黃敏儀，陳可純，羅朵生，貝偉劍，楊祎琦，郭姣

（廣東藥科大學(xué)廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心/糖脂代謝病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006）

隨著中國社會經(jīng)濟(jì)的持續(xù)發(fā)展，人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的改變，高脂肪、高熱量的食物攝入比例不斷增加，高脂飲食導(dǎo)致的血脂代謝紊亂使過多的脂質(zhì)堆積在腎臟，從而導(dǎo)致腎損傷[1]。田黃方（THF）為廣東藥科大學(xué)郭姣教授多年的臨床驗(yàn)方[2]，由黃連、三七2 味中藥組成，具有治療高脂血癥、非酒精性脂肪肝、動脈粥樣硬化、腎間質(zhì)纖維化及老年糖脂代謝紊亂等功效[2?6]。本研究利用高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠腎臟損傷模型為載體，探究其對腎臟的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

黃連、三七飲片由廣州致信中藥飲片有限公司提供（批號：190301、190603），THF 是由黃連與三七飲片通過乙醇提取和大孔樹脂富集純化的方法制備得到的提取物；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（美國Roche 公司）；組織蛋白提取液（美國Thermo sci‐entific 公司）；BCA 試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司）；總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL?C）、丙二醛（MDA）、乳酸脫氫酶（LDH）和超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究院）；SDS?PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司）；PVDF 膜（美國im‐mobilon?PSQ 公司）；一步法TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）；TBS緩沖液、PBS緩沖液、SABC 免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；甲醇（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；Tween?20（碧云天生物技術(shù)公司）；蘇木素?伊紅染液（德國sigma公司）；甘氨酸、Tris Base（上海生工生物工程有限公司）；SDS（Serva 公司）；脫脂奶粉（日本Fujifilm公司）；抗體稀釋液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Bax、Bcl2、p?AKT、GAPDH、β?actin、Cleaved caspase?3抗體（美國CST公司）。

1.2 主要儀器

組織破碎儀（美國QIAGEN 公司）；BX53 顯微鏡（日本Olympus公司）；H2050R?1低溫高速離心機(jī)（上海華巖設(shè)備有限公司）；1658025 小型垂直電泳儀（美國Bio?Rad 公司）；10017142ChemiDoc XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio?Rad公司）；SHP?150型生化培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Mithras LB940酶標(biāo)儀（德國Berthold Technologies公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠，體質(zhì)量（18±2）g，購自廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：44007200052789。

1.4 高脂誘導(dǎo)小鼠腎臟損傷模型的構(gòu)建[6]

小鼠購入后自由攝食飲水，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組（Control）、模型組（Model）、田黃方組（THF）。正常組及模型組分別采用正常飲食和高脂飲食喂養(yǎng)5個月后，連續(xù)給藥THF（10 mL/kg）干預(yù)6周，取腎臟組織備檢。

1.5 腎臟組織蘇木精?伊紅(H&E)染色

將每組相同位置的腎臟組織塊放入4%（φ）多聚甲醛中固定后，按照70%（φ）乙醇、75%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇及無水乙醇的濃度梯度進(jìn)行脫水處理，再用二甲苯進(jìn)行透明處理，最后置于石蠟中進(jìn)行包埋處理。將包埋好的組織按照4 μm厚度切片，常規(guī)脫蠟，分別置于無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇復(fù)水，然后用純水浸泡5 min 清洗后，進(jìn)行HE 染色，脫水后，使用中性樹膠封片，過夜風(fēng)干，于光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)。

1.6 腎臟組織中TC、TG、LDL?C、LDH、SOD 和MDA水平的測定

取小鼠腎臟，加入一定量的4 ℃預(yù)冷的PBS，勻漿后于2 500 r/min（4 ℃）離心20 min，收集上清液備用，并測定組織蛋白濃度。根據(jù)反應(yīng)生成的醌類化合物顏色深淺與TC、TG的含量成正比的原理，按照試劑盒說明書檢測腎勻漿上清TC、TG 含量。利用直接法?表面活性劑消除法使吸光度與LDL?C 的含量成正比的原理，按照試劑盒說明書檢測腎勻漿上清LDL?C 含量。根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)生的丙酮酸二硝基苯腙顏色深淺與LDH的含量成正比的原理，按照試劑盒說明書檢測腎勻漿上清LDH 含量。根據(jù)MDA與硫代巴比妥酸反應(yīng)形成紅色產(chǎn)物的顏色深淺與MDA含量成正比的原理，按照試劑盒說明書檢測腎勻漿上清MDA 含量。根據(jù)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)生成超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，最后顯色為紫紅色，顯色物的顏色深淺與SOD 含量成反比的原理，按照試劑盒說明書檢測腎勻漿上清SOD活力。

1.7 腎臟組織TUNEL染色

組織固定、脫水、包埋、切片、脫蠟后，使用不含DNase 的蛋白酶K 室溫孵育20 min 后，再加入適量TUNEL 檢測液，于37 ℃避光孵育1 h，使用含DAPI的抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察到呈現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞，即為凋亡細(xì)胞，使用Image J軟件進(jìn)行陽性細(xì)胞表達(dá)百分比分析。

1.8 腎臟組織中Cleaved caspase?3的測定

1.8.1 免疫組化法（immunohistochemistry,IHC) 組織固定、脫水、包埋、切片、脫蠟后，進(jìn)行IHC 染色，染色步驟按SABC 免疫組化試劑盒操作，其中一抗Cleaved caspase?3 按說明書推薦1∶200 稀釋濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。最后中性樹膠封片，過夜風(fēng)干。于光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理形態(tài)并拍攝圖像，使用Image J軟件進(jìn)行陽性表達(dá)定量分析。

1.8.2 蛋白免疫印跡(WB) 法取凍存的腎臟組織，加入一定量含抑制劑的裂解液，勻漿后于12 000 r/min（4 ℃）離心20 min，取上清，按BCA 試劑盒說明書操作，測定組織蛋白含量并定量。每組取等量蛋白上樣，采用SDS?PAGE 分離蛋白，300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜2 h 后，使用5%脫脂牛奶常溫封閉2 h，洗膜后，分別加入一抗Cleaved caspase?3（1∶1 000）、GAP‐DH（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。次日，回收一抗，TBST 洗膜后，分別加入HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體（1∶3 000），常溫孵育1.5 h，回收二抗，洗膜后顯影。使用Image Lab軟件分析條帶的蛋白灰度值并分析。

1.9 腎臟組織PI3K、p?AKT、Bax 和Bcl2 蛋白表達(dá)水平的測定

采用WB 法測定腎臟組織中PI3K、p?AKT、Bax和Bcl2蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)步驟同“1.8.2”，其中加入的一抗，包括PI3K（1∶1 000）、p?AKT（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl2（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）和β?actin（1∶1 000）；加入的二抗，包括HRP 標(biāo)記的羊抗兔抗體（1∶3 000）、羊抗鼠抗體（1∶3 000）。使用Image Lab軟件對蛋白的灰度值進(jìn)行分析。1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8 軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，計量數(shù)據(jù)以±s表示。采用單因素方差分析法（One?way ANOVA）進(jìn)行組間比較，方差齊時，使用LSD?T檢驗(yàn)；若方差不齊，則使用Dunnett’s T3 mul‐tiple comparisons test。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THF 對高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟損傷的病理形態(tài)學(xué)的影響

采用H&E染色觀察小鼠的腎臟組織病理狀況。結(jié)果如圖1 所示，正常組小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)排列比較整齊，腎小球、腎小管形狀比較規(guī)則；模型組小鼠腎小球體積明顯腫脹增大，球囊壁出現(xiàn)黏連；與模型組相比，THF 組小鼠腎小球與腎小管的病理形態(tài)均得到明顯改善，包括腎小球體積減小、球囊壁黏連減少等。

圖1 THF改善高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟損傷Figure 1 THF improves renal damage in mice induced by high fat diet

2.2 THF對高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟中TC、TG、LDL?C、LDH、SOD和MDA水平的影響

如表1所示，與正常組相比，模型組小鼠腎臟勻漿中TC、TG、LDL?C、LDH 和MDA 水平顯著升高（P＜0.01 或P＜0.05），SOD 水平顯著降低（P＜0.05）；經(jīng)THF 治療后，一定程度緩解了腎臟損傷，而且腎臟組織中TC 和LDL?C 水平也顯著降低（P＜0.01 或P＜0.05）。

表1 THF改善高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟脂質(zhì)與氧化應(yīng)激指標(biāo)Table 1 Effect of THF on lipid and oxidative stress indicators in mice induced by high fat diet(±s，n=6)

表1 THF改善高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟脂質(zhì)與氧化應(yīng)激指標(biāo)Table 1 Effect of THF on lipid and oxidative stress indicators in mice induced by high fat diet(±s，n=6)

與正常組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

組別Control Model THF TC/（mmol·g prot-1）0.27±0.02 0.65±0.17**0.31±0.10##TG/（mmol·g prot-1）0.72±0.13 1.32±0.45*0.85±0.34 LDL-C/（mmol·g prot-1）0.22±0.10 0.44±0.12*0.20±0.06#LDH/（U·g prot-1）4.42±0.88 10.90±4.64**6.67±2.99 MDA/（nmol·mg prot-1）4.65±1.91 16.69±6.33**13.17±4.50*SOD/（U·mg prot-1）11.91±4.83 3.57±3.09*7.06±5.28

2.3 THF對高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟中Cleaved caspase?3表達(dá)的影響

2.3.1 THF改善高脂誘導(dǎo)的小鼠腎損傷中的Cleaved caspase?3 的表達(dá) IHC 染色結(jié)果如圖2A 所示，Cleaved caspase?3 陽性染色主要分布在胞漿，大量表達(dá)在腎小管，腎小球也有少量分布，呈棕黃色。從圖2B 可知，與正常組比較，模型組Cleaved caspase?3 的表達(dá)顯著升高（P＜0.01），THF 干預(yù)后，Cleaved caspase?3顯著減少（P＜0.01）。

2.3.2 THF 對高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟中的Cleaved caspase?3 蛋白表達(dá)的影響如圖2C、2D 所示，與正常組相比，高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟中Cleaved caspase?3蛋白的表達(dá)顯著升高（P＜0.01），經(jīng)THF 干預(yù)后，Cleaved caspase?3 蛋白在高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟的表達(dá)顯著減少（P＜0.01）。

圖2 THF下調(diào)高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟中Cleaved caspase?3的表達(dá)Figure 2 THF reduces the level of Cleaved caspase?3 in mice induced by high fat diet

2.4 THF 對高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟中PI3K、p-AKT、Bax和Bcl2蛋白表達(dá)的影響

如圖3 所示，與正常組相比，模型組中PI3K、p?AKT、Bcl2 蛋白表達(dá)和Bcl2/Bax 比值均顯著下調(diào)（P＜0.05 或P＜0.01），Bax 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；與模型組相比，THF 組小鼠腎臟中PI3K、p?AKT、Bcl2 和Bcl2/Bax 比值均顯著上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），并且Bax 蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.01），提示THF可以抑制PI3K/p?AKT/凋亡信號通路從而抑制高脂誘導(dǎo)的小鼠腎損傷的發(fā)展。

圖3 THF 對高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟中PI3K、p?AKT、Bax 和Bcl2蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effect of THF on the protein levels of PI3K，p?AKT，Bax，and Bcl2 in mice induced by high fat diet

2.5 THF 對高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡的影響

如圖4所示，與正常組相比，可見高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟組織中凋亡細(xì)胞顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，THF 組小鼠腎臟中凋亡細(xì)胞顯著減少（P＜0.01），提示THF對高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟組織損傷有較好的保護(hù)作用。

圖4 THF 對高脂誘導(dǎo)的小鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡的影響（200×）Figure 4 Effects of THF on apoptosis of kidney cells in mice fed with high fat diet

3 討論

高脂飲食可引起機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致腎臟出現(xiàn)脂毒性，表現(xiàn)為血清肌酐及血清尿素氮水平升高、腎小球?yàn)V過率異常、蛋白尿、腎小球肥大和腎小球細(xì)胞外基質(zhì)堆積等異?，F(xiàn)象[7]，表明脂質(zhì)代謝紊亂與腎損傷之間存在密切關(guān)系。中醫(yī)典籍中，《素問·逆調(diào)論》：“腎者水臟，主津液”，說明若腎氣虛弱，氣化失常，則腎對津液調(diào)控功能發(fā)生紊亂，津聚體內(nèi)而生痰，體內(nèi)血脂異常[8?10]。因此，尋找一種有效治療高脂導(dǎo)致的腎損傷藥物，并明確其作用機(jī)制，對臨床治療高脂誘發(fā)的腎損傷或其他代謝紊亂疾病具有重要意義。

高脂飲食引發(fā)的腎臟損傷的一個主要特點(diǎn)是脂質(zhì)蓄積，主要表現(xiàn)為腎臟組織中TC、TG和LDL?C的升高[11?12]。腎臟脂質(zhì)蓄積容易壓迫腎周組織血管，導(dǎo)致腎臟的線粒體功能障礙；腎臟的線粒體損傷后，脂肪酸氧化效率降低，加劇腎臟脂質(zhì)蓄積，這使得細(xì)胞內(nèi)的游離脂肪酸及代謝產(chǎn)物過量蓄積，活性氧（ROS）大量產(chǎn)生，導(dǎo)致機(jī)體ROS 的生成與清除的動態(tài)平衡狀態(tài)被打破，最終腎臟發(fā)生氧化應(yīng)激[13?14]。另外，隨著慢性炎癥的出現(xiàn)，腎臟功能不斷下降，同時，炎癥因子也進(jìn)一步加重腎臟的脂質(zhì)積蓄。炎癥通過刺激機(jī)體產(chǎn)生趨化因子，從而增加ROS 的釋放，導(dǎo)致腎臟出現(xiàn)氧化應(yīng)激，表現(xiàn)為MDA升高，SOD 降低[15]。氧化應(yīng)激也影響機(jī)體的炎癥反應(yīng)及線粒體損傷，加劇腎臟損傷，導(dǎo)致腎臟損傷標(biāo)志物L(fēng)DH[16]表達(dá)降低。因此，腎臟的脂質(zhì)積蓄、炎癥反應(yīng)、線粒體損傷、脂質(zhì)過氧化與氧化應(yīng)激相互影響，造成腎臟細(xì)胞損傷。

腎臟損傷的氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量的ROS 不僅對細(xì)胞具有直接損傷的作用，還可以激活一系列信號通路作為信號分子參與細(xì)胞凋亡[17]。關(guān)于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞凋亡的機(jī)制[14]，研究較多的是線粒體起始的內(nèi)源性凋亡途徑、Bcl2基因家族的調(diào)控、NF?κB、MAPKs家族的介導(dǎo)和caspase級聯(lián)反應(yīng)。

田黃方THF 是郭姣教授應(yīng)用“調(diào)肝啟樞化濁”法治療糖脂代謝性疾病的有效驗(yàn)方，能夠使肝氣調(diào)達(dá)，氣機(jī)通暢，五臟調(diào)和，氣血津液運(yùn)化正常，化解祛除痰濁等物質(zhì)，降低血脂[18?20]。前期研究表明，田黃方能夠降低高脂血癥大鼠血漿中的TC、TG、LDL?C[3]，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測其可通過PI3K/AKT 信號通路影響糖脂代謝紊亂[21]。本研究也發(fā)現(xiàn)，高脂飲食使小鼠腎臟出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂，TC、TG、LDL?C 和LDH 含量升高，同時腎臟存在如腎小球體積明顯增大及球囊壁出現(xiàn)黏連等腎臟病理變化。機(jī)體發(fā)生脂質(zhì)代謝紊亂時，伴隨氧化應(yīng)激的出現(xiàn)，而氧化應(yīng)激與腎損傷有關(guān)[1]。本研究中，模型組的MDA 水平升高，SOD 活力降低，反映腎組織內(nèi)氧化應(yīng)激的出現(xiàn)。而THF 一定程度逆轉(zhuǎn)了以上的脂質(zhì)代謝紊亂狀態(tài)及提高抗氧化水平，減輕腎損傷。在中藥治療高脂誘導(dǎo)的腎損傷的相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)通過上調(diào)PI3K/AKT 信號通路，緩解高脂導(dǎo)致的小鼠代謝紊亂狀態(tài)[22?23]。腎損傷亦與細(xì)胞凋亡有關(guān)[24]，其中PI3K/AKT 通路的下游促凋亡蛋白Bax、cas‐pase?3與抗凋亡蛋白Bcl2參與細(xì)胞凋亡的復(fù)雜病理生理過程[25?26]。因此本研究圍繞THF 是否可通過PI3K/AKT 信號通路，抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕高脂導(dǎo)致的腎損傷，進(jìn)行了相關(guān)的機(jī)制研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠腎臟組織中PI3K、p?AKT 的表達(dá)下降，Bcl2 蛋白的表達(dá)和Bcl2/Bax 的比值降低，Bax、Cleaved caspase?3 蛋白的表達(dá)增加，而THF 可以緩解高脂誘導(dǎo)的腎臟中PI3K、p?AKT、Bcl2、Bcl2/Bax 的表達(dá)下降，抑制Bax、Cleaved cas‐pase?3 的表達(dá)升高，表明THF 保護(hù)高脂誘導(dǎo)的腎組織損傷可能與調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號通路、抑制腎臟細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，田黃方可有效改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠腎臟損傷，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號通路、抑制細(xì)胞凋亡、改善機(jī)體氧化應(yīng)激及脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)，如圖5。研究成果將為田黃方在臨床治療由高脂飲食引起的腎損傷提供科學(xué)依據(jù)。

圖5 THF對高脂誘導(dǎo)的小鼠腎損傷的作用機(jī)制研究Figure 5 The mechanism of THF on renal injury induced by high fat diet in mice