熊偉杰,王云濤,何 朗

肺癌是發(fā)病率和病死率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一，可分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，當(dāng)發(fā)生繼發(fā)性多器官轉(zhuǎn)移時(shí)，約75%處于疾病晚期[1]。既往文獻(xiàn)報(bào)道，肺癌5年生存率僅為5%～10%[2]。在分子水平上，肺癌由一系列遺傳和表觀遺傳學(xué)改變引起，這些改變使腫瘤抑制基因失活并激活癌基因[3]。了解肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制將有助于提高診斷、治療和預(yù)防水平。miRNA在包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和致癌在內(nèi)的各種生物學(xué)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[4]。相關(guān)研究表明，miR-199-3p抑制肝癌MHCC97H細(xì)胞的增殖、遷移[5]，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡[6]，抑制膀胱癌細(xì)胞增殖[7]。已有研究表明，miR-199a-3p能通過(guò)負(fù)調(diào)控CBX7抑制肺癌A549細(xì)胞的發(fā)展[8]。本研究旨在探究miR-199-3p靶向SOX5對(duì)肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)、侵襲能力及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響。

1 材料與方法

1.1試劑 RRPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和青-鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；人肺癌A549細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；miR-485-5p模擬物、SOX5過(guò)表達(dá)載體、SOX5空載體均購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司；BCA試劑盒購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司；Transwell購(gòu)自美國(guó)康寧公司；一抗Ki-67、PCNA、Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱用高糖RMPI 1640培養(yǎng)基(含10% FBS和1%青-鏈霉素)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，0.25%胰蛋白酶消化。

1.3熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)SOX5和miR-199-3p的結(jié)合位點(diǎn)，選用熒光素酶報(bào)告分析，構(gòu)建野生型(WT)和突變型(MUT)SOX5 3' UTR熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)熒光素酶相對(duì)活性。

1.4RT-PCR 收集轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞，按TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并建立20 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。以U6和GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt方法進(jìn)行定量計(jì)算。

1.5SOX5過(guò)表達(dá) 將A549細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(Control組)、pcDNA組和pcDNA-SOX5組。Control組不作處理，pcDNA組轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體，pcDNA-SOX5組轉(zhuǎn)染SOX5 pcDNA質(zhì)粒載體，通過(guò)RT-PCR和Western blot測(cè)定SOX5 mRNA水平和蛋白表達(dá)水平驗(yàn)證SOX5過(guò)表達(dá)是否成功。

1.6細(xì)胞分組 將細(xì)胞隨機(jī)分為Control組、miR-199-3p過(guò)表達(dá)組(mimic組)、SOX5過(guò)表達(dá)組(SOX5組)和mimic+SOX5組。Control組不做任何處理，mimic組轉(zhuǎn)染miR-199-3p mimic，SOX5組轉(zhuǎn)染SOX5 pcDNA載體，mimic+SOX5組同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-199-3p mimic和SOX5 pcDNA載體。

1.7克隆形成法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將A549細(xì)胞接種于6孔板(500個(gè)/孔)，按方法“1.6”分組，待出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)計(jì)算克隆形成率。

1.8流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取轉(zhuǎn)染后的各組A549細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)48 h后，室溫下加入5 μl Annexin V-FITC混勻，最后加入碘化丙啶(PI)10 μl避光孵育15 min，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.9Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況 于Transwell上室添加無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的人工基底膜，取轉(zhuǎn)染后的各組A549細(xì)胞，上室中加入100 μl細(xì)胞懸液，下室中加入600 μl含F(xiàn)BS的RMPI 1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后脫脂棉擦掉基質(zhì)膠和上室細(xì)胞，4%多聚甲醛溶液固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色。光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)并拍照，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野。

1.10EMT形態(tài)學(xué)觀察 取各組轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞接種于6孔板過(guò)夜培養(yǎng)，顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.11Western blot檢測(cè)Ki-67、PCNA、Bax、Bcl-2、Caspase-3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平 各組A549細(xì)胞裂解提取總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白含量。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，200 mA恒流電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。加入一抗Ki-67(1∶1 000)、PCNA(1∶1000)、Bax(1∶1000)、Bcl-2(1∶1000)、Caspase-3(1∶1000)、E-cadherin(1∶1000)、N-cadherin(1∶1000)和Vimentin(1∶1000)4 ℃下孵育過(guò)夜，TBST緩沖液清洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG(1∶10 000)，最后發(fā)光成像。ImageJ 軟件分析蛋白水平。

2 結(jié)果

2.1miR-199a-3p與SOX5靶向關(guān)系 與Control組比較，mimic組A549細(xì)胞miR-199a-3p mRNA水平升高，SOX5 mRNA水平降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。與SOX5 WT、SOX5 MUT、SOX5 MUT+mimic組比較，SOX5 WT+mimic組熒光素酶活性降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖1 RT-PCR檢測(cè)A549細(xì)胞miR-199a-3p及SOX5表達(dá)水平

圖2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-199a-3p與SOX5熒光素酶活性

2.2SOX5過(guò)表達(dá)對(duì)SOX5 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 與Control組比較，pcDNA-SOX5組A549細(xì)胞SOX5 mRNA和蛋白水平升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 SOX5過(guò)表達(dá)對(duì)SOX5 mRNA水平和蛋白表達(dá)水平的影響

2.3miR-199a-3p靶向SOX5對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 與Control組比較，mimic組A549細(xì)胞克隆形成率降低，SOX5組A549細(xì)胞克隆形成率升高(P<0.05)；與SOX5組比較，mimic+SOX5組A549細(xì)胞克隆形成率降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4。與Control組比較，mimic組A549細(xì)胞Ki-67、PCNA蛋白表達(dá)水平降低，SOX5組A549細(xì)胞Ki-67、PCNA蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與SOX5組比較，mimic+SOX5組A549細(xì)胞Ki-67、PCNA蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖4 miR-199a-3p靶向SOX5對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

圖5 miR-199a-3p靶向SOX5對(duì)A549細(xì)胞Ki-67、PCNA蛋白表達(dá)的影響

2.4miR-199a-3p靶向SOX5對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響 與Control組比，mimic組A549細(xì)胞凋亡率升高，SOX5組A549細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)；與SOX5組比，mimic+SOX5組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。見(jiàn)圖6。與Control組比，mimic組A549細(xì)胞Bax/Bcl-2比值和cleaved Caspase-3/Caspase-3比值升高，SOX5組A549細(xì)胞Bax/Bcl-2比值和cleaved Caspase-3/Caspase-3比值降低(P<0.05)；與SOX5組比，mimic+SOX5組A549細(xì)胞Bax/Bcl-2比值和cleaved Caspase-3/Caspase-3比值升高(P<0.05)。見(jiàn)圖7。

圖6 miR-199a-3p靶向SOX5對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

圖7 miR-199a-3p靶向SOX5對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5miR-199a-3p靶向SOX5對(duì)A549細(xì)胞侵襲的影響 與Control組比較，mimic組A549細(xì)胞侵襲數(shù)降低，SOX5組A549細(xì)胞侵襲數(shù)升高(P<0.05)。與SOX5組比較，mimic+SOX5組A549細(xì)胞侵襲數(shù)降低(P<0.05)。見(jiàn)圖8。

圖8 miR-199a-3p靶向SOX5對(duì)A549細(xì)胞侵襲的影響

2.6miR-199a-3p靶向SOX5對(duì)A549細(xì)胞EMT的影響 Control組A549細(xì)胞可見(jiàn)形態(tài)為連接松散的類(lèi)圓或紡錘體樣，黏附力低，細(xì)胞由上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，而mimic+SOX5組EMT形態(tài)變化少于SOX5組。提示miR-199a-3p過(guò)表達(dá)抑制上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。與Control組比較，mimic組A549細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)降低，而SOX5組A549細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)降低，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與SOX5組比較，mimic+SOX5組A549細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見(jiàn)圖9。

圖9 miR-199a-3p過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞EMT的影響

3 討論

肺癌在我國(guó)發(fā)病率和病死率極高[9-11]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，新的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)為肺癌的診斷和治療提供了新的方向。SOX5與淋巴瘤、乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。SOX5蛋白參與胚胎發(fā)育、神經(jīng)生長(zhǎng)、干細(xì)胞形成等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，是細(xì)胞分化的調(diào)控者[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向抑制SOX5具有降低A549細(xì)胞Ki-67、PCNA蛋白表達(dá)水平的作用。癌細(xì)胞的過(guò)度增殖是腫瘤發(fā)生與發(fā)展的重要因素之一。Ki-67和PCNA是與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞增殖，PCNA為DNA聚合酶輔助蛋白，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)[14]。Ki-67水平可反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)，其高表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[15]。張麗娟等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a-3p過(guò)表達(dá)可降低卵巢癌SK0V3細(xì)胞的增殖能力。提示miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向抑制SOX5可抑制A549細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-199a-3p靶向SOX5后，A549細(xì)胞Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3/Caspase-3上調(diào)。細(xì)胞凋亡屬于程序性細(xì)胞死亡，可通過(guò)消除舊的及受損細(xì)胞維持生物機(jī)體內(nèi)生理平衡，Caspase-3屬于凋亡蛋白，抑制Caspase-3蛋白活性可阻斷凋亡途徑起到抑制凋亡的作用[17]。Bax發(fā)揮促凋亡作用，Bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用，二者相互作用，可形成異源二聚體可調(diào)控細(xì)胞凋亡[18]。有研究報(bào)道，miR-199a-3p可通過(guò)抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤1誘導(dǎo)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡[19]。提示miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向抑制SOX5可促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-199a-3p靶向SOX5后，A549細(xì)胞侵襲能力降低。陶良俊[20]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-199a-3p可抑制腎癌細(xì)胞786-0的增殖、存活和侵襲。QU等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a-3p通過(guò)靶向Smad1抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。提示miR-199a-3p過(guò)表達(dá)靶向抑制SOX5可抑制A549細(xì)胞侵襲。

本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-199a-3p靶向SOX5后，A549細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)降低。EMT是發(fā)生在傷口愈合和癌變過(guò)程中的一種上皮細(xì)胞失去其分化表型獲得間質(zhì)細(xì)胞特征的生物學(xué)過(guò)程[22]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，E-cadherin下調(diào)，N-cadherin和Vimentin表達(dá)上調(diào)，可用于判斷EMT的發(fā)生[23]。提示過(guò)表達(dá)miR-199a-3p可靶向SOX5抑制A549細(xì)胞EMT。

綜上所述，miR-199a-3p表達(dá)升高可抑制肺癌A549細(xì)胞增殖、侵襲和EMT，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這可能是通過(guò)靶向抑制SOX5表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。以miR-199a-3p為靶點(diǎn)的干預(yù)治療有望成為抑制肺癌A549細(xì)胞侵襲和增殖的新方法。