劉國芳，袁思雨，李嘉豪，張麗君，王國凱，方 玲

0 引 言

肝纖維化是由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生的病理過程，是一種可逆的創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)[1]。其特征是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過度生成與沉積，而活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)被認(rèn)為是產(chǎn)生ECM的主要效應(yīng)細(xì)胞[2-3]。因此，抑制 HSC 活化能有效緩解和減輕纖維化。課題組前期研究證實(shí)通過抑制血小板衍生生長因子-BB(platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)誘導(dǎo)的HSC活化，可降低細(xì)胞活力和減少ECM生成[4-5]。近來有研究顯示，肝纖維化過程中，細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)過度激活，而沉默或敲除SOCS1基因可抑制HSC細(xì)胞增殖，減少膠原沉積，從而緩解肝纖維化[6-8]。然而，目前臨床治療肝纖維化的藥物非常有限，尋找有效預(yù)防和治療的藥物迫在眉睫。漢黃芩苷(wogonoside)是從黃芩中分離提取的一種黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗血管生成等多種藥理作用[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖/d-半乳糖胺誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型中，腹腔注射漢黃芩苷后，血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和肝丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量均有所下降[11]。此外，在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化中，漢黃芩苷明顯改善了肝脂肪變性、膠原沉積和纖維化瘢痕面積。不僅如此，漢黃芩苷顯著抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-10[12]。提示漢黃芩苷具有一定的抗肝纖維化作用，但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。本研究建立小鼠肝纖維化模型，探討漢黃芩苷對(duì)肝損傷和纖維化的藥理作用，并采用PDGF-BB誘導(dǎo)HSC活化，進(jìn)一步探索漢黃芩苷對(duì)HSC活化和增殖作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和動(dòng)物大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；清潔級(jí)C57BL/6雄性小鼠(n=30)，體重18～22 g，購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK2019-0002。飼養(yǎng)溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，光照12 h/d，按清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。

1.1.2藥品與試劑漢黃芩苷購于成都瑞芬思生物科技有限公司，有效成分>98%；重組小鼠血小板衍生生長因子(PDGF-BB)購于英國PEPROTECH公司；ALT、AST和HYP檢測(cè)試劑盒購于江蘇南京建成生物工程研究所；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司； MTT和DMSO購于美國Sigma公司；PVDF膜和超高敏的化學(xué)發(fā)光底物購于美國 MilliProe公司；小鼠β-actin抗體購于英國PEPROTECH公司；SOCS1抗體購于成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司；α-SMA抗體購于上海復(fù)申生物科技有限公司；轉(zhuǎn)化生長因子β1R(Transforming growth factor，TGF-β1R)、血小板衍生生長因子-βR(platelet derived growth factor-βR，PDGF-βR)、fibronectin、COL1α1、CyclinD1和CDK4抗體購于美國Abcam公司；PCNA抗體購于武漢Elabscience公司；山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；SOCS1基因的干擾性siRNA序列和陰性對(duì)照(NC)購于上海阮拓生物技術(shù)公司；LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司。

1.1.3主要儀器MK3型酶標(biāo)儀(荷蘭雷勃公司)；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；細(xì)胞培養(yǎng)超凈工作臺(tái)(江蘇蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；XSZ型倒置顯微鏡(寧波永新光學(xué)股份有限公司)；水平離心機(jī)(美國Beckman公司)；公司電子分析天平(上海精天天平儀器廠)；超速離心機(jī)(美國Beckman公司)；共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；Western blot設(shè)備(美國Bio-rad 公司)。

1.2方法

1.2.1 HSC-T6細(xì)胞的培養(yǎng)采用含10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，細(xì)胞為貼壁生長，待細(xì)胞穩(wěn)定生長融合達(dá)到70%～80% 密度時(shí)用0.25% 胰酶消化液消化傳代或按濃度接種培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長期。

1.2.2肝纖維化模型的建立小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨后，將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，包括正常組、模型組和漢黃芩苷組(10、20和40 mg/kg)，每組6只。模型組和漢黃芩苷處理組均腹腔注射10% CCl4橄欖油溶液(10 mL/kg)，每周2次，連續(xù)8周，建立肝纖維化模型。同時(shí)，正常組腹腔注射相同劑量的橄欖油。自造模第4周起開始給藥，各給藥組分別給予相應(yīng)的藥物，持續(xù)4周。正常組和模型組每天給予相同劑量的等滲鹽水；至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每周稱重1次。最后一次給藥后，禁止飲食，但不限制飲水。24 h后，小鼠進(jìn)行稱重，眼球取血。處死后，取出肝，編號(hào)并拍照，將肝分為兩部分，其中一部分用4%多聚甲醛固定，然后進(jìn)行石蠟包埋；另一部分直接保存在-80 ℃的冰箱中。

1.2.3血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)小鼠眼球血4 ℃、離心半徑40 cm、3000 r/min離心15 min，取血清。檢測(cè)血清中AST、ALT和HYP含量。

1.2.4肝組織HE染色取小鼠肝組織塊，常規(guī)固定，包埋，切片，脫蠟水洗2 min后蘇木精染色5 min，1%鹽酸乙醇分色30 s，自來水浸泡 15 min，置伊紅液中 2 min，常規(guī)脫水，透明，封固。顯微鏡觀察并照相。采集所需圖像。

1.2.5肝組織免疫組化檢測(cè)切片脫蠟，置于枸櫞酸鈉緩沖液中(含0.05% Tween 20，PH=6.0)，在高壓鍋內(nèi)加壓直至煮沸后進(jìn)行抗原修復(fù)。切片滴加過氧化氫與甲醇的混合液封閉過氧化物酶，經(jīng)1% trition10-x破膜10 min，于室溫滴入山羊血清溶液封閉2 h，而后分別滴加一抗(α-SMA，1:100；COL1α1，1: 100；fibronectin，1:100)，將切片組織置濕盒中4 ℃過夜，次日室溫孵育二抗，DAB顯色，用蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯漂洗后封片。顯微鏡觀察并照相。采集所需圖像。

1.2.6MTT測(cè)定細(xì)胞增殖試驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以5×103的細(xì)胞密度接種到96孔培養(yǎng)板。分組如下：正常組、PDGF-BB組和漢黃芩苷組(5、10、20、40、60、80、160、320 μmol/L)。待細(xì)胞完全貼壁后，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培饑餓HSC-T6細(xì)胞12 h。隨后，漢黃芩苷處理組的細(xì)胞被替換成不同濃度的漢黃芩苷2 h后，除正常組外，其余各組再加入刺激因子PDGF-BB(10 ng/mL)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加20 μL 5 mg/mL MTT，避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，終止培養(yǎng)。5 mL注射器小心吸盡各孔液體，加入150 μL DMSO溶解細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶，室溫振蕩溶解10 min后，于490 nm 波長處測(cè)吸光度A值。實(shí)驗(yàn)篩選漢黃芩苷濃度為40、60和80 μmol/L用于后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)。

1.2.7Western blot檢測(cè)使用含PMSF的RIPA 細(xì)胞裂解液提取小鼠肝組織和HSC-T6細(xì)胞的總蛋白。BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度?？偟鞍淄ㄟ^SDS-PAGE電泳分離。電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫5%脫脂牛奶孵育2 h后，將膜與相應(yīng)的一抗稀釋液(β-actin，1∶1000；α-SMA，1∶500；COL1α1，1∶500；fibronectin，1∶500；PDGF-βR，1∶500；TGF-β1R，1∶500；CDK4，1∶1000；CyclinD1，1∶1000；PCNA，1∶1000；SOCS1，1∶500)在4 ℃下孵育過夜。第2天，用TBST洗滌后，二抗(1∶10000)孵育1 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，并通過ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.2.8qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)Trizol試劑提取細(xì)胞和肝組織總RNA，凝膠電泳判斷有無降解。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，通過Piko-real 96系統(tǒng)(95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán))和SYBR-Green擴(kuò)增cDNA。引物序列如下：β-actin正向: CCCATCTATGAGGGTTACGC，反向: TTTAATGTCACGCACGTTC； SOCS1正向: CCTTCGACTGCCTCTTCGAG，反向: AGTCACGGAGTACCGGGTTA； α-SMA正向: 5′-CAATGGCTCCGGGCTCTGTA-3′，反向: 5′-CTCTGCTCTGCGCTTCGTC-3′； COL1α1正向: 5′- ACCTCAGGGTATTGCTGAC-3′，反向: 5′-GACCAGGGGCCTCTTTCT-3′； Fibronectin 正向: 5′-ACCTTGACTGCCCAGTGGACAGCG-3′，反向: 5′-GCTCACTCTTCTGATTGTTCTTCAG-3′。

1.2.9免疫熒光檢測(cè)α-SMA和COL1α1的表達(dá)將正常組、PDGF-BB組、PDGF-BB +漢黃芩苷 40 μmol/L 組、PDGF-BB +漢黃芩苷60 μmol/L組、PDGF-BB +漢黃芩苷80 μmol/L組細(xì)胞用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次。免疫熒光阻斷液在37 ℃下孵育30 min。一抗α-SMA(1∶200)和COL1α1(1:200)4 ℃ 孵育過夜。然后將細(xì)胞與熒光二抗在室溫下孵育1 h，PBS清洗3次。共聚焦顯微鏡觀察各組熒光強(qiáng)度。

1.2.10SOCS1 siRNA轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞接種于6孔板，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、SOCS1 siRNA1組、SOCS1 siRNA2組、SOCS1 siRNA3組。取2個(gè)EP管，加入Opti-MEM培養(yǎng)基溶液。分別在兩管溶液中加入LipofectamineTM2000和siRNA SOCS1靜置5 min。然后將兩管溶液混勻，靜置20 min以便形成復(fù)合物，再加入到HSC-T6細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。之后，qRT-PCR和Western blot來確定基因敲除率。

2 結(jié) 果

2.1 漢黃芩苷減輕CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷與正常組相比，模型組小鼠體重增長緩慢(P<0.05)，肝重比增高(P<0.05)，而漢黃芩苷組較模型組體重增長較快(P<0.05)；40 mg/kg漢黃芩苷組肝重比明顯低于模型組(P<0.05)。見圖1。HE染色顯示，模型組小鼠肝小葉排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤，空泡增多；而漢黃芩苷高劑量組(40 mg/kg)中肝小葉排列較規(guī)則，炎性細(xì)胞以及空泡明顯減少。見圖2。與正常組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST和HYP水平增加(P<0.05)；漢黃芩苷組(P<0.05)，見表1。

a：小鼠每周體重變化(g)；b：小鼠肝重比

a：正常組；b：模型組；c-e：分別為10、20、40 mg/kg漢黃芩苷組

表 1 小鼠血清HYP、AST、ALT的水平

2.2漢黃芩苷緩解CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化免疫組化的結(jié)果顯示，模型組α-SMA、COL1α1和fibronectin在肝纖維化瘢痕周圍大量表達(dá)，在漢黃芩苷組(40 mg/kg)中表達(dá)顯著降低。見圖3。Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，漢黃芩苷組α-SMA、COL1α1和fibronectin蛋白顯著低于模型組(P<0.05)。見圖4。與此同時(shí)，漢黃芩苷組的纖維化細(xì)胞因子PDGF-βR和TGF-β1R蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見圖5。

2.3漢黃芩苷抑制 PDGF-BB誘導(dǎo)的HSC-T6 細(xì)胞增殖Western blot結(jié)果表明，相較于正常組，PDGF-BB組CDK4和CyclinD1的蛋白含量增高(P<0.05)；而與PDGF-BB組相比較，漢黃芩苷組CDK4的含量顯著降低(P<0.05)。PDGF-BB組的PCNA蛋白含量較正常組略有增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但與PDGF-BB組比較，漢黃芩苷組(80 μmol/L)PCNA的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見圖6。

圖 3 鏡下觀察各組小鼠免疫組化α-SMA、COL1α1和fibronectin表達(dá)(免疫組化染色 ×50)

1：正常組；2：模型組；3-5：分別為10、20、40 mg/kg漢黃芩苷組

1：正常組；2：模型組；3-5：分別為10、20、40 mg/kg漢黃芩苷組

2.4漢黃芩苷減少PDGF-BB誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞中ECM合成免疫熒光結(jié)果顯示，α-SMA和 COL1α1熒光強(qiáng)度在PDGF-BB組HSC-T6細(xì)胞中較強(qiáng)，而漢黃芩苷組熒光強(qiáng)度顯著降低。見圖7。Western blot結(jié)果同樣證實(shí)，與正常組相比，PDGF-BB組α-SMA、COL1α1和fibronectin蛋白含量明顯增高(P<0.05)。與模型組比較，漢黃芩苷(60 和80 μmol/L)組α-SMA、COL1α1和fibronectin的蛋白含量顯著下降(P<0.05)，見圖8。

1：正常組；2：PDGF-BB組；3：40 μmol/L漢黃芩苷組；4：60 μmol/L漢黃芩苷組；5：80 μmol/L漢黃芩苷組

a：α-SMA；b：COL1α1

1：正常組；2：PDGF-BB組；3-5：分別為40、60、80 μmol/L漢黃芩苷組

2.5漢黃芩苷增加纖維化肝組織和活化HSC-T6細(xì)胞中SOCS1表達(dá)與正常組相比，模型組小鼠肝組織中SOCS1基因和蛋白水平表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，漢黃芩苷給藥組可顯著升高SOCS1 基因以及蛋白水平表達(dá)(P<0.05)，見圖9。同樣，SOCS1在PDGF-BB誘導(dǎo)的活化的HSC-T6中高表達(dá)。較PDGF-BB組，漢黃芩苷顯著提高SOCS1基因以及蛋白水平(P<0.05)。見圖10。上述結(jié)果提示，SOCS1可能參與漢黃芩苷抗肝纖維化過程，并有待進(jìn)一步研究。

a：小鼠肝組織中SOCS1 mRNA水平；b：Western blot檢測(cè)小鼠肝組織中SOCS1蛋白水平

a：HSC-T6細(xì)胞中SOCS1 mRNA水平；b：Western blot檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞中SOCS1蛋白水平

2.6沉默SOCS1拮抗?jié)h黃芩苷的抗肝纖維化作用合成靶向SOCS1 siRNA 1、siRNA 2和siRNA 3，轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞48 h。qRT-PCR以及Western blot結(jié)果顯示siRNA 2和siRNA 3均能明顯下調(diào)SOCS1的基因和蛋白表達(dá)(P<0.05)，其中siRNA 2的靶向效率達(dá)到0.286，見圖11。相較于正常組，SOCS1蛋白含量在PDGF-BB組降低(P<0.05)。加入漢黃芩苷(60 μmol/L)后SOCS1蛋白含量明顯增加(P<0.05)。與漢黃芩苷組比較，SOCS1 siRNA 2組SOCS1蛋白水平降低(P<0.05)，見圖12。同時(shí)，與PDGF-BB組相比，漢黃芩苷組對(duì)α-SMA、COL1α1和fibronectin 基因水平有明顯抑制作用(P<0.05)。而加入SOCS1 siRNA 2后，α-SMA、COL1α1和fibronectin 基因水平升高(P<0.05)，見表2。

a：SOCS1 siRNA 1、siRNA 2和siRNA 3轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞后SOCS1 mRNA水平；b：Western blot檢測(cè)SOCS1 siRNA 1、siRNA 2和siRNA 3轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞后SOCS1蛋白水平

1：正常組；2：PDGF-BB組；3：漢黃芩苷組；5：SOCS1 siRNA 2組

表 2 各組促纖維化因子的轉(zhuǎn)錄水平比較

3 討 論

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展的共同病理特征，也是慢性肝病進(jìn)展的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。各種肝損傷因素刺激，氧化應(yīng)激、炎癥因子、細(xì)胞因子的相互作用等激活HSC，活化的HSC是肝纖維化過程中ECM的主要來源，也是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。肝臟受損時(shí)，HSC對(duì)多種細(xì)胞因子產(chǎn)生應(yīng)答，激活后的HSC形態(tài)類似于肌纖維母細(xì)胞，增殖活性和膠原合成能力明顯增加，表達(dá)大量α-SMA、COL1α1及fibronectin，增加ECM的合成和分泌，減少其降解，ECM合成和降解失衡，使過多的ECM在肝組織中沉積，形成纖維化。迄今，我們和其他實(shí)驗(yàn)室的研究均表明，抑制HSC活化，能有效降低ECM蓄積，進(jìn)而減輕纖維化[4-5, 13-14]。

隨著中醫(yī)藥事業(yè)的不斷發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)，多種中藥成分均可抑制HSC細(xì)胞的活化減輕肝纖維化[15-17]。漢黃芩苷是從傳統(tǒng)中藥黃芩中分離得到的一種具有生物活性的黃酮類化合物，已被證明可以緩解肝疾病，例如非酒精性脂肪肝、脂多糖/d-半乳糖胺誘導(dǎo)的急性肝損傷以及CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化[11-12, 18]。漢黃芩苷通過抗炎、穩(wěn)定MMPs/TIMPs平衡、減少HSC激活和ECM生成來發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。與先前的研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化中，漢黃芩苷顯著減輕了肝細(xì)胞變性、炎性細(xì)胞浸潤、纖維瘢痕和膠原沉積；且漢黃芩苷高劑量組(40 mg/kg)療效優(yōu)于漢黃芩苷低劑量組(10 mg/kg)和漢黃芩苷(20 mg/kg)中劑量組。在體外實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)漢黃芩苷劑量依賴性地抑制HSC的活力，且可抑制CyclinD1、CDK4、PCNA蛋白的表達(dá)，推測(cè)漢黃芩苷抑制了HSC的增殖，減少ECM的合成，從而減輕肝纖維化。

本研究中，漢黃芩苷不僅可減少纖維化小鼠肝組織中ECM表達(dá)，PDGF-βR和TGF-β1R蛋白水平也顯著降低。其中PDGF一種刺激結(jié)締組織等組織細(xì)胞增殖的肽類調(diào)節(jié)因子，具有促進(jìn)有絲分裂、分化、趨化和血管生成的作用[19]。作為重要的促纖維化生長因子和有絲分裂原，PDGF可激活細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路[20]。研究顯示PDGF誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞增殖，激活PI3K/Akt/mTOR和NF-κB信號(hào)通路，加重肝纖維化的發(fā)展[21]。此外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)抑制PDGF誘導(dǎo)人腎小球細(xì)胞活化，調(diào)節(jié)負(fù)反饋蛋白SOCS1的表達(dá)，可以間接抑制JAK/STAT通路，影響炎性信號(hào)的傳導(dǎo)，進(jìn)而更好地控制系膜增生性腎小球腎炎[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用PDGF刺激HSC-T6細(xì)胞，細(xì)胞過度增殖和膠原合成增加，該過程中SOCS1的基因和蛋白水平均顯著下降；而給予漢黃芩苷，SOCS1的表達(dá)逐漸升高。進(jìn)一步應(yīng)用siRNA沉默SOCS1，發(fā)現(xiàn)SOCS1水平的降低，從而抑制漢黃芩苷的抗肝纖維化作用。推測(cè)漢黃芩苷可能通過增加SOCS1水平，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

綜上所述，本研究表明，漢黃芩苷可減輕CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化以及抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞的活化，這一過程與上調(diào)SOCS1的表達(dá)有關(guān)。提示漢黃芩苷可能是治療肝纖維化的潛在藥物。然而，漢黃芩苷是否通過其他細(xì)胞因子或下游信號(hào)通路途徑減輕肝纖維化，尚需進(jìn)一步研究。