王文習，楊 靜，周 娜，王 寧，未金煥，李云霞

芪及散為解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八〇醫(yī)院研發(fā)的非標準制劑，主要由黃芪、黨參、茯苓、當歸、木香、黃芩、甘草等十味藥組成，具有健胃止痛的功效，用于十二指腸球部潰瘍、胃潰瘍、十二指腸球炎[1]。該制劑為中藥飲片混合粉碎制成的散劑，在生產過程中，考慮到溫度對制劑成分的影響，常規(guī)的干熱滅菌法不能達到制劑的微生物限度要求，需要用到60Co-γ射線滅菌。近幾十年來，60Co-γ射線滅菌已在全世界廣泛進行，由于高穿透性、方便性、快速性、便宜的節(jié)能效益和理想的滅菌效果[2-3]，在中醫(yī)藥領域，60Co-γ射線滅菌的方法也得到廣泛利用，特別是在中國傳統(tǒng)藥物中，易揮發(fā)、熱敏感的中藥材及蜜丸的滅菌，使用尤其廣泛[4]。中藥的復雜化學成分在輻射期間可能受到影響，藥品的質量也有可能無法保證。CFDA 2015年頒布的《中藥輻照滅菌技術指導原則》建議對原料藥和最終產品盡可能采用低劑量輻照滅菌，中藥最大總體平均輻照劑量原則上不超過10 kGy，在本研究中對芪及散的2次輻照劑量均為8 kGy。隨著全球對中藥的需求穩(wěn)步增加，中藥質量標準尤為重要。中藥指紋圖譜是建立中藥材及其制劑質量標準行之有效的方法，可以用來測定其中某些成分的含量，也可以控制很多其他不便進行含量測定的成分[5-6]。在本研究中，我們在輻照前和輻照后建立了芪及散的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜，同時測定了輻照前和輻照后黃芩苷和漢黃芩苷的含量變化，研究了芪及散的輻照滅菌效應，探討應用60Co-γ射線滅菌對制劑質量的影響[7-9]。

1 儀器與試藥

1.1試驗儀器 安捷倫1100 HPLC儀(G1322型在線脫氣機、G1311A型二元泵、G1313A型自動進樣器、G1315B二極管陣列檢測器、A.08化學工作站，美國Agilent公司)，BT214D、BT125D型分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)，雷磁PHS-3C型酸度計(上海儀電科學儀器股份有限公司)，KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試驗藥品 乙腈為色譜純(天津市康科德科技有限公司)；磷酸為色譜純(Fisher Scientifico-phosphoric acid，85%)；乙醇為分析純；水為超純水。黃芩苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-201619，純度93.5%)；漢黃芩苷對照品(成都曼思特生物科技有限公司中國科學院成都生物研究所，批號：MUST-18111601，純度99.06%)；芪及散(批號：20190402，輻照2次，輻照劑量每次8 kGy)。

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫25 ℃；流速1 ml/min；檢測波長280 nm；以0.1%磷酸溶液為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫[10-20]，梯度程序為0～5 min，10% B；5～13 min，10%～15% B；13～20 min，15%～20% B；20～45 min，20%～45% B；45～55 min，45%～50% B；55～60 min，50%～10% B；信號采集時間為80 min，進樣量為10 μl。

2.2溶液制備

2.2.1對照品儲備液的制備：精密稱取黃芩苷和漢黃芩苷對照品適量，分別置于25 ml量瓶，加入適量70%乙醇振搖，超聲使溶解，放至室溫，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，制得單一成分對照品儲備液，黃芩苷的濃度為1.098 mg/ml，漢黃芩苷的濃度為0.6090 mg/ml。

2.2.2對照品溶液的制備：用移液管精密量取2種對照品儲備液各1 ml，置10 ml容量瓶中，再用70%乙醇稀釋至刻度，振搖均勻，得到黃芩苷和漢黃芩苷的混合對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備：精密稱量供試品約0.5 g，放入50 ml量瓶中，加入70%乙醇約40 ml，浸潤30 min后，超聲3次，每次3 min，超聲間隔10 min，放置室溫，加入70%乙醇混合稀釋至刻度，搖勻，定量濾紙過濾，收集濾液；精密量取2 ml放入10 ml量瓶中，再用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，得到供試品溶液。

2.2.4陰性樣品溶液的制備：按處方量制備沒有黃芩藥材的陰性樣品，陰性樣品按照“2.2.3”項下供試品溶液制備方法操作，得到不含黃芩的陰性樣品溶液。

2.3方法學考察

2.3.1專屬性試驗：取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液分別進樣，記錄色譜圖，結果顯示，陰性樣品溶液不干擾指紋圖譜的測定。見圖1。

圖1 芪及散中黃芩苷和漢黃芩苷專屬性試驗高效液相色譜圖

2.3.2線性與范圍：取各對照品儲備液逐級稀釋成系列濃度的混合對照品溶液，進行分析，記錄2種對照品的色譜峰面積，以各指標成分的濃度(X，μg/ml)為橫坐標，以色譜峰面積A為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，黃芩苷濃度范圍2.47～65.88 μg/ml,線性方程Y=38.827X+2.0885,R2=1;漢黃芩苷濃度范圍0.9135～24.36 μg/ml,線性方程Y=40.572X+2.4811,R2=1。結果表明3個指標成分在所測定的濃度范圍內線性關系較好。

2.3.3精密度試驗：取“2.2.2”項下的混合對照品溶液(成分的濃度分別是：黃芩苷21.96 μg/ml和漢黃芩苷6.09 μg/ml)，連續(xù)進樣6次，記錄2個成分的峰面積。黃芩苷、漢黃芩苷峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為0.5%、0.5%。結果表明，系統(tǒng)的精密度良好。

2.3.4重復性試驗：平行制備6份樣品溶液，進樣分析并記錄色譜圖。記錄樣品中黃芩苷和漢黃芩苷對應的峰面積，計算其含量，根據6次測定結果的RSD來研究該方法的重復性。2個指標成分黃芩苷和漢黃芩苷的RSD分別為2.5%和2.7%。結果表明，該方法具有良好的重復性。

2.3.5加樣回收率試驗：用電子分析天平精密稱定芪及散(輻照前)約0.25 g，稱量6份，分別置于50 ml量瓶中，每個量瓶中分別加入黃芩苷儲備液2 ml、漢黃芩苷儲備液0.7 ml，再加入適量70%乙醇，按“2.2.3”項中方法配制供試品溶液，分別加入進樣器測定，進行分析，記錄色譜圖。根據公式：回收率=(測得量-本底量)/加入量×100%計算黃芩苷和漢黃芩苷的回收率。結果表明，方法準確度良好。見表1。

表1 芪及散中黃芩苷和漢黃芩苷加樣回收率實驗結果(n=6)

2.3.6穩(wěn)定性試驗：取“2.2.3”項下的供試品溶液，于24 h內每4小時分析1次，記錄色譜圖。記錄2個成分峰面積，計算黃芩苷和漢黃芩苷的RSD值分別為1.4%、1.3%。結果表明，溶液在24 h內的穩(wěn)定性良好。

2.4供試品含量測定 精密稱取輻照前和輻照后的芪及散，按“2.2.3”項下方法操作，計算黃芩苷和漢黃芩苷的含量，其中黃芩苷輻照前為8.45 mg/g，一次輻照后為8.73 mg/g，二次輻照后為8.59 mg/g；漢黃芩苷輻照前為1.71 mg/g，一次輻照后為1.77 mg/g，二次輻照后為1.75 mg/g。結果顯示，輻照前后供試品的2個指標成分含量沒有明顯變化。

2.5相似度分析

2.5.1對照指紋圖譜的建立：精密稱取芪及散(輻照前)0.5 g，制備供試品溶液，進樣分析，記錄色譜圖，得到對照色譜圖。

2.5.2指紋圖譜的分析：2次輻照后的芪及散分別平行制備8份供試品溶液，注入進樣器分析，記錄色譜圖，測定供試品的指紋圖譜。

2.5.3相似度分析：以輻照前芪及散的色譜圖為參照圖譜，將2次輻照得到的色譜圖與輻照前的色譜圖比較。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》研究版(2004A)分析檢驗，計算相似度，供試品2次輻照前后色譜圖相似度均≥0.999，相似度結果顯示輻照前后供試品的含量并無明顯差異。結果見圖2、圖3。

圖2 芪及散第1次輻照后對照指紋圖譜與供試品指紋圖譜

圖3 芪及散第2次輻照后對照指紋圖譜與供試品指紋圖譜

3 討論

本研究應用HPLC測定，通過相似度分析，可以快速準確地識別黃芩苷和漢黃芩苷，用于建立芪及散的指紋圖譜，提供了芪及散的整體信息，進行了輻照前后成分種類和含量的詳細比較。芪及散的色譜指紋圖譜有7個共有峰，結果表明，輻照前后兩種指標成分黃芩苷和漢黃芩苷的含量幾乎沒有顯著差異，提取的芪及散成分的種類和含量也基本沒有變化，可以認為實驗中的輻照劑量對芪及散質量沒有影響，實際生產中可以采取輻照的方法，按照指導劑量進行輻照滅菌。

為了減少溫度對測定結果的影響，實驗采用柱溫25 ℃進行。實驗過程中對檢測波長進行考察，分別在210、225、267、280、316 nm共5個波長處進行研究比較，發(fā)現(xiàn)在280 nm波長處測得的色譜峰較多，分離效果最好，且黃芩苷和漢黃芩苷在此波長處有強紫外吸收，故檢查波長選擇280 nm。

實驗條件是梯度洗脫，以0.1%磷酸溶液作為流動相A和乙腈流動相B，在洗脫過程中兩種極性不同的溶劑以不同比例混合連續(xù)或者間歇的改變，流動相極性改變，可以改善樣品中不同組分的分離度，可以更好地分析待測成分。實驗過程中多次調節(jié)梯度洗脫的時間及兩種溶劑的比例，最終選出本實驗所用的條件，在此條件下，分離度更好。

實驗過程中還對提取溶劑進行考察，分別采用水、70%乙醇、無水乙醇和甲醇進行提取，之后進行色譜圖分析，用水和無水乙醇提取得到的色譜圖基線漂移，峰分離效果不好，采用70%乙醇和甲醇提取所得色譜圖基本重合，但是乙醇相對更安全、環(huán)保，所以采用70%乙醇提取供試品。