影響

由圖2可知，隨著藥載比的減小，即載體用量的增加，達(dá)沙替尼固體分散體的累積體外溶出度先逐漸升高后略有下降，在藥載比為1∶9時(shí)達(dá)到最高。因此，選擇藥載比為1∶9。

2.6.3 反應(yīng)溫度對(duì)累積體外溶出度的影響

按藥載比1∶9稱取達(dá)沙替尼和HP-β-CD，分別于40 ℃、50 ℃、60 ℃下攪拌30 min制備固體分散體，考察反應(yīng)溫度對(duì)累積體外溶出度的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)累積體外溶出度的影響

由圖3可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，達(dá)沙替尼固體分散體的累積體外溶出度逐漸升高。由于無(wú)水甲醇的沸點(diǎn)為64 ℃，當(dāng)反應(yīng)溫度高于60 ℃后會(huì)導(dǎo)致溶劑沸騰，因此，選擇反應(yīng)溫度為60 ℃。

2.6.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)累積體外溶出度的影響

按藥載比1∶9稱取達(dá)沙替尼和HP-β-CD，在60 ℃分別攪拌15 min、30 min、45 min制備固體分散體，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)累積體外溶出度的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)累積體外溶出度的影響

由圖4可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為15 min時(shí)，達(dá)沙替尼固體分散體的累積體外溶出度較低；延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至30 min時(shí)，累積體外溶出度升高；繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，累積體外溶出度幾乎沒(méi)有變化。可能是由于，反應(yīng)時(shí)間短于30 min時(shí)，達(dá)沙替尼或載體未完全溶解。因此，選擇反應(yīng)時(shí)間為30 min。

綜上，達(dá)沙替尼固體分散體的最佳制備工藝為：達(dá)沙替尼與載體HP-β-CD的質(zhì)量比1∶9、反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間30 min，在此條件下制備的達(dá)沙替尼固體分散體SD-1在溶出介質(zhì)(pH值6.8的磷酸緩沖溶液)中，60 min時(shí)累積體外溶出度可達(dá)到71.55%，遠(yuǎn)高于原料藥(11.66%)及達(dá)沙替尼與HP-β-CD的物理混合物PM-1(18.92%)，表明固體分散體顯著改善了達(dá)沙替尼的累積體外溶出度。

2.7 達(dá)沙替尼固體分散體的表征

2.7.1 FTIR分析(圖5)

由圖5可知，達(dá)沙替尼原料藥在1 700～1 000 cm-1范圍內(nèi)有較明顯的吸收峰；與HP-β-CD混合制成物理混合物PM-1后，其吸收峰強(qiáng)度明顯減弱，整體與HP-β-CD的峰型相似，表現(xiàn)為達(dá)沙替尼與HP-β-CD吸收峰的疊加；與HP-β-CD制成固體分散體SD-1后，達(dá)沙替尼本身的特征峰已經(jīng)消失，整體峰形與HP-β-CD的幾乎一致，表明制成固體分散體后達(dá)沙替尼與HP-β-CD存在新的相互作用力。

圖5 達(dá)沙替尼原料藥、HP-β-CD、PM-1及SD-1的FTIR圖譜

2.7.2 XRD分析(圖6)

圖6 達(dá)沙替尼原料藥、HP-β-CD、PM-1及SD-1的XRD圖譜

由圖6可知，達(dá)沙替尼原料藥在10°～30°范圍內(nèi)存在尖銳的衍射峰；與HP-β-CD混合制成物理混合物PM-1后，尖銳的衍射峰基本消失，峰形與HP-β-CD的相似，僅在12.28°、14.81°、21.52°、22.84°、24.78°處存在微弱的達(dá)沙替尼特征峰；與HP-β-CD制成固體分散體SD-1后，這些微弱的達(dá)沙替尼特征峰基本完全消失，整體峰形與HP-β-CD的幾乎一致，說(shuō)明制成固體分散體后，達(dá)沙替尼以無(wú)定形態(tài)完全分散于載體中。

2.7.3 SEM分析(圖7)

由圖7可知，達(dá)沙替尼原料藥呈片狀或柱狀的晶體結(jié)構(gòu)；而載體HP-β-CD呈表面有著凹陷或空缺的球狀；制成物理混合物PM-1后，達(dá)沙替尼附著在HP-β-CD的表面凹陷處且分布不均勻；制成固體分散體SD-1后，失去了達(dá)沙替尼和HP-β-CD的原有結(jié)構(gòu)，二者以無(wú)定形的方式均勻分散。

圖7 達(dá)沙替尼原料藥(a)、HP-β-CD(b)、PM-1(c)及SD-1(d)的SEM照片

3 結(jié)論

采用溶劑法制備了達(dá)沙替尼固體分散體。確定最佳制備工藝為：達(dá)沙替尼與載體HP-β-CD的質(zhì)量比1∶9、反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時(shí)間30 min，在此條件下制備的達(dá)沙替尼固體分散體的溶出效果最佳，60 min時(shí)累積體外溶出度可達(dá)到71.55%，遠(yuǎn)高于達(dá)沙替尼原料藥(11.66%)及達(dá)沙替尼與HP-β-CD的物理混合物(18.92%)。FTIR、XRD和SEM分析表明，達(dá)沙替尼原料藥在固體分散體中失去了其原有的晶體結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)定形態(tài)高度分散于載體中，且達(dá)沙替尼原料藥和載體之間不是簡(jiǎn)單的物理混合而是形成了新的相互作用力。