張 雙，韓榮欣，王 欣，肖鳳琴，李 佳，董紅影，李光哲，嚴(yán)銘銘,2,

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117；2.吉林省中藥保健食品科技創(chuàng)新中心，吉林 長春 130117；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130117）

神農(nóng)本草經(jīng)記載的酸棗仁，為鼠李科植物酸棗（Ziziphus jujubeMill.）的干燥成熟種子，是我國臨床應(yīng)用的傳統(tǒng)中藥，主產(chǎn)于河北、陜西、遼寧、河南等地。酸棗仁性味酸、甘平微溫，具有養(yǎng)肝、寧心安神、斂汗生津的功效，主治虛煩不眠，驚悸怔祌，煩渴虛汗等癥[1]。酸棗仁中富含多種有效成分，主要為黃酮、生物堿、皂苷、揮發(fā)油、蛋白質(zhì)等，其中，蛋白質(zhì)占其干重的40%，約含有18種人體所需氨基酸。酸棗仁具有良好的食品功能特性，是理想的功能產(chǎn)品和植物蛋白來源[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁蛋白具有一定的抗氧化、抗疲勞以及增強(qiáng)免疫功能等生物活性[3]。但經(jīng)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，由于蛋白質(zhì)復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)以及較大的分子質(zhì)量，導(dǎo)致酸棗仁蛋白的部分性質(zhì)較一般（如溶解性、抗氧化性等），絕大部分不能夠被人體攝入利用，營養(yǎng)價(jià)值得不到充分地發(fā)揮[4]。相關(guān)研究表明，多肽具有大分子蛋白質(zhì)和游離氨基酸所不具備的生物學(xué)活性，且更容易被人體吸收，逐漸成為近年來食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

酶解法是國內(nèi)外生產(chǎn)多肽的主要方法，是一種酶促降解蛋白達(dá)到提取、改性目的的方法，具有反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，還可以進(jìn)一步通過分離純化得到具有多種理想功能特性和高營養(yǎng)的多肽。隨著研究的不斷深入，從不同蛋白酶解產(chǎn)物中分離得到的多肽在人體調(diào)節(jié)中起到了重要作用，具有降血壓、抗氧化、降膽固醇、降血糖、調(diào)節(jié)免疫等生理功能，可以作為潛在的食品添加劑，提高食品的營養(yǎng)價(jià)值，大大改善了食品的品質(zhì)[5]。近年來，關(guān)于蛋白水解物的研究已有許多報(bào)道，研究證明水解物都具有較好的功能特性和生物活性。有研究表明，不同的蛋白酶解產(chǎn)物可產(chǎn)生不同的理化性質(zhì)、功能特性以及生物活性，閻震等[6]用多種蛋白酶對(duì)牡丹籽蛋白進(jìn)行酶解處理，所得的不同蛋白酶解產(chǎn)物理化性質(zhì)及抗氧化活性均具有差異，其中，堿性蛋白酶解產(chǎn)物具有更高的水解度、更小的粒徑以及更強(qiáng)的體外抗氧化活性。這是由于不同種類的蛋白酶在蛋白質(zhì)鏈中有不同的活性位點(diǎn)和切割位點(diǎn)。

目前，有關(guān)酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的研究較少，而不同蛋白酶處理酸棗仁蛋白的研究尚未發(fā)現(xiàn)。趙節(jié)昌[7]關(guān)于酶解酸棗仁蛋白制備抗氧化肽的研究結(jié)果表明，酸棗仁蛋白酶解物具有良好的DPPH自由基清除活性，但對(duì)其他的功能特性和抗氧化活性尚無研究。因此，本研究以酸棗仁蛋白為原料，采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶分別對(duì)酸棗仁蛋白進(jìn)行酶解，并對(duì)不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的功能特性和體外抗氧化活性進(jìn)行研究，以期得到具有良好功能特性及抗氧化活性的蛋白酶解產(chǎn)物，為酸棗仁這種藥食同源中藥材在食品及保健食品行業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁藥材 長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；堿性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）、木瓜蛋白酶（0.5～2 U/mg） 購于上海源葉生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS） 美國 sigma公司；考馬斯亮藍(lán)R-250、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS） 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

HX-400A型高速中藥粉碎機(jī) 浙江省永康市溪岸五金藥具廠；Y50型養(yǎng)生破壁機(jī) 中山市奧英斯電器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市佳美儀器有限公司；DF-101S型集熱式磁力攪拌器金壇市醫(yī)療器械廠；SCIENTZ-50F型冷凍干燥機(jī)寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司；PowerPac Basic型蛋白電泳裝置 BIO-RAD；UV-1700型紫外分光光度計(jì)、2010A型高效液相色譜儀 日本島津（中國）有限公司；S220-K-CN型臺(tái)式pH計(jì) 梅特勒—托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；AB265-S型電子分析天平 梅特勒—托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；Centrifuge 5840 R型高速離心機(jī) 德國eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸棗仁蛋白的提取 取適量酸棗仁藥材，粉碎后過60目篩，置于5倍體積的石油醚中攪拌脫脂24 h，在3000 r/min室溫下離心10 min除去石油醚，沉淀放置在通風(fēng)櫥中干燥，過60目篩。取均一的脫脂酸棗仁粉末150 g，按料液比1:20（g/mL）加入3000 mL蒸餾水溶解，配制1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH10，在55 ℃恒溫水浴鍋中攪拌50 min，冷卻放涼后4000 r/min離心20 min，取上清液進(jìn)行酸沉，用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH4，4 ℃靜置2 h，繼續(xù)4000 r/min離心10 min，沉淀加水用養(yǎng)生破壁機(jī)復(fù)溶，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)至中性，裝袋透析48 h，期間每2 h換一次水，?80 ℃凍干得酸棗仁蛋白[8]。

1.2.2 酸棗仁蛋白的酶解 取蒸餾水100 mL，加入酸棗仁蛋白5 g，溶解制成5%的蛋白溶液，分別在各酶的最適條件下進(jìn)行酶解，具體條件見表1。將蛋白溶液置于55 ℃水浴鍋中保溫放置，用1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至酶最適pH后，分別加入不同種類的蛋白酶0.1 g（酶與底物比為2%），酶解過程中每隔20 min用1 mol/L NaOH溶液維持反應(yīng)體系的pH，酶解時(shí)間為3 h，結(jié)束后沸水滅酶10 min，冷卻至室溫，8000 r/min離心10 min，取上清液冷凍干燥，?20 ℃保存?zhèn)溆肹9]。

1.2.3 水解度的測(cè)定 總氮含量：采用GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定。氨態(tài)氮含量：采用GB 5009.235-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》中的酸度計(jì)法進(jìn)行測(cè)定[10]。稱量5.0 g試樣于50 mL燒杯中，用水分?jǐn)?shù)次洗入100 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取20.0 mL置于200 mL燒杯中，加60 mL水,開動(dòng)磁力攪拌器，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液[c（NaOH）=0.050 mol/L]滴定至酸度計(jì)指示pH為8.2，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)，可計(jì)算總酸含量。加入10.0 mL甲醛溶液，混勻。再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液繼續(xù)滴定至pH為9.2，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)。同時(shí)取80 mL水，先用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)至pH為8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至pH為9.2，做試劑空白試驗(yàn)。

1.2.4 多肽含量的測(cè)定 采用福林酚法[11]對(duì)三種蛋白酶解產(chǎn)物中的多肽含量進(jìn)行測(cè)定。配制福林酚試劑甲、試劑乙。分別取樣品溶液1.3 mL，加水稀釋并定容至100 mL，得多肽含量大約為0.14 mg/mL的供試品溶液，待測(cè)。取1 mL樣品溶液（約合20～250 μg多肽）加入5 mL試劑甲混勻，于20～25 ℃放置10 min，再加0.5 mL試劑乙（Folin-酚），立即搖勻，在20～25 ℃保溫30 min然后于500 nm處比色，以1 mL水代替樣品作空白對(duì)照。測(cè)定后，可以在標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出未知樣品的濃度。取0.2 mL樣品溶液（約含5～100 μg多肽）加入1 mL試劑甲（選用0.3～0.5 cm直徑的小試管）混勻，10 min后，加入0.1 mL試劑乙，立即混勻，30 min后比色。

1.2.5 SDS-PAGE電泳分析 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳使用12.5%分離凝膠和5%濃縮凝膠，酸棗仁蛋白或酶解物和上樣緩沖液以1:1的比例混合，混合溶液在100 ℃加熱5 min。待其冷卻至室溫后，向凝膠中加入10 μL混合溶液上樣。用Bio-Rad電泳儀進(jìn)行SDS-PAGE電泳[12]，樣品在70 V下運(yùn)行30 min，在140 V下運(yùn)行1 h。凝膠在考馬斯亮藍(lán)R250中染色，并在脫色溶液（冰醋酸:甲醇:水=20:60:120）中脫色。最后，所得凝膠在凝膠成像儀中拍照成像。

1.2.6 溶解性的測(cè)定 加蒸餾水于酶解物中配制成0.1%的溶液，分別調(diào)節(jié)溶液pH（2～10），離心15 min（5000 r/min），取上清液補(bǔ)足至1 mL，用福林酚法分別測(cè)定上清液和樣品溶液中的多肽含量。

1.2.7 持水性、持油性測(cè)定 持水性：取酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物0.5 g，置于10 mL離心管中，加入10 mL蒸餾水，混勻，放置室溫25 ℃下30 min，4000 r/min離心20 min，去除上清稱量刻度離心管的質(zhì)量。

式中：m0：樣品質(zhì)量（g），m1：樣品質(zhì)量+離心管質(zhì)量（g），m2：離心管質(zhì)量+去除上清液的樣品質(zhì)量。

持油性：在10 mL離心管中加入0.5 g酶解物，3 mL大豆色拉油，充分混勻樣品與色拉油，在室溫條件下放置30 min，4000 r/min離心20 min，棄去上層未被吸附的色拉油，稱量質(zhì)量。

式中：m0：樣品質(zhì)量（g），m1：離心管質(zhì)量+樣品質(zhì)量（g），m2：離心管質(zhì)量+吸油后的樣品質(zhì)量（g）。

1.2.8 起泡性及其泡沫穩(wěn)定性 稱50 mL 1%的樣品溶液，分別調(diào)pH（2～10），記體積V0，置于10000 r/min高速分散器中1 min，記總體積V1，30 min后記總體積V2。

1.2.9 乳化性及其穩(wěn)定性 配制9 mL 1%的蛋白及樣品溶液，分別調(diào)節(jié)pH（2、4、6、8、10、12），加入3 mL大豆色拉油，10000 r/min均質(zhì)2 min，攪打成均一的乳化液，取50 mL于試管中，加入5 mL 0.1% SDS溶液，設(shè)置500 nm測(cè)吸光值A(chǔ)1，30 min后測(cè)吸光度A2[13]。

式中：Φ：油相的體積分?jǐn)?shù)（%）；D:稀釋倍數(shù)；c：酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度（g/mL）；t：時(shí)間（min）；L：光程（1 cm）；2.303表示ln10。

1.2.10 抗氧化活性的測(cè)定

1.2.1 0.1 DPPH自由基清除率測(cè)定 加蒸餾水于一定質(zhì)量的酶解物中配制成不同質(zhì)量濃度的溶液；分別吸取1 mL樣品溶液與DPPH溶液混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，測(cè)定517 nm處吸光度；以1 mL蒸餾水代替樣品溶液作為空白對(duì)照組，以0.5 mL蒸餾水+0.5 mL 95%乙醇混合溶液代替DPPH溶液作為樣品對(duì)照組[14]，以維生素C、谷胱甘肽為陽性對(duì)照組，并按下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：S：DPPH自由基清除率（%）；A0：空白對(duì)照組吸光值；A1：樣品組吸光值；A2：樣品對(duì)照組吸光值。

1.2.1 0.2 ABTS自由基清除率測(cè)定 將5 mL濃度為7.4 mmol/L的ABTS溶液與88 μL 2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液混勻，靜置12～16 h，配制成ABTS+儲(chǔ)備液。取ABTS+儲(chǔ)備液0.4 mL，用pH7.4的PBS溶液稀釋，使734 nm處吸光度為0.7±0.02，制成ABTS+工作液[15]。分別將200 μL ABTS+工作液與10 μL不同濃度的樣品溶液混勻，室溫避光反應(yīng)6 min，測(cè)定734 nm處吸光度值。用10 μL PBS溶液代替樣品溶液作為空白對(duì)照組，以維生素C、谷胱甘肽為樣品對(duì)照組，按下式計(jì)算ABTS自由基清除率。

式中：S：ABTS自由基清除率（%）；A0：空白對(duì)照組吸光值；A1：樣品組吸光值；A2：樣品對(duì)照組吸光值。

1.2.1 0.3 超氧陰離子清除率測(cè)定 采用鄰苯三酚自氧化法[16]。將5 mL Tris-HCl緩沖溶液（0.05 mol/L，pH 8.2）和0.5 mL不同濃度樣品溶液混合，于25 ℃水浴中反應(yīng)20 min，然后加入在25 ℃下預(yù)熱0.5 mL鄰苯三酚溶液（7 mmol/L）。每隔10 s在325 nm處測(cè)定混合物的吸光度，即為實(shí)驗(yàn)組A1。以0.3 mL蒸餾水代替鄰苯三酚溶液作為樣品對(duì)照組A2，以0.1 mL蒸溜水代替樣品液作為空白對(duì)照組A0。并于420 nm處測(cè)定吸光度值，蒸餾水調(diào)0。按下式計(jì)算超氧陰離子的清除率：

式中：S：超氧陰離子清除率（%）；A0：為空白對(duì)照組吸光值；A1：樣品組吸光值；A2：樣品對(duì)照組吸光值。

1.2.1 0.4 羥基自由基清除率的測(cè)定 將1.0 mL樣品溶液與FeSO4（1.0 mL，2 mmol/L）及水楊酸乙醇溶液（1.0 mL，6 mmol/L）混合。隨后，向溶液中添加1.0 mL H2O2（6 mmol/L），37 ℃水浴反應(yīng)1 h后，在510 nm處立即測(cè)定吸光度[17]。1 mL蒸餾水代替H2O2，測(cè)定吸光度值作為樣品對(duì)照組；1 mL蒸餾水代替樣品溶液作為空白對(duì)照；以照維生素C代替樣品作為樣品陽性對(duì)照組，按下式計(jì)算羥基自由基的清除率：

式中：S：羥基自由基清除率，%；A0：空白對(duì)照組吸光值；A1：樣品組吸光值；A2：樣品對(duì)照組吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值，使用Origin 2019和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解度（DH）的測(cè)定

酶解法作為常用的蛋白質(zhì)改性方法，現(xiàn)已得到廣泛地應(yīng)用，其中，蛋白酶種類是影響酶解過程的一個(gè)重要因素，蛋白酶能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)水解成為小分子肽類和氨基酸[18]。由于蛋白酶具有底物專一性，不同種類的蛋白酶，其酶切位點(diǎn)也不相同，進(jìn)而可導(dǎo)致酶解產(chǎn)物的理化性質(zhì)及生物活性不同[19]。酸棗仁蛋白不同蛋白酶解產(chǎn)物的水解度測(cè)定結(jié)果如圖1所示，不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的水解度隨著時(shí)間的延長而增大。反應(yīng)開始的前3 h內(nèi)，不同酶解產(chǎn)物的水解度增長速率較快，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過3 h后，增長趨勢(shì)較為平緩，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用了3 h作為水解的最適時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于中性蛋白酶解產(chǎn)物（16.94%）及木瓜蛋白酶解產(chǎn)物（12.89%），堿性蛋白酶解產(chǎn)物具有更高的水解度（22.91%），可能是由于堿性蛋白酶是一種內(nèi)切蛋白酶，具有更多的催化位點(diǎn)來切斷蛋白質(zhì)中的肽鍵，使得酶解反應(yīng)更加完全[20]。

圖1 不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的水解度Fig.1 Degree of hydrolysis of enzymatic hydrolysates from different Ziziphi Spinosae semen protein

2.2 電泳結(jié)果分析

SDS-PAGE通常用于蛋白質(zhì)分子量和亞基組成分析。在還原條件下酸棗仁蛋白及其不同酶解產(chǎn)物的電泳圖如圖2所示。結(jié)果表明，酸棗仁蛋白主要由10～40 kDa（15、20、25、35、40 kDa）范圍內(nèi)的五條主要低分子量亞基組成。經(jīng)不同蛋白酶處理后，不同蛋白酶解物的條帶轉(zhuǎn)移到低分子量范圍，條帶主要分布在15 kDa以下，表明酶解后分子量較大的蛋白亞基被降解，產(chǎn)生分子量較小的片段。其中，中性蛋白酶解產(chǎn)物及木瓜蛋白酶解產(chǎn)物在22 kDa處仍具有一定的蛋白條帶，而堿性蛋白酶解產(chǎn)物中未發(fā)現(xiàn)此情況，進(jìn)一步結(jié)合水解度測(cè)定結(jié)果分析，表明堿性蛋白酶可使水解反應(yīng)更完全，產(chǎn)生更多具有小分子量的肽段。

圖2 SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of SDS-PAGE electrophoresis

2.3 不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的溶解性

3種酶解產(chǎn)物在不同pH條件下的溶解性由圖3所示，結(jié)果表明，木瓜蛋白酶解產(chǎn)物的溶解度最大，其次是堿性蛋白酶解產(chǎn)物，最后是中性蛋白酶解產(chǎn)物，這可能是由于不同酶解產(chǎn)物其氨基酸序列及所得到的肽段長度存在一定的差異而導(dǎo)致的。3種酶解物在pH2～10范圍內(nèi)的溶解性均高于酸棗仁蛋白，這可能是由于酶解后，肽鍵斷裂形成了部分更小的肽段以及部分親水性基團(tuán)，進(jìn)而導(dǎo)致其溶解性增強(qiáng)[21]。當(dāng)pH為4時(shí)，木瓜蛋白酶解物、中性蛋白酶解物、堿性蛋白酶解物的溶解度最小，達(dá)到了酸棗仁蛋白的等電點(diǎn)，分子聚合，溶解性降低[22]。隨著pH升高，不同蛋白酶解產(chǎn)物的溶解性逐漸增強(qiáng)。以上研究表明酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物具有很好的溶解性。

圖3 不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的溶解性Fig.3 Solubility of hydrolysates from different Ziziphi Spinosae semen protein

2.4 不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的持水性和持油性

3種不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的持水性和持油性如圖4所示，相比于酸棗仁蛋白，持水性明顯降低，這可能與酶解產(chǎn)物本身的溶解性有較大關(guān)系，酶解后溶解性明顯增強(qiáng)，導(dǎo)致其對(duì)水的吸附能力變差，進(jìn)而降低了持水性[23]。此外，由圖4可知，相比于酸棗仁蛋白，不同的酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物持油性均有明顯提升，由于不同種類蛋白酶的作用位點(diǎn)不同，酶解獲得的多肽片段也不相同，表現(xiàn)出的功能特性存在差異，其中，木瓜蛋白酶的持油性最大，這是由于酶解使得蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)被破壞，部分親脂基團(tuán)外露，影響了木瓜蛋白酶的構(gòu)象和催化活性，進(jìn)而影響其與底物的結(jié)合和催化，通過疏水作用增強(qiáng)蛋白質(zhì)與油脂的結(jié)合能力，進(jìn)一步增強(qiáng)了持油能力[24]。

圖4 不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的持水性及持油性Fig.4 Water and oil holding capacity of enzymatic hydrolysates from different Ziziphi Spinosae semen protein

2.5 不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的起泡性和起泡穩(wěn)定性

3種不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的起泡性和起泡穩(wěn)定性如圖5、圖6所示，不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的起泡性強(qiáng)弱為：木瓜蛋白酶解產(chǎn)物>堿性蛋白酶解產(chǎn)物>中性蛋白酶解產(chǎn)物。和酸棗仁蛋白相比，酶解產(chǎn)物的起泡性明顯提升，因?yàn)槊附猱a(chǎn)物的溶解性明顯增強(qiáng)，溶液的分散性增加，進(jìn)一步增強(qiáng)了其起泡性能[25]。酸棗仁蛋白及其酶解產(chǎn)物在pH（2～10）范圍內(nèi)，起泡性先減弱后增強(qiáng)，在pH4時(shí)最低，此時(shí)達(dá)到了蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，溶解性較差，分散在溶液中的蛋白質(zhì)較少，進(jìn)一步導(dǎo)致其起泡性較差，隨著pH的逐漸升高，不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的溶解性逐漸增強(qiáng)，其起泡性也隨之增強(qiáng)。以上研究結(jié)果表明，不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物均具有良好起泡性能，可將其添加到泡沫型食品中，增添食品的風(fēng)味，減少化學(xué)起泡劑的使用[26]。

圖5 不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的起泡性Fig.5 Foaming properties of enzymatic hydrolysates from different Ziziphi Spinosae semen protein

圖6 不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的起泡穩(wěn)定性Fig.6 Foaming stability of enzymatic hydrolysates from different Ziziphi Spinosae semen protein

2.6 不同酸棗仁蛋白酶解物的乳化性和乳化穩(wěn)定性

不同酸棗仁蛋白酶解物的乳化性及其穩(wěn)定性如圖7、圖8所示。由圖可知，相比于酸棗仁蛋白，木瓜蛋白酶解產(chǎn)物、中性蛋白酶解產(chǎn)物及堿性蛋白酶解物乳化性和乳化穩(wěn)定性均有明顯提升，這可能是由于酶解過程中，蛋白質(zhì)中的疏水性殘基進(jìn)一步暴露，增強(qiáng)了與油的結(jié)合能力，使得蛋白質(zhì)更快更多的與油水界面吸附，增強(qiáng)了乳化性[27]。研究表明，木瓜蛋白酶解產(chǎn)物的乳化性略高于堿性蛋白酶解產(chǎn)物及中性蛋白酶解產(chǎn)物，這可能與其溶解度有關(guān)，溶解度高的酶解產(chǎn)物，溶液中蛋白質(zhì)分子含量較高，與油水界面接觸吸附的能力就越強(qiáng)，導(dǎo)致其乳化性較強(qiáng)[28]，堿性蛋白酶的乳化穩(wěn)定性強(qiáng)于中性蛋白酶和木瓜蛋白酶解物。以上研究結(jié)果表明，酶解后可進(jìn)一步提高酸棗仁蛋白的乳化性能，所得的酶解產(chǎn)物具有較好的食品功能特性。

圖7 不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物乳化性Fig.7 Emulsifying properties of different enzymatic hydrolysates from Ziziphi Spinosae semen protein

圖8 不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物乳化穩(wěn)定性Fig.8 Emulsification stability of different enzymatic hydrolysates of Ziziphi Spinosae semen protein

2.7 酸棗仁蛋白酶解物的體外抗氧化活性

2.7.1 DPPH自由基清除能力 不同酸棗仁蛋白酶解物的DPPH自由基清除能力由圖9所示，當(dāng)質(zhì)量濃度在0.5～2.5 mg/mL范圍內(nèi)，酸棗仁蛋白及其不同酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力隨濃度不斷的增加而不斷增強(qiáng)，不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力均明顯高于酸棗仁蛋白。相同質(zhì)量濃度時(shí)，堿性蛋白酶解物的DPPH清除能力最強(qiáng)，其次是中性蛋白酶解產(chǎn)物，木瓜蛋白酶解物的清除能力最弱，當(dāng)濃度為2.5 mg/mL時(shí)，堿性蛋白酶解產(chǎn)物的清除能力可高達(dá)95.87%，逐漸接近于陽性對(duì)照組VC的清除能力，且高于常見的抗氧化肽谷胱甘肽（GSH）的清除能力。這是由于堿性蛋白酶酶解時(shí)，堿性蛋白酶解物中的疏水性氨基酸含量較高，脂溶性的DPPH與其更好的結(jié)合，對(duì)DPPH的清除能力明顯增強(qiáng)[29]。以上研究結(jié)果表明酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物具有很強(qiáng)的DPPH自由基清除活性。

圖9 不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.9 DPPH radical scavenging ability of different enzymolysis hydrolysates of Ziziphi Spinosae semen protein

2.7.2 ABTS自由基清除能力 不同酸棗仁蛋白酶解物的ABTS自由基清除能力如圖10所示，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5～2.5 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，酸棗仁蛋白及其酶解物對(duì)ABTS自由基清除活性隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。結(jié)果表明，不同酶解產(chǎn)物的ABTS自由基清除能力均明顯增強(qiáng)。在相同質(zhì)量濃度下，堿性蛋白酶酶解后的蛋白酶解物對(duì)ABTS自由基清除率明顯高于酸性蛋白酶和中性蛋白酶處理的蛋白酶解物。當(dāng)質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS自由基清除率最高達(dá)到90.84%，接近于陽性對(duì)照組VC及GSH的清除能力，表明堿性蛋白酶解物具有較強(qiáng)的ABTS自由基清除能力，可作為一種潛在的抗氧化劑[30]。

2.7.3 超氧陰離子自由基清除能力 不同酸棗仁蛋白酶解物超氧陰離子自由基清除能力如圖11所示，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5～2.5 mg/mL范圍時(shí)，酸棗仁蛋白及其酶解產(chǎn)物對(duì)超氧陰離子的清除活性與樣品濃度呈正相關(guān)，均在2.5 mg/mL時(shí)具有最高的清除活性。其中堿性蛋白酶解產(chǎn)物的超氧陰離子自由基清除效果最好，其次是中性蛋白酶，木瓜蛋白酶解產(chǎn)物最差。相比于酸棗仁蛋白，不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的自由基清除活性均具有明顯提升，表明酶解處理可明顯提高蛋白質(zhì)的抗氧化性。當(dāng)質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時(shí)，堿性蛋白酶酶解物的超氧陰離子清除率最高為44.77%，中性蛋白酶解產(chǎn)物超氧陰離子清除率為38.35%，木瓜蛋白酶解產(chǎn)物超氧陰離子清除率為20.33%。其中堿性蛋白酶解物清除效果好與其產(chǎn)生大量的疏水性氨基酸與自由基結(jié)合從而產(chǎn)生良好的抗氧化效果有關(guān)[31]。

圖11 不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)超氧陰離子的清除活性Fig.11 O2?· scavenging activity of different enzymatic hydrolysates of Ziziphi Spinosae semen protein

2.7.4 羥基自由基清除能力 3種酸棗仁蛋白酶解物的羥基自由基清除能力如圖12所示，在0.5～2.5 mg/mL范圍內(nèi)，羥基自由基的清除能力與不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的質(zhì)量濃度呈正比關(guān)系，即隨著質(zhì)量濃度的增加，羥基自由基的清除能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酸棗仁蛋白經(jīng)不同蛋白酶處理后，不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的羥基自由基清除活性明顯增強(qiáng)。3種蛋白酶解產(chǎn)物中，堿性蛋白酶解產(chǎn)物的羥基自由基清除能力最強(qiáng)，為47.77%；其次是木瓜蛋白酶解產(chǎn)物，為37.16%，中性蛋白酶解產(chǎn)物的羥基自由基清除能力最差，為35.04%。以上研究結(jié)果表明，不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物均具有一定的羥基自由基清除能力，其中堿性蛋白酶解產(chǎn)物效果最好。

圖12 不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的對(duì)羥基自由基的清除能力Fig.12 ·OH scavenging ability of different enzymolysis hydrolysates of Ziziphi Spinosae semen protein

3 結(jié)論

本研究以酸棗仁蛋白為原料，采用不同蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解處理，得到三種不同蛋白酶解產(chǎn)物。并對(duì)不同酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的功能特性及體外抗氧化活性進(jìn)行比較研究。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，酶解處理后，其分子量分布有所變化，由高分子量分布向低分子量分布轉(zhuǎn)變，其中，堿性蛋白酶解產(chǎn)物的變化最為明顯。功能特性研究表明，相比于酸棗仁蛋白，持水性有所降低，不同蛋白酶解產(chǎn)物的溶解性、吸油性、起泡性、乳化性及乳化穩(wěn)定性均具有不同程度地提高，功能特性在一定溫度和pH范圍內(nèi)保持良好。體外抗氧化活性結(jié)果表明，與酸棗仁蛋白相比，不同酸棗仁蛋白酶解物的體外抗氧化活性均具有不同程度地提升，其中經(jīng)堿性蛋白酶酶解的產(chǎn)物DPPH、ABTS、超氧陰離子自由基等清除能力均強(qiáng)于中性蛋白酶解產(chǎn)物及木瓜蛋白酶解產(chǎn)物，表明酶解大大提高了酸棗仁的體外抗氧化能力，以上研究表明所得的酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物具有較好的功能特性以及體外抗氧化活性，可作為一種潛在的抗氧化劑應(yīng)用于食品及保健食品加工行業(yè)中，有助于發(fā)揮酸棗仁藥材自身最大的利用價(jià)值，為酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。