徐朝輝，鄒 苑，陳 瑛，梁 彪，趙 卿

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；2.上海市養(yǎng)志康復(fù)醫(yī)院（上海市陽光康復(fù)中心），同濟(jì)大學(xué)附屬養(yǎng)志康復(fù)醫(yī)院，上海 201619）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一種常見的中老年神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上以運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫、肌強(qiáng)直、姿勢平衡障礙等運(yùn)動(dòng)癥狀以及睡眠障礙、嗅覺障礙、自主神經(jīng)功能障礙、認(rèn)知和精神障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀為顯著特征[1]。PD主要病理特征為黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的丟失和由α-突觸核蛋白（α-Synuclein，α-Syn）組成的路易小體的存在，但發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。目前我國65歲以上人群中PD發(fā)病率為1.7%，且隨著老齡化程度加劇，據(jù)推測我國PD患病人數(shù)到2030年將達(dá)到500萬人，約占到全球PD患病人數(shù)的一半[2]。目前PD的藥物治療多以左旋多巴制劑為主，雖然能夠在一定程度上改善癥狀，但長期使用存在藥效減退、劑末現(xiàn)象、異動(dòng)癥等運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥，且無法從根本上阻止疾病進(jìn)展。

肉蓯蓉，俗稱大蕓，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列屬上品，味甘、咸，性溫，歸腎、大腸經(jīng)，中醫(yī)認(rèn)為其具有補(bǔ)腎陽，益精血，潤腸通便之效。研究表明，肉蓯蓉具有抗凋亡、抗氧化、抗衰老、抗腦缺血再灌注損傷等神經(jīng)保護(hù)作用[3]，其化學(xué)成分有苯苷類、環(huán)烯醚萜及其苷類、木脂素及其苷類、多糖以及單萜苷類、生物堿等，其中又以苯乙醇苷類和多糖為主[4]，藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉在PD及阿爾茲海默病等神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮的作用顯著[5?6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肉蓯蓉在抗衰老延年類古方中的出現(xiàn)率僅次于人參[7]。目前，肉蓯蓉常被應(yīng)用于PD的臨床治療，但其發(fā)揮療效的具體機(jī)制并不明確，本文主要從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的角度，利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫篩選肉蓯蓉的主要活性化合物，并將其作用靶點(diǎn)與PD靶點(diǎn)比對，得出關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，探析其治療PD的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，以期為深入研究提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 有效化合物

本研究使用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索肉蓯蓉成分，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18[8]為閾值，因血腦屏障功能障礙與PD病程有關(guān)[9]，故設(shè)定血腦屏障通透性（blood brain barrier，BBB）≥?0.85，通過以上限定條件篩選肉蓯蓉中的活性成分作為有效化合物。

1.2 查詢PD相關(guān)疾病靶點(diǎn)

利用PubChem數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/）、sea數(shù)據(jù)庫（http://sea.bkslab.org/）獲得肉蓯蓉所有靶點(diǎn)基因名稱。應(yīng)用GeneCard數(shù)據(jù)庫 （ https://www.genecards.org/） 以 “Parkinson’s disease”為檢索詞獲取PD靶點(diǎn)基因名稱。過比對中藥和疾病靶點(diǎn)，利用VENNY2.1軟件作交集餅圖得到PD與肉蓯蓉共有靶點(diǎn)基因信息。

1.3 靶點(diǎn)蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將1.1及1.2獲得的中藥、疾病共有基因輸入STRING（https://string-db.org/），選擇“Homo sapiens”，將最小相互作用閾值設(shè)為中等“Highest confidence>0.9”，其余設(shè)置為默認(rèn)值[10]，進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.4 基因本體（gene ontology，GO）富集和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and geomes，KEGG）通路富集

篩選關(guān)鍵靶基因（大于2倍degree），將篩選出的靶基因?qū)隓AVID6.8數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），限定物種為“Homo Sapiens”，以P<0.05為閾值，選擇其中BP、CC、MF 3對關(guān)鍵靶基因進(jìn)行GO功能富集分析，篩選具有顯著差異的生物過程及可靠的靶點(diǎn)通路，按照P值從小到大排序，前20個(gè)作為重要通路用Omicshare （http://www.omicshare.com/） 制作成可視化氣泡圖。通過KEGG通路富集分析靶點(diǎn)信號通路，以P<0.05為閾值，依據(jù)count值排序，選取前20條信號通路選用Omicshare （ http://www.omicshare.com/） 制作成可視化氣泡圖。

1.5 構(gòu)建“肉蓯蓉-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

選取前20條KEGG信號通路上的基因作為治療靶基因，將篩選的治療靶基因?qū)?yīng)的化合物和中藥導(dǎo)入到cytoscape軟件中，構(gòu)建“肉蓯蓉-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 “活性成分-靶點(diǎn)”分子對接

選取網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的肉蓯蓉有效化合物與帕金森病的關(guān)鍵靶點(diǎn)，利用AutoDock Vina工具進(jìn)行分子對接，了解靶點(diǎn)蛋白質(zhì)與活性成分的結(jié)合方式。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉蓯蓉有效化合物及靶點(diǎn)基因篩選

使用TCMSP網(wǎng)站篩選出肉蓯蓉中藥共6個(gè)有效化合物，分別 為beta-sitosterol（β-谷甾醇）、arachidonate（花生四烯酸）、suchilactone（脫水內(nèi)酯）、Yangambin（丁香樹脂二甲醚）、quercetin（槲皮素）、Marckine（楓馬京）。見表1。根據(jù)有效成分篩選出435個(gè)靶點(diǎn)基因名稱。

表1 肉蓯蓉有效成分Table 1 Effective components of Cistanches Herba

2.2 帕金森病靶點(diǎn)基因篩選

檢索GeneCard數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）得到PD相關(guān)基因，共計(jì)7846個(gè)，如LRRK2、SNCA、PRKN、PARK7、GBA、PINK1、MAPT等。

2.3 肉蓯蓉活性成分治療帕金森病預(yù)測靶點(diǎn)的篩選

通過TCMSP收集肉蓯蓉6個(gè)活性化合物對應(yīng)靶點(diǎn)，去重得到435個(gè)蛋白靶標(biāo)，與GeneCard數(shù)據(jù)庫去重所得7846個(gè)蛋白靶標(biāo)進(jìn)行比對取交集，運(yùn)用VENNY2.1軟件對疾 病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)整理后得到308個(gè)交集靶點(diǎn)，見圖1。藍(lán)色代表PD靶點(diǎn)，黃色代表肉蓯蓉靶點(diǎn)，重疊部分為共同靶點(diǎn)。

圖1 帕金森病-肉蓯蓉靶點(diǎn)交集韋恩圖Fig.1 Wayne diagram of target intersection of Parkinson’s disease-Cistanches Herba

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將上述篩選出的靶基因?qū)隨TRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，物種選“Homo sapiens”進(jìn)行PPI分析，得到肉蓯蓉作用于PD的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。共得到283個(gè)節(jié)點(diǎn)，3509條邊。

圖2 靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Protein-protein interaction network

2.5 GO功能富集分析

篩選關(guān)鍵靶基因（大于2倍degree），將篩選出的靶基因?qū)隓AVID6.8數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo Sapiens”，對38個(gè)靶基因進(jìn)行GO富集分析。結(jié)果包括生物過程（biologica process，BP）305條、細(xì)胞成分（cellular component，CC）25條、分子功能（molecular function，MF） 69條，按照P值從小到大排序，前20個(gè)重要通路用Omicshare作氣泡圖進(jìn)行可視化分析，如圖3。圖中氣泡越大富集基因個(gè)數(shù)越多，氣泡顏色越紅，P值越小，顯著性越高。圖3A中BP包括RNA聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控、以DNA作為模板轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖、凋亡過程的正調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等；圖3B可見CC分析中包括膜筏、神經(jīng)元突觸、細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、蛋白質(zhì)復(fù)合物、線粒體等；圖3C可見MF富集結(jié)果主要為腺嘌呤核苷三磷酸結(jié)合、蛋白異源二聚體活性、蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性等。

圖3 GO功能富集分析Fig.3 Gene ontology function enrichment analysis

2.6 KEGG通路分析及構(gòu)建“肉蓯蓉-化合物-靶點(diǎn)“網(wǎng)絡(luò)圖

通過KEGG通路富集分析靶點(diǎn)信號通路，以P<0.05為閾值，依據(jù)count值排序，選取前20條信號通路，其中主要包括PI3K/AKT信號通路、miRNAs調(diào)控、HIF-1、TNF、FOXO信號通路等，依據(jù)結(jié)果繪制氣泡圖，見圖4。圖中氣泡越大富集基因個(gè)數(shù)越多，氣泡顏色越紅，P值越小，顯著性越高。選取前20條KEGG信號通路上的基因作為治療靶基因，將91個(gè)治療靶基因?qū)?yīng)的化合物和中藥導(dǎo)入到cytoscape軟件中，構(gòu)建中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖5。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)表示靶標(biāo)或化合物，而邊則表示活性成分與PD靶標(biāo)之間的相互作用，顏色越深，degree值越高。

圖4 KEGG信號通路富集分析Fig.4 Enrichment analysis of Kyoto encyclopedia of genes and geomes signal pathway

圖5 “肉蓯蓉-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Network diagram of “Cistanches Herba-compound-target”

2.7 “活性成分-靶點(diǎn)”分子對接

從中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中將基因靶點(diǎn)以degree值高低進(jìn)行排序，選擇前5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別為絲裂原活化蛋白激酶8（mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8）、雌激素受體1（estrogen receptor alpha 1，ESR1）、類固醇受體輔助活化因子（steroid receptor coactivator，SRC）、蛋白酪氨酸激酶2（janus kinase signal transducers 2，JAK2）、絲氨酸/蘇氨酸激酶1（serine/threonine kinases 1，AKT1）。利用Auto-Dock Vina[11]分別與肉蓯蓉的6個(gè)活性成分（β-谷甾醇、花生四烯酸、脫水內(nèi)酯、丁香樹脂二甲醚、槲皮素和楓馬京）進(jìn)行分子對接。結(jié)合能

表2 肉蓯蓉有效活性成分與對應(yīng)核心靶點(diǎn)的分子對接Table 2 Molecular docking of effective active components of Cistanches Herba with corresponding core targets

圖6 分子對接模式圖Fig.6 Molecular docking mode

3 討論

研究表明肉蓯蓉主要成分苯乙醇苷可通過抑制Caspase-3的活性，對抗1-甲基-4-苯基吡啶離子 （1-methyl-4- phylpyridiniumion，MPP+） 導(dǎo)致的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡[13]。研究也發(fā)現(xiàn)松果菊苷作為肉蓯蓉活性成分之一，能抑制PD小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的減少，且通過GFRa1/AKT信號通路上調(diào)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）表達(dá)[14]，通過ROS/ATF3/CHOP通路抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[15]，增加紋狀體多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)含量，改善PD小鼠的行為學(xué)異常，表現(xiàn)出良好的神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)作用[16]。但關(guān)于肉蓯蓉其他有效成分在治療PD中的作用機(jī)制仍未探究。

本研究通過篩選發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉的有效活性成分一共6種，分別是beta-sitosterol（β-谷甾醇）、arachidonate（花生四烯酸）、suchilactone（脫水內(nèi)酯）、Yangambin（丁香樹脂二甲醚）、quercetin（槲皮素）、Marckine（楓馬京）。研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇具有抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等作用[17]，而氧化應(yīng)激損傷是PD發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[18]，推測β-谷甾醇可能通過抗氧化應(yīng)激治療PD?；ㄉ南┧峥梢酝ㄟ^激活過氧化物酶增殖體激活受體（peroxisome proliferatorsactivated receptors，PPAR）及促進(jìn)新蛋白合成來增強(qiáng)神經(jīng)組織內(nèi)部的抗氧化系統(tǒng)，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞[19]。有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠通過抑制AGEs/RAGE/NF-κB炎癥通路，從而降低腦組織炎性因子的生成[20]。而另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)中藥提取物可通過抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs），阻斷晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor of advanced glycation endproducts，RAGE）表達(dá)，從而抑制人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（human neuroblastoma cells，SH-SY5Y）中 甲 基 乙 二 醛（methylglyoxal，MGO）觸發(fā)的核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）激活和易位，而已知MGO是一種二羰基代謝物，與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展有關(guān)，提示可通過調(diào)節(jié)AGEs/RAGE/NF-κB通路減輕反應(yīng)性二羰基化合物的神經(jīng)毒性[21]。此外，另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)具有高氧化還原活性的鐵可催化大腦氧化反應(yīng)，還參與產(chǎn)生高毒性自由基（Fenton反應(yīng)），從而對細(xì)胞造成氧化應(yīng)激損傷，最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡，而槲皮素可充當(dāng)強(qiáng)有力的鐵螯合劑發(fā)揮抗氧化作用，表現(xiàn)出一定的神經(jīng)保護(hù)作用[22]。

GO功能富集分析表明肉蓯蓉具有促進(jìn)ATP合成、保護(hù)線粒體呼吸鏈的功能完整的作用，而線粒體功能障礙是引起多巴胺能神經(jīng)元變性、死亡機(jī)制之一[23]。肉蓯蓉還可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成、折疊、降解等活動(dòng)，維持“蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)”。而研究表明蛋白質(zhì)構(gòu)象異?；蜻^度沉積可抑制突觸功能，干擾細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致由泛素蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解功能紊亂，最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞死亡[24]。

通過KEGG富集得到活性成分與PD靶標(biāo)之間相互作用的主要信號通路，包括PI3K/AKT信號通路、miRNAs調(diào)控、HIF-1、TNF及FOXO信號通路等，表明肉蓯蓉通過多條通路作用于PD發(fā)病的調(diào)控過程。AKT，又名蛋白激酶B，是一種促進(jìn)細(xì)胞存活的激酶，其存在于磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI3K）信號途徑中。PI3K激活后的產(chǎn)物與AKT的PH結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，使其Ser473和Thr308位點(diǎn)磷酸化，從而激活A(yù)KT。研究發(fā)現(xiàn)PD患者黑質(zhì)致密部（substantia nigra compacta，SNc）中總AKT水平及活性磷酸化AKT水平均顯著降低[25]。林瑤等[26]發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉可使PD大鼠黑質(zhì)紋狀體中PI3K、ATK的表達(dá)升高及其下游凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)升高、Bax表達(dá)降低，提示肉蓯蓉通過激活PI3K/AKT通路，從而升高Bcl-2/Bax比值，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）活性增高，誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元凋亡，而研究發(fā)現(xiàn)載有堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的脂質(zhì)體通過激活PI3K/AKT通路增加GSK-3β的磷酸化，從而抑制GSK-3β活性保護(hù)神經(jīng)元[27]。此外，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）作為PI3K/AKT下游信號分子，是自噬過程的主要調(diào)節(jié)因子，而α-Syn的聚集是PD發(fā)病機(jī)制的核心之一，激活PI3K/ATK/mTOR通路誘發(fā)自噬途徑使聚集的α-Syn降解，從而發(fā)揮治療PD的作用[28]。由此可見肉蓯蓉有效成分可能通過激活PI3K/AKT信號通路促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活發(fā)揮治療PD的作用。同樣涉及α-Syn聚集導(dǎo)致PD的發(fā)病機(jī)制，Pino等[29]發(fā)現(xiàn)叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O亞型（forkhead box O，F(xiàn)OXO）家族重要的自噬調(diào)控因子FOXO3有效地減少可溶性α-Syn含量，且FOXO3控制神經(jīng)元細(xì)胞中的自噬流量。由此可以推測，肉蓯蓉有效成分可能通過FOXO信號通路減少α-Syn的積累保護(hù)多巴胺神經(jīng)元。

miRNAs作為一簇微小的內(nèi)源性非編碼小RNA分子，能夠通過序列特異性的方式來調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，參與調(diào)控多巴胺神經(jīng)元增殖、凋亡及自噬等生物過程[30]。研究發(fā)現(xiàn)α-Syn（其編碼基因?yàn)镾NCA）的異常表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)多巴胺神經(jīng)元凋亡，而miRNA-7及miRNA-153可降低PD模型中SNCA的表達(dá)水平，改善PD癥狀[31]；同時(shí)miR-425可以恢復(fù)功能失調(diào)的多巴胺能神經(jīng)院并改善PD小鼠行為缺陷[32]。這些也驗(yàn)證了肉蓯蓉通過調(diào)控miRNA影響PD發(fā)病過程，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）是一種對氧敏感的轉(zhuǎn)錄激活因子，由組成型表達(dá)的β亞基和低氧誘導(dǎo)型的α亞基構(gòu)成，參與血管生成、鐵代謝、葡萄糖能量代謝和細(xì)胞增殖及存活的基因轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)[33]。有研究發(fā)現(xiàn)魚藤酮或MPP+處理的PD模型SH-SY5Y細(xì)胞中HIF-1α的蛋白質(zhì)水平降低，鐵鐵螯合劑去鐵胺可引HIF-1α的積累，伴隨著SH-SY5Y細(xì)胞中自噬的增強(qiáng)；當(dāng)HIF-1α基因被抑制時(shí)，去鐵胺誘導(dǎo)的自噬也相應(yīng)受到抑制，表明去鐵胺在魚藤酮誘導(dǎo)的PD細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用可能是通過HIF-1α積累以及HIF-1α介導(dǎo)的自噬誘導(dǎo)[34]。食欲素A（Orexin-A）是下丘腦神經(jīng)元分泌的一種神經(jīng)肽，可在神經(jīng)病變中發(fā)揮保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)Orexin-A作用于經(jīng)MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞后，不僅誘導(dǎo)HIF-1α的產(chǎn)生，同時(shí)激活HIF-1下游靶標(biāo)如血管內(nèi)皮生長因子，減輕細(xì)胞損傷，起到神經(jīng)保護(hù)作用[35]?？梢?，肉蓯蓉有效成分可能通過增加HIF-1靶基因的表達(dá)激活誘導(dǎo)受損細(xì)胞自噬，減輕細(xì)胞損傷。

越來越多證據(jù)支持神經(jīng)炎癥反應(yīng)參與PD的發(fā)病機(jī)制[36]，而腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）通路作為重要的炎癥反應(yīng)通路，介導(dǎo)激活炎性小體，進(jìn)而激活小膠質(zhì)細(xì)胞，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞通過增殖和分泌炎癥因子可損傷多巴胺能神經(jīng)元[37]。Liang等[38]用肉蓯蓉提取物松果菊苷處理亞急性PD小鼠模型后發(fā)現(xiàn)，松果菊苷可減少小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，降低炎癥因子TNF-α水平，上調(diào)GDNF表達(dá)，改善PD小鼠行為學(xué)癥狀。

通過構(gòu)建中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)degree值高低進(jìn)行排序，選擇前5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別為MAPK8、ESR1、SRC、JAK2、AKT1。Liu等[39]發(fā)現(xiàn)中藥提取物可以通過激活絲裂原活化蛋白激酶8（mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8），從而促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2 磷酸化，進(jìn)而清除受損線粒體，間接抑制細(xì)胞凋亡，最終通過調(diào)節(jié)自噬、凋亡再平衡而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，可能也是肉蓯蓉的作用機(jī)制之一。Chakrabarti等[40]發(fā)現(xiàn)雌激素受體（estrogen receptor alpha，ESR）激動(dòng)劑可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活性減輕炎癥反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；而另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)雌激素作用于ESR抑制NADPH氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase）活性，減少神經(jīng)炎癥標(biāo)志物，從而減輕神經(jīng)損傷[41]。由此可以得出肉蓯蓉有效成分可能作用于ESR1靶點(diǎn)減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)治療PD。與ESR相反，類固醇受體輔助活化因子（steroid receptor coactivator，SRC）作為促炎因子會(huì)造成PD小鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷[42]。絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1）屬于AKT家族，是參與細(xì)胞存活和凋亡調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心分子，磷酸化時(shí)完全激活[43]。有研究顯示在PD中，維持AKT1中半胱氨酸296和310的硫醇狀態(tài)對于AKT1激酶活性和防止其被蛋白酶體降解至關(guān)重要[44]?？梢?，上述四個(gè)分子均可能是肉蓯蓉保護(hù)效應(yīng)的靶點(diǎn)。再利用AutoDock Vina將以上5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與肉蓯蓉的6個(gè)活性成分（β-谷甾醇、花生四烯酸、脫水內(nèi)酯、丁香樹脂二甲醚、槲皮素和楓馬京）分別進(jìn)行分子對接，均成功對接，結(jié)合能均小于?5 kcal/mol，提示藥物與靶點(diǎn)的結(jié)合活性較好。其中槲皮素和SRC具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性，結(jié)合能為?9.2 kcal/mol，可從抗神經(jīng)炎癥、抗凋亡角度進(jìn)一步深入研究肉蓯蓉的作用機(jī)制。

綜上，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接探討了臨床常用于治療PD的有效藥物肉蓯蓉作用靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉通過多組分、多通路、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用發(fā)揮其在PD中的療效，為進(jìn)一步研究肉蓯蓉神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)理和深入探討PD發(fā)病機(jī)制提供了依據(jù)。另外，本研究的篩選標(biāo)準(zhǔn)與中藥各組分的口服吸收度及生物利用度均有一定關(guān)系，所以并非對所有有效成分都能進(jìn)行充分分析，這對我們天然藥物的開發(fā)也有一定啟示作用，即應(yīng)結(jié)合中藥成分的吸收、代謝等特點(diǎn)，同時(shí)考慮不同給藥途徑及不同個(gè)體或組織器官的分布情況進(jìn)行深入研究。