衛(wèi)紅齊，陳 偉，徐夏媛，劉志勇，莫江偉，邢洪瑜，曹忠勝

0 引 言

嗜酸粒細(xì)胞性慢性鼻-鼻竇炎(eosinophilic chronic rhinosinusitis, ECRS)作為慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps, CRSwNP)的一個(gè)亞型，是一種高度異質(zhì)性鼻腔鼻竇黏膜慢性炎性疾病，近年發(fā)病率有上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。研究發(fā)現(xiàn)，ECRS除鼻-鼻竇黏膜組織中有大量嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil，EOS)浸潤(rùn)以外，通常伴有廣泛息肉形成，且以2型T輔助細(xì)胞(type-2 T helper cell，Th2)反應(yīng)為主，雖對(duì)糖皮質(zhì)激素治療敏感，然在停用糖皮質(zhì)激素后難以維持長(zhǎng)期療效，即使手術(shù)治療，黏膜炎癥也難以控制，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高[2-3]。因此，探究ECRS發(fā)病機(jī)制并尋求好的治療方案具有重要臨床意義，故建立一個(gè)理想動(dòng)物模型進(jìn)行相關(guān)研究倍受關(guān)注。而目前截止投稿國(guó)內(nèi)有關(guān)ECRS動(dòng)物模型的建立方法未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用普通抗原卵清蛋白(ovalbumin，OVA)聯(lián)合超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)來(lái)建立小鼠ECRS實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠24只 ，4～6周齡，體重20～30g，購(gòu)自上海千全生物科技有限公司，常規(guī)方法飼養(yǎng)于我院實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)：SYXK(蘇)2016-0050。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，溫度22～24℃，濕度50%，正常飲食。

OVA(編號(hào)：A5503-10G)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，SEB(編號(hào)：BT202)購(gòu)自美國(guó)Toxin Technology 公司，氫氧化鋁粉劑(編號(hào)：77161)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，小鼠 IFN-γ(編號(hào)：EK280/3-96)、IL-4(編號(hào)：EK204/2-96)、IL-5(編號(hào)：EK205-96)、IL-17A(編號(hào)：EK217/2-96)細(xì)胞因子特異性ELISA試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物科技有限公司。免疫組化試劑：一抗為抗嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白(Eosinophil cationic protein，ECP)兔單克隆抗體(編號(hào)：ab207429)，二抗為生物素結(jié)合的山羊抗兔lgG(編號(hào)：ab205718)，均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2ECRS模型的建立方法將24只BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為4組，分別為：磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)組、SEB組、OVA組及SEB+OVA組，每組6只。建模方法參照Kim等[4]所采用的方法并進(jìn)行適當(dāng)改變。用腹腔注射OVA以及鼻腔滴入OVA使小鼠致敏，后通過(guò)鼻腔滴入SEB以及OVA的方法誘導(dǎo)小鼠ECRS。PBS組：第0天(d0)和第5天(d5)經(jīng)腹腔注射0.2 mL PBS溶液；從d12開(kāi)始，連續(xù)7d每天予40 μL PBS溶液滴鼻；從d19至d102共12周，每周3次予40 μL PBS溶液滴鼻。SEB組小鼠前46天與PBS組小鼠處理方法相同，從d47開(kāi)始連續(xù)8周用10 ng SEB，每周一次鼻腔滴注。OVA及SEB+OVA兩組小鼠：d0和d5腹腔注射0.2 mL含25 μg OVA及2mg氫氧化鋁的混懸液(PBS稀釋)；從d12開(kāi)始，連續(xù)7天每天予40 μL 3%OVA溶液滴鼻；從d19至d102共12周，每周3次予40 μL 3%OVA溶液滴鼻。SEB+OVA組從d47開(kāi)始除了鼻腔滴注3%OVA溶液以外，連續(xù)8周給予10 ng SEB，每周一次滴鼻。每天觀察動(dòng)物飲食、精神狀況以及鼻部癥狀。在d103獲取標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3ECRS模型檢測(cè)

1.3.1 細(xì)胞因子表達(dá)水平小鼠用7%水合氯醛(0.05 mL/10 g)腹腔注射麻醉后固定，仰臥頭低位進(jìn)行鼻腔灌洗(頭低位防止灌洗液流入下呼吸道)。一側(cè)鼻腔以5滴/min(平均一滴約0.05 mL) 的速度緩慢滴入等滲鹽水，同時(shí)在對(duì)側(cè)鼻腔用低負(fù)壓持續(xù)抽吸收集鼻腔灌洗液(nasal lavage fluid, NLF)(此法有60%～80%回收率)。共收集NLF約2 mL，室溫靜止沉淀30 min，4 ℃離心10 min，4000 r/min，離心半徑6 cm，取其上清液-70 ℃保存待測(cè)。所有上清液標(biāo)本收集完畢后，用ELISA，按照試劑盒操作步驟檢測(cè)NLF中的IFN-γ、IL-4、IL-5及IL-17A的濃度。

1.3.2組織病理學(xué)觀察NLF收集完后，頸椎脫臼法處死小鼠，去除頭部皮膚及皮下軟組織，斷頭后整體放福爾馬林固定48h后用10% EDTA脫鈣液脫鈣5周，每3天更換一次脫鈣液。后經(jīng)脫水、包埋制作蠟塊, 切片(片厚4μm)后用HE染色，在光鏡下觀察各組小鼠鼻-鼻竇黏膜組織病理學(xué)改變。主要觀察鼻-鼻竇有無(wú)息肉樣病變以及黏膜組織中EOS浸潤(rùn)情況，并在高倍視野(400倍)下對(duì)息肉樣病變以及EOS進(jìn)行計(jì)數(shù)。息肉樣病變定義為有明顯的黏膜隆起伴EOS浸潤(rùn)。觀察結(jié)果用息肉樣病變計(jì)數(shù)/只以及EOS計(jì)數(shù)/HPF來(lái)表示。

1.3.3免疫組化染色用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)鼻-鼻竇黏膜組織中ECP表達(dá)水平。4μm厚切片在二甲苯中脫蠟后用乙醇水化，PBS沖洗3次，用1%的正常山羊血清封閉切片，然后滴加一抗，為抗ECP兔單克隆抗體，在4℃的加濕環(huán)境下過(guò)夜。切片用PBS沖洗3次，然后滴加二抗，為生物素結(jié)合的山羊抗兔lgG(1∶1200)，在室溫下孵育90 min。隨后，切片在室溫下與生物素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物(avidin-biotinylated horseradish peroxidase complex, ABC)孵育60min，PBS沖洗，用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色處理。最后，切片用蘇木素襯染，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察。每張切片均由兩名未知?jiǎng)游锓纸M的病理科醫(yī)師獨(dú)立觀察并分析。

結(jié)果判定：ECP主要表達(dá)于EOS的細(xì)胞核內(nèi)，以細(xì)胞核染成棕黃色和(或)棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞。每只小鼠取染色良好切片3張，每張切片于400倍視野下任意取不相重疊的黏膜組織5處進(jìn)行觀測(cè)，對(duì)表達(dá)ECP的陽(yáng)性細(xì)胞均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞因子水平OVA組、SEB+OVA組IL-4和IL-5濃度顯著高于PBS組、SEB組(P<0.05)；SEB+OVA組IL-5表達(dá)水平較OVA組顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表 1 小鼠NLF中IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-17A濃度比較

2.2鼻-鼻竇黏膜組織病理學(xué)改變

2.2.1 EOS浸潤(rùn)PBS組小鼠鼻-鼻竇黏膜上皮完整，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；SEB組小鼠鼻-鼻竇黏膜內(nèi)及黏膜下可見(jiàn)散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；OVA組小鼠鼻-鼻竇黏膜水腫增厚伴有EOS浸潤(rùn)；SEB+OVA組小鼠鼻-鼻竇黏膜組織中見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，尤以EOS及淋巴細(xì)胞最顯著。見(jiàn)圖1。OVA組EOS計(jì)數(shù)[(35.56±5.24)/HPF]顯著高于PBS組[(0.56±0.29)/HPF]、SEB組[(1.83±0.64)/HPF)](P<0.05)；SEB+OVA組EOS計(jì)數(shù)[(77.80±10.29)/HPF]顯著高于PBS組、SEB組及OVA組(P<0.05)。

a：PBS組； b：SEB組； c：OVA組； d：SEB+OVA組圖示SEB+OVA組見(jiàn)大量EOS浸潤(rùn)圖 1 鼻-鼻竇黏膜組織中EOS浸潤(rùn)(HE ×400)Figure 1 Eosinophilic infiltration were observed in the sinonasal mucosa(HE ×400)

2.2.2息肉樣病變PBS組、SEB組及OVA組鼻-鼻竇黏膜均未見(jiàn)息肉樣病變。SEB+OVA組每只小鼠鼻-鼻竇黏膜均可見(jiàn)息肉樣病變，個(gè)數(shù)1至4，共觀察到14個(gè)息肉樣病變；息肉樣病變的組織病理主要表現(xiàn)為黏膜腫脹隆起(細(xì)胞間隙水腫)伴EOS浸潤(rùn)，見(jiàn)圖2。SEB+OVA組息肉樣病變計(jì)數(shù)[(2.33±0.94)個(gè)/只]較其他組(0±0)明顯升高(P<0.05)。

圖示鼻-鼻竇黏膜腫脹隆起伴EOS浸潤(rùn)

2.3鼻-鼻竇黏膜組織中ECP表達(dá)免疫組化染色顯示，OVA組、SEB+OVA組鼻-鼻竇黏膜組織中均有較強(qiáng)表達(dá)ECP的陽(yáng)性信號(hào)，表達(dá)ECP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)[(16.53±4.82)/HPF、(34.60±7.25)/HPF)]顯著多于PBS組[(0.49±0.18)/HPF]、SEB組[(0.74±0.26)/HPF]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且SEB+OVA組表達(dá)ECP的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多于OVA組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

a：PBS組； b：SEB組； c：OVA組； d：SEB+OVA組

3 討 論

2011年，Kim等[4]首次報(bào)道使用低劑量的SEB在小鼠變應(yīng)性鼻-鼻竇炎基礎(chǔ)上成功誘導(dǎo)鼻息肉樣病變伴EOS浸潤(rùn)，與ECRS病理改變相似。之后該學(xué)者在該模型基礎(chǔ)上進(jìn)行拓展研究[5]。本實(shí)驗(yàn)參照Kim報(bào)道的方法，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的研究進(jìn)行適當(dāng)改變，即在OVA致敏的基礎(chǔ)上適當(dāng)增加鼻腔滴入SEB劑量，成功誘導(dǎo)ECRS，研究結(jié)果基本一致。

Th2反應(yīng)是ECRS重要免疫學(xué)特征。OVA組及SEB+OVA組Th2細(xì)胞因子(IL-4和IL-5)高表達(dá)，且SEB+OVA組IL-5表達(dá)水平較OVA組更高，表明OVA作為普通抗原可誘導(dǎo)鼻-鼻竇黏膜Th2型免疫反應(yīng)，OVA聯(lián)合SEB誘導(dǎo)Th2反應(yīng)更強(qiáng)烈。IL-5是促進(jìn)EOS在氣道黏膜粘附、募集和脫顆粒的關(guān)鍵細(xì)胞因子[6-7]。IL-5的高表達(dá)可能在OVA聯(lián)合SEB誘導(dǎo)ECRS過(guò)程中起重要作用。

ECRS主要病理特征：一是組織中大量EOS浸潤(rùn)；二是鼻腔和(或)鼻竇有息肉樣病變。SEB+OVA組小鼠鼻-鼻竇黏膜組織中有大量EOS浸潤(rùn)，且可見(jiàn)息肉樣病變，按照EPOS2020[8]提出的每HPF≥10個(gè)EOS作為ECRS診斷標(biāo)準(zhǔn)，EOS計(jì)數(shù)遠(yuǎn)多于此標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的計(jì)數(shù)。雖然OVA組也有明顯EOS浸潤(rùn)，但EOS計(jì)數(shù)明顯少于SEB+OVA組，且未見(jiàn)息肉樣病變，因此單純滴入OVA可誘導(dǎo)變應(yīng)性鼻-鼻竇炎，但炎癥的程度還不足以誘導(dǎo)息肉樣病變。小鼠鼻腔單純滴入SEB鼻-鼻竇黏膜組織形態(tài)學(xué)改變不顯著，具體原因值得探究。SEB作為超抗原在CRSwNP發(fā)生發(fā)展中的作用已得到證實(shí)。Braga等[9]單獨(dú)使用SEB可成功誘導(dǎo)兔ECRS。本研究前期結(jié)果也顯示，單獨(dú)向兔上頜竇腔注入高濃度SEB可誘導(dǎo)急性上頜竇炎[10]。本實(shí)驗(yàn)單獨(dú)使用SEB不能誘導(dǎo)鼻-鼻竇黏膜炎性改變的可能與誘導(dǎo)方式以及動(dòng)物種類不同有關(guān)。國(guó)外有學(xué)者通過(guò)小鼠哮喘模型研究發(fā)現(xiàn)，SEB增強(qiáng)氣道高反應(yīng)以及變應(yīng)性炎癥反應(yīng)需要在OVA致敏的小鼠體內(nèi)[11]。

ECP主要來(lái)源于活化的EOS脫顆粒。研究發(fā)現(xiàn)，鼻腔分泌物中ECP表達(dá)水平與EOS計(jì)數(shù)存在顯著相關(guān)性，鼻腔分泌物中ECP升高可能源于EOS脫顆粒水平上調(diào)[12-13]。本實(shí)驗(yàn)中，SEB+OVA組鼻-鼻竇黏膜組織中ECP表達(dá)水平顯著升高，可能與EOS大量表達(dá)有關(guān)。ECP可通過(guò)損傷鼻-鼻竇黏膜上皮細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞壞死脫落，且與多種細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子等相互作用，在鼻部慢性炎性疾病發(fā)展中起重要作用[14]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Kim等[4]研究結(jié)果比較，鼻-鼻竇黏膜組織病理學(xué)改變雖然相似，但本研究在誘導(dǎo)ECRS過(guò)程中使用的SEB劑量是10ng，而Kim使用的劑量是5ng。本實(shí)驗(yàn)選擇10ng的原因：①在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們按照SEB 5ng進(jìn)行誘導(dǎo)，小鼠鼻-鼻竇黏膜組織病理學(xué)觀察未見(jiàn)明顯息肉樣病變；②近幾年，有國(guó)外學(xué)者嘗試用SEB 10ng而非5ng來(lái)誘導(dǎo)ECRS進(jìn)行相關(guān)研究[15-16]。本研究使用SEB 5ng不能誘導(dǎo)小鼠鼻息肉樣病變的可能原因：① 小鼠鼻孔太小，SEB滴入過(guò)程中未能全部進(jìn)入小鼠鼻腔鼻竇；② 小鼠體位放置不當(dāng)，滴入的SEB很快從前鼻孔溢出或流至鼻咽部。上述因素導(dǎo)致SEB在鼻腔鼻竇停留時(shí)間太短，實(shí)際有效劑量不足。我們推測(cè)，如果每次5ng SEB全部進(jìn)入鼻腔鼻竇發(fā)揮作用，劑量可能足以誘導(dǎo)ECRS，通過(guò)后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。

OVA聯(lián)合SEB誘導(dǎo)小鼠ECRS，該模型在免疫學(xué)上呈現(xiàn)Th2型免疫反應(yīng)，在組織病理學(xué)上表現(xiàn)為嗜酸性炎癥反應(yīng)，與人類ECRS具有相似性。然而，該模型也有一些局限性[4-5]。首先，小鼠鼻腔鼻竇氣動(dòng)竇結(jié)構(gòu)空間相對(duì)較小，進(jìn)行影像學(xué)評(píng)估相對(duì)困難。第二，小鼠嗅區(qū)黏膜上皮占據(jù)鼻腔黏膜上皮大部分區(qū)域，與人類存在一定差異。第三，小鼠鼻息肉樣病變的外觀形態(tài)與人鼻息肉外觀形態(tài)差異明顯。最后，該模型是由抗原及細(xì)菌毒素驅(qū)動(dòng)的，所以它不能代表所有ECRS的誘導(dǎo)因素。所以，將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化并用于探索人類疾病也需慎重考慮，故對(duì)ECRS最佳動(dòng)物模型探索仍存在挑戰(zhàn)。