劉愛青，王海燕，王應(yīng)強，閆 征，李志國，許智敏

（1.北京盛美諾生物技術(shù)有限公司，北京 100062；2.安徽盛美諾生物技術(shù)有限公司，安徽 淮北 235000；3.隴東學(xué)院，農(nóng)林科技學(xué)院，甘肅 慶陽 745000）

輻射（radiation）在現(xiàn)實生活中隨處可見，對人類造成損傷的主要類型包括X、γ射線等電離輻射[1?3]。電離輻射會導(dǎo)致造血、免疫、消化、氧化還原系統(tǒng)及生殖等系統(tǒng)的損害，甚至導(dǎo)致死亡[4?5]。加強輻射防護(hù)，預(yù)防或減輕放射病己成為當(dāng)今亟待解決的重要課題[6]。日前，已使用的抗輻射藥有氨磷汀、碘化鉀等，但均存不同程度的局限性[7]，且合成抗輻射劑價格昂貴，大都會引起一定的副作用，臨床和實際應(yīng)用受到很大限制[8]。因此，天然輻射防護(hù)劑在現(xiàn)代醫(yī)藥保健行業(yè)中日益得到重視，研究者側(cè)重于從可食用的天然植物、動物中開發(fā)高效抗輻射損傷的產(chǎn)品。

研究表明，一些植物提取物和小分子生物活性肽能通過免疫調(diào)節(jié)、刺激骨髓造血機能以及提高氧化酶活力并抑制自由基產(chǎn)生，對輻射所致的造血功能、免疫器官損傷和氧化損傷提供保護(hù)作用，具有較好的防輻射損傷功能[9?13]。但很多提取物和生物活性肽因為苦澀難以入口，因此作者在眾多植物和動物來源的生物活性肽中，篩選出兩種口感最好的生物活性肽—菠蘿蜜蛋白肽和膠原蛋白肽進(jìn)行抗輻射防護(hù)作用研究。據(jù)文獻(xiàn)報道：膠原蛋白肽研究主要集中在抗氧化、抗衰老以及改善骨質(zhì)疏松方面[14?17]；菠蘿蜜營養(yǎng)成分豐富且富含多糖、酚類化合物、類胡蘿卜素等功能活性成分[18?21]。郝云濤等[22]對菠蘿蜜低聚肽進(jìn)行過部分研究。而膠原蛋白肽和菠蘿蜜蛋白肽對電離輻射輔助保護(hù)作用的全面研究較少，本文主要依據(jù)《保健食品功能評價方法（2020版）（征求意見稿）》的標(biāo)準(zhǔn)，通過60鈷γ射線照射BALB/c小鼠，照射前后采用膠原蛋白肽和菠蘿蜜蛋白肽干預(yù)BALB/c小鼠，從五個方面系統(tǒng)探究了膠原蛋白肽和菠蘿蜜蛋白肽對電離輻射損小鼠的保護(hù)作用，并對二者作用效果進(jìn)行了對比，為選擇有效易得，價格親民、口感良好的防輻射食品提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

菠蘿蜜蛋白肽 北京盛美諾生物技術(shù)有限公司提供，來源：菠蘿蜜果肉和須粉碎后酶解混合物，蛋白肽含量9.0%，淡黃色粉末，可市場化銷售的食品原料；膠原蛋白肽 北京盛美諾生物技術(shù)有限公司提供，來源：羅非魚魚鱗，100%蛋白肽（以干基計算），白色至乳白色粉末，可市場化銷售的食品、保健品原料；雌性小鼠 選用北京華阜康生物科技股份有限公司繁殖的18～22 g昆明健康SPF級雌性小鼠288只，飼養(yǎng)于北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品功能檢測中心SPF級動物室（實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2017-0038；維持飼料 由北京華阜康生物科技股份有限公司生產(chǎn)；血紅蛋白測試液測試盒、SOD測試盒、8羥基脫氧鳥苷試劑盒 南京建成生物工程研究所；CaCl2國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HClO4天津鑫源化工。

T-1000型電子天平 美國雙杰；BS223S型電子天平、BS2202S型電子天平 德國賽多利斯；UV2600型紫外可見分光光度計 日本島津；MEK-6318K型血液分析儀、MEK-640血常規(guī)稀釋液、MEK-680溶血劑 日本光電工業(yè)株式會社；HFY-1A 沽源控制臺、HFY-601 固定式多路 Xγ劑量儀60Coγ射線輻射源 北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院；Thermo全波掃描多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與建模 飼養(yǎng)一周適應(yīng)后，288只小鼠隨機分為四批（每批用于一個功能指標(biāo)的評價），每批6組，每組12只。每組設(shè)計空白對照組、模型對照組、菠蘿蜜蛋白肽低、高劑量組（0.20、0.80 g/kg BW）以及膠原蛋白肽低、高劑量組（0.53、1.6 g/kg BW）。每日一次經(jīng)口給予小鼠受試品26 d后，除空白對照組，其它各組接受60鈷γ射線全身輻射，輻射后繼續(xù)灌胃干預(yù)。分別檢測外周血白細(xì)胞數(shù)（照射劑量3.5 Gy，照射前、照射后第3 d、第14 d）、骨髓細(xì)胞DNA含量和血清8羥基脫氧鳥苷的含量（照射劑量3.5 Gy，照射后第3 d）、血清溶血素（照射劑量1 Gy，照射后第7 d），血中超氧化物歧化酶（SOD）活性（照射劑量7 Gy，照射后第7 d）。小鼠灌胃體積為10 mL/kg BW，空白對照組、模型對照組均用無菌純化水代替受試物，每日灌胃量與各受試物組相同。各組均給予維持飼料。實驗中使用無菌水配制兩種蛋白肽。菠蘿蜜蛋白肽灌胃劑量參考郝云濤等[23]相關(guān)研究數(shù)據(jù)；根據(jù)人體推薦劑量 10倍，30倍分別設(shè)計膠原蛋白肽低劑量組和高劑量組。

1.2.2 外周血白細(xì)胞計數(shù) 依據(jù)《保健食品功能評價方法（2020版）》二十三、對電離輻射危害有輔助保護(hù)功能檢驗方法進(jìn)行外周血白細(xì)胞計數(shù)實驗，照射劑量選擇3.5 Gy。于照射前、照射后第3 d、照射后第14 d分別進(jìn)行三次采末梢血20 μL，加入2.0 mL稀釋液中，混勻后，于血液分析儀上進(jìn)行白細(xì)胞計數(shù)。照射后3 d輻射模型對照組的白細(xì)胞數(shù)分別與照射前進(jìn)行自身比較，差異有顯著性，則判定輻射損傷模型成立；任一時間點、任一劑量組與輻射模型對照組比較，白細(xì)胞總數(shù)增多，差異有顯著性，則可判定該實驗結(jié)果陽性。

1.2.3 骨髓細(xì)胞DNA含量以及血清DNA損傷修復(fù)

1.2.3.1 骨髓細(xì)胞DNA含量 依據(jù)《保健食品功能評價方法（2020版）》二十三、對電離輻射危害有輔助保護(hù)功能檢驗方法進(jìn)行骨髓細(xì)胞DNA含量測定實驗，照射劑量選擇3.5 Gy，于照射后第3 d，頸椎脫臼處死動物，剝離出股骨，利用紫外分光光度計法測定DNA含量。具體方法參照李解的研究方法[24]。任一劑量組與模型對照組比較，骨髓DNA含量增多，差異有顯著性，則可判定該實驗結(jié)果陽性。

1.2.3.2 DNA損傷修復(fù) 8羥基脫氧鳥苷是目前公認(rèn)的一種評價DNA氧化損傷和氧化應(yīng)激狀態(tài)的生物標(biāo)志物，于照射后第3 d，通過眼球采血，離心后取上清液，利用ELISA法，按照試劑盒說明書對血清中8羥基脫氧鳥苷含量進(jìn)行檢測。

1.2.4 血清溶血素（半數(shù)溶血值，HC50） 依據(jù)《保健食品功能評價方法（2020版）》二十三、對電離輻射危害有輔助保護(hù)功能檢驗方法進(jìn)行血清溶血素實驗，照射劑量選擇1 Gy，于照射后第7 d，進(jìn)行血清溶血素的測定。具體方法參照劉雅萍[25]的方法以及試劑盒檢測說明書。任一劑量組與模型對照組比較，血清半數(shù)溶血值增多，差異有顯著性，則可判定該實驗結(jié)果陽性。

1.2.5 血中超氧化物歧化酶（SOD）活性 依據(jù)《保健食品功能評價方法（2020版）》二十三、對電離輻射危害有輔助保護(hù)功能檢驗方法進(jìn)行血中超氧化物歧化酶（SOD）活性實驗，照射劑量選擇7 Gy，于照射后第7 d，進(jìn)行實驗。具體方法參照劉雅萍[25]方法以及試劑盒檢測說明書。任一劑量組與模型對照組比較，血中SOD活性增強，差異有顯著性，則可判定該實驗結(jié)果陽性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示 ( X±SD)，采用SPSS11.0軟件對各實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理：空白對照組與模型對照組間采用獨立樣本t檢驗；劑量組與模型對照組間采用獨立樣本t檢驗。P<0.05表示具有顯著差異性，P<0.01表示具有極其顯著差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種蛋白肽對小鼠體重的影響

由表1可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的蛋白肽26 d后，小鼠體重在各劑量組與模型對照組間比較，均無顯著性差異（P>0.05）；模型對照組與空白對照組比較，無顯著性差異（P>0.05），即兩種蛋白肽對小鼠體重?zé)o不良影響。此期間各組動物毛發(fā)光滑，密度均勻，無脫毛現(xiàn)象，精神活躍，食欲正常，未發(fā)現(xiàn)四肢有腫脹等情況。

表1 2種蛋白肽對小鼠體重的影響Table 1 Effects of two protein peptides on body weight of mice

2.2 2種蛋白肽對照射后小鼠外周血白細(xì)胞計數(shù)的影響

由表2可見，照射前各劑量組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)與模型對照組間比較，均無顯著性差異（P>0.05）；模型對照組與空白對照組比較，無顯著性差異（P>0.05），說明各組間外周血白細(xì)胞數(shù)較為均衡。3.5 Gyγ射線全身一次性照射后第3 d，與照射前進(jìn)行自身比較，模型對照組的白細(xì)胞數(shù)降低，有顯著性差異（P<0.001），即輻射損傷模型建立成功。照射后第3 d、14 d，與空白對照組比較，模型對照組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)顯著降低（P<0.001）。照射后第3 d，與模型對照組比較，菠蘿蜜蛋白肽高劑量組能顯著升高小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)（P<0.05）；膠原蛋白肽低劑量組、高劑量組能顯著升高小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)（P<0.05）。輻射后第14 d，與模型對照組比較，菠蘿蜜蛋白肽高劑量組能顯著升高小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)（P<0.05）；膠原蛋白肽高劑量組能顯著升高小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)（P<0.05），而且菠蘿蜜蛋白肽高劑量組要優(yōu)于膠原蛋白肽高劑量組。膠原蛋白肽的低高劑量組對輻射后小鼠的外周血白細(xì)胞均有顯著提升，這與膠原蛋白肽具抗氧化[14]、增強免疫力的作用有關(guān)[26]；菠蘿蜜蛋白肽僅有高劑量組對輻射后小鼠的外周血白細(xì)胞有作用，應(yīng)和菠蘿蜜蛋白肽自身蛋白肽的含量低有關(guān)。

表2 2種蛋白肽對照射后小鼠外周血白細(xì)胞計數(shù)的影響Table 2 Effects of two protein peptides on peripheral blood white blood cells count of mice after radiation

此批實驗小鼠輻照后首天，與空白對照比較，模型對照組以及其它受試物組小組均表現(xiàn)出毛發(fā)稍有豎立，食欲一般，動作遲緩的現(xiàn)象，但并無四肢腫脹、死亡等情況；輻照后第3 d模型組和各受試物組小鼠食欲、行動及精神狀態(tài)有一定改善，但和空白對照組還有差距；輻照后第14 d各種體態(tài)接近空白對照組。

2.3 兩種蛋白肽對照射后小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量的影響以及對DNA損傷的修復(fù)

2.3.1 2種蛋白肽對照射后小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量的影響 由表3可見，輻射后第3 d，與空白對照組比較，模型對照組小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量顯著降低（P<0.001）；與模型對照組比較，菠蘿蜜蛋白肽高劑量組能顯著升高小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量（P<0.05）；而膠原蛋白肽劑量組則輕微地降低小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量。

表3 2種蛋白肽對照射小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量的影響Table 3 Effect of two protein peptides on DNA content of irradiated mice's bone marrow cells

2.3.2 2種蛋白肽對照射后小鼠DNA損傷修復(fù)的影響 由表4可見，輻射后第3 d，與空白對照組比較，模型對照組小鼠血清8羥基脫氧鳥苷的含量顯著升高（P<0.01）；與模型對照組比較，菠蘿蜜蛋白肽高劑量組和膠原蛋白肽高劑量組能顯著降低小鼠血清8羥基脫氧鳥苷的含量（P<0.01），這說明菠蘿蜜蛋白肽和膠原蛋白肽對輻照造成的DNA損傷具有一定的修復(fù)作用。

表4 2種蛋白肽對照射后小鼠DNA損傷修復(fù)的影響Table 4 Effect of two protein peptides on repair of DNA in irradiated mice

菠蘿蜜蛋白肽在短時間對骨髓細(xì)胞DNA含量有顯著作用應(yīng)與其組成成分有關(guān)系，因其是菠蘿蜜肉和須酶解后混合物，除蛋白肽外，還含有多糖、多酚、類胡蘿卜素[21]，而朱科學(xué)[27?29]、Fang等[30]、Yao等[31]研究顯示菠蘿蜜中營養(yǎng)成分多糖、多酚具有較好的抗氧化、抗炎活性；Stahl等[32]研究顯示菠蘿蜜類胡蘿卜素對預(yù)防癌癥、炎癥至關(guān)重要，所以分析菠蘿蜜蛋白肽能短時間升高照射后小鼠骨髓細(xì)胞的DNA含量，應(yīng)與這些營養(yǎng)物質(zhì)的活性作用有關(guān)。膠原蛋白肽劑量組反而有輕微降低小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量，應(yīng)與其成分單一具有一定的關(guān)系，也可能與照射后灌胃干預(yù)時間短有關(guān)系。菠蘿蜜蛋白肽和膠原蛋白肽能顯著降低小鼠血清8羥基脫氧鳥苷的含量，應(yīng)與兩個產(chǎn)品含有的小分子肽具有抗氧化、抗炎和細(xì)胞修復(fù)作用有關(guān)。

此批實驗小鼠輻照后首天，與空白對照比較，模型對照組以及其它受試物組小組均表現(xiàn)出毛發(fā)稍有豎立，食欲一般，動作遲緩的現(xiàn)象，但并無四肢腫脹、死亡等情況；輻照后第三天模型組和各受試物組小鼠食欲、行動及精神狀態(tài)有一定改善，但和空白對照組還有差距。

2.4 2種蛋白肽對照射后小鼠血清溶血素含量的影響

由表5可見，照射后第7 d，與空白對照組比較，模型對照組小鼠血清溶血素含量顯著降低（P<0.05）；與模型對照組比較，菠蘿蜜蛋白肽高劑量組能顯著升高小鼠血清溶血素含量（P<0.05）。而膠原蛋白肽低、高劑量組均能升高血清溶血素的含量，但無顯著性差異（P>0.05）其原因可能與2.3結(jié)果分析原因相同。

表5 2種蛋白肽對照射后小鼠血清溶血素含量的影響Table 5 Effect of two protein peptides on serum hemolysin content of irradiated mice

此批實驗小鼠輻照前后各劑量組和空白對照比較，食欲、精神、行動、毛發(fā)未觀察到明顯變化。

2.5 2種蛋白肽對照射后小鼠血中超氧化物歧化酶活性影響

由表6可見，照射后第7 d，與空白對照組比較，模型對照組小鼠血中超氧化物歧化酶（SOD）活性無顯著性差異（P>0.05）；各劑量組小鼠血中超氧化物歧化酶（SOD）活性與模型對照組比較，均無顯著性差異（P>0.05），表明無論γ射線照射處理，還是2種蛋白肽對小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性均無影響。菠蘿蜜蛋白肽實驗結(jié)果與郝云濤等[23]研究結(jié)果不一致的可能原因：一是菠蘿蜜蛋白肽的來源本文是菠蘿蜜肉和須，而其是菠蘿蜜肉和種子；二是和輻照的劑量不同有關(guān)系；三是照射后灌胃干預(yù)的時間不同。膠原蛋白肽實驗組無顯著影響應(yīng)與照射后灌胃干預(yù)時間短有關(guān)系。

表6 2種蛋白肽對照射后小鼠血中超氧化物歧化酶活性的影響Table 6 Effect of two protein peptides on superoxide dismutase(SOD) activity of irradiated mice’s blood

此批實驗首日照射后模型對照組和各受試物組的小鼠與空白對照組的小鼠相比較，明顯表現(xiàn)出食欲不好、精神萎靡、行動遲緩、毛發(fā)豎立，而且照射后七天稍有好轉(zhuǎn)，但和其它批實驗小鼠相比較食欲、精神、行動恢復(fù)速度都較慢，應(yīng)和照射劑量大有一定的關(guān)系。

3 結(jié)論

本研究說明菠蘿蜜蛋白肽對電離輻射損傷小鼠有輔助保護(hù)作用：與模型對照組比較，菠蘿蜜蛋白肽組和膠原蛋白肽組都可以顯著升高外周血白細(xì)胞數(shù)、小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量（P<0.05），極顯著地降低了輻照后小鼠血清中8羥基脫氧鳥苷的含量（P<0.01）；同時顯著升高血清溶血素（P<0.05）。因此，本研究為抗輻射產(chǎn)品配方開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。