王瀟雄，江驍，申太鵬，姚玉唐，陸?zhàn)愂廊荩瑥埜?，李秀麗，諶佳琪，寇瑩，肖定瓊，趙檬，周星，楊童舒，程祝忠

610041 成都，四川省腫瘤醫(yī)院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院 放射腫瘤學(xué)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(王瀟雄、江驍、申太鵬、姚玉唐、陸?zhàn)?、陳世容、張歌、李秀麗、諶佳琪、寇瑩、肖定瓊、趙檬、楊童舒、程祝忠)；637000 四川 南充，川北醫(yī)學(xué)院 影像學(xué)院(周星)

乏氧是實(shí)體腫瘤組織中常見的現(xiàn)象。腫瘤具有無(wú)限增殖的特點(diǎn)，當(dāng)其增殖速度超過(guò)其血管生長(zhǎng)的速度，導(dǎo)致內(nèi)部血流減少，供氧能力減弱，局部組織的氧分壓降低，便形成了乏氧區(qū)域[1]。腫瘤細(xì)胞會(huì)通過(guò)改變自身內(nèi)源性基因的表達(dá)來(lái)適應(yīng)乏氧微環(huán)境，乏氧能夠誘導(dǎo)乏氧誘導(dǎo)因子-1α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)因子及相關(guān)細(xì)胞分裂周期蛋白的表達(dá)，從而降低射線和某些化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力，導(dǎo)致實(shí)體腫瘤的放療抵抗及化療耐藥[2-7]。較多臨床研究表明，腫瘤的乏氧程度與其預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[8-10]，腫瘤組織內(nèi)部存在的乏氧細(xì)胞成為腫瘤易復(fù)發(fā)、難治愈的重要原因[11-12]。探測(cè)腫瘤的乏氧部位及乏氧程度對(duì)于制訂最有效的放療、化療方案顯得尤為重要。

目前存在著多種直接或者間接測(cè)定組織氧水平的方法，例如氧電極測(cè)定、組織形態(tài)分析、乏氧標(biāo)志物檢測(cè)、彗星電泳等。但這些技術(shù)具有或大或小的創(chuàng)傷性，或者不能準(zhǔn)確實(shí)時(shí)地反應(yīng)腫瘤組織乏氧情況，在臨床應(yīng)用中存在一定的局限性[13-15]。近年來(lái)，隨著正電子及單光子放射性藥物的開發(fā)，人們?cè)谀[瘤等疾病診斷方面取得了一些新的進(jìn)展。在乏氧顯像方面，利用18F、99mTc、64Cu等核素標(biāo)記的乏氧顯像劑如18F-氟赤硝基咪唑(18F-fluoroerythronitroimidazole,18F-FETNIM)、18F-fluoromisonidazole(18F-FMISO)、99mTc-4,9-diaza-3,3,10,10-tetramethyldodecan-2,11-dione dioxime(99mTc-HL91)、64Cu-diacetyl-bis(N4-methylthiosemicarbazone)(64Cu-ATSM)進(jìn)行正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層掃描顯像(positron emission tomography,PET)或單光子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層掃描顯像可對(duì)活體內(nèi)的乏氧組織定性和定量檢測(cè)[16-19]，具有無(wú)創(chuàng)、可動(dòng)態(tài)、可重復(fù)等優(yōu)勢(shì)，是目前乏氧檢測(cè)研究的熱點(diǎn)。18F-FETNIM是一種具有較大潛力的乏氧顯像劑，其周圍組織代謝率、乏氧組織代謝率、脫氟率、脂/水溶性均適合于PET乏氧顯像[16,20]。18F標(biāo)記正電子藥物半衰期為109.8 min，需醫(yī)療機(jī)構(gòu)現(xiàn)制現(xiàn)用，其合成產(chǎn)率及合成時(shí)間很大程度影響其臨床研究及應(yīng)用，但目前國(guó)內(nèi)鮮有醫(yī)療機(jī)構(gòu)報(bào)道其詳細(xì)制備工藝及質(zhì)控方法。因此，本研究將詳細(xì)報(bào)道其優(yōu)化后的制備、分離純化及質(zhì)控方法，該內(nèi)容將有助于18F-FETNIM臨床推廣應(yīng)用，同時(shí)也為其他18F標(biāo)記正電子藥物的制備提供一些啟示和參考。

1 材料和方法

1.1 設(shè)備和材料

CFN-MPS-200合成系統(tǒng)及HM-10回旋加速器(日本住友株式會(huì))；YMC-PACK-ODS-AM C18柱(10 mm × 250 mm，日本YMC公司)；Jasco PU-2086 Plus半制備型高效液相色譜系統(tǒng)(high performance liquid chromatography,HPLC,日本Jasco公司)；WondaSil C18柱(4.6 mm × 250 mm)及LC-15C分析型HPLC(日本島津公司)；MINI-scan薄層色譜掃描儀(美國(guó)Bioscan公司)；CRC-25R型活度計(jì)(美國(guó)Capintec公司)。

1-(2′-硝基-1′-咪唑基)-2，3-O-異亞丙基-4-甲苯磺酰基丁烷(德國(guó)ABX公司)；穴醚222(K222)、碳酸鉀、乙腈、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、抗壞血酸(美國(guó)Sigma公司)；注射用水及生理鹽水(四川美大康佳樂藥業(yè)有限公司)；QMA陰離子交換柱(美國(guó)Waters公司)；薄層硅膠板(德國(guó)Macherey Nagel公司)；Millex-GS無(wú)菌過(guò)濾器(0.22 μm，美國(guó)Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.118F-FETNIM的合成路線 如圖1所示，前體1-(2′-硝基-1′-咪唑基)-2，3-O-異亞丙基-4-甲苯磺?；⊥榕c18F離子發(fā)生親核取代反應(yīng)，生成的中間體經(jīng)鹽酸水解后得到粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品溶液再經(jīng)氫氧化鈉中和、半制備型HPLC分離純化、旋蒸系統(tǒng)除溶劑后最終得到產(chǎn)品。

1.2.218F-FETNIM的合成過(guò)程 合成裝置如圖2所示，用10 MeV、60 μA的質(zhì)子束流連續(xù)轟擊填充有18O-H2O的液體靶 40 min，通過(guò)18O(p，n)18F核反應(yīng)得到18F離子。用氮?dú)庹龎簩в?8F離子的靶水收集到靶水收集瓶中。接著用氮?dú)庹龎菏拱兴占恐械陌兴ㄟ^(guò)QMA陰離子交換柱，使18F離子吸附于QMA陰離子交換柱上。用K2CO3/K222的混合溶液將QMA陰離子交換柱上的18F離子淋洗入反應(yīng)瓶中。將反應(yīng)瓶溫度升高至110 ℃，待將淋洗液完全蒸干后冷卻至室溫，再加入0.3 mL無(wú)水乙腈，110 ℃加熱至乙腈完全蒸干。加入1 mL含有2 mg 1-(2′-硝基-1′-咪唑基)-2，3-O-異亞丙基-4-甲苯磺?；⊥榈臒o(wú)水乙腈溶液至反應(yīng)瓶，在密閉的反應(yīng)瓶中105 ℃氟化5 min，然后將液體蒸干。加入0.9 mL濃度為2 M的HCl，在密閉反應(yīng)瓶中升溫至105 ℃水解5 min。加入0.8 mL 濃度為2 M的NaOH進(jìn)行中和后，再將反應(yīng)瓶中粗產(chǎn)品轉(zhuǎn)移至半制備HPLC系統(tǒng)的進(jìn)樣器中。

圖1 18F-FETNIM的合成路線

圖2 制備18F-FETNIM的合成裝置

1.2.318F-FETNIM的分離純化 將進(jìn)樣器中粗產(chǎn)品注入帶放射性檢測(cè)器的半制備型HPLC系統(tǒng)中。分離純化條件如下：流動(dòng)相為V(水)∶V(乙腈)∶V(乙醇)=500∶90∶10，流速為4.0 mL/min，紫外波長(zhǎng)為325 nm，色譜柱為YMC-PACK-ODS-AM C18柱(10 mm × 250 mm)。收集保留時(shí)間在5～7 min內(nèi)的放射組分(圖3)于旋蒸瓶中160 ℃蒸干(旋蒸瓶中提前加入0.1 mL 100 mg/mL的抗壞血酸)，用8 mL生理鹽水溶解產(chǎn)品并通過(guò)0.22 μm Millex GS無(wú)菌濾膜，得到最終的18F-FETNIM產(chǎn)品。

圖3 粗產(chǎn)品的分離純化圖譜

1.2.4 產(chǎn)品的質(zhì)量分析 觀察產(chǎn)品溶液的顏色及澄明度，活度計(jì)測(cè)量產(chǎn)品溶液的活度并計(jì)算放射性濃度，用精密pH試紙測(cè)定產(chǎn)品溶液的pH值。將產(chǎn)品及標(biāo)準(zhǔn)品19F-FETNIM注入帶放射性檢測(cè)器的分析型HPLC(WondaSil C18柱，4.6 mm× 250 mm)中分析保留時(shí)間、放射化學(xué)純度，條件如下：流動(dòng)相為V(水)∶V(乙腈)=95∶5，流速1 mL/min，紫外波長(zhǎng)254 nm，柱溫40℃。另外利用帶放射性檢測(cè)器的薄層色譜(thin layer chromatography,TLC)分析產(chǎn)品的放射化學(xué)純度及產(chǎn)品在4 h內(nèi)的穩(wěn)定性，展開劑為V(氯仿)∶V(甲醇)=70∶30，固定相為薄層硅膠板。

2 結(jié) 果

2.1 專利申請(qǐng)

采用此方法合成18F-FETNIM的合成裝置及系統(tǒng)已獲得實(shí)用新型專利授權(quán)，專利名稱為：一種用于合成18F-氟赤硝基咪唑的系統(tǒng)、一種用于合成18F-氟赤硝基咪唑的卡套，專利號(hào)為：ZL201821957828.6.、ZL201821942477.1.。

2.2 18F-FETNIM的合成及質(zhì)量分析

采用此方法的合成時(shí)間約為50 min，合成產(chǎn)率為24%～30%(衰減校正后，n=8)，18F-FETNIM放射性濃度>1.11×109GBq/mL，產(chǎn)品為無(wú)色透明溶液，pH值在7.0～7.5之間，分析型HPLC顯示產(chǎn)品的放射化學(xué)純度高于97%(圖4A)，產(chǎn)品與19F-FETNIM標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致(圖4A、B)，產(chǎn)品中除含有少量的抗壞血酸及其可能的氧化產(chǎn)物外，無(wú)其他化學(xué)雜質(zhì)(圖4C、D)。TLC顯示產(chǎn)品在上述條件下的比移值(Rf值)約為0.8，放射化學(xué)純度大于99%且在4 h內(nèi)穩(wěn)定(圖5)。以上各項(xiàng)質(zhì)控內(nèi)容已覆蓋正電子放射性藥品質(zhì)量控制中的快速質(zhì)量控制原則[21]。

圖4 產(chǎn)品的HPLC分析圖譜

圖5 產(chǎn)品的TLC圖譜

3 討 論

硝基咪唑類乏氧顯像劑在乏氧顯像劑大家族中具有重要地位，其可以通過(guò)彌散作用進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)并在胞內(nèi)黃嘌呤氧化酶作用下發(fā)生硝基的單電子還原，進(jìn)而產(chǎn)生自由基陰離子。在正常情況下，自由基陰離子能夠迅速被再氧化成原化合物擴(kuò)散到細(xì)胞外；而在乏氧狀況下，自由基陰離子將被進(jìn)一步還原并與細(xì)胞內(nèi)其他組分結(jié)合，從而滯留于細(xì)胞內(nèi)[22-24]。臨床上使用及研究較多的硝基咪唑類乏氧顯像劑主要包括18F-FMISO及18F-FETNIM。相較于18F-FETNIM來(lái)說(shuō)，18F-FMISO具有過(guò)高的脂溶性，其在正常組織中具有更多的攝取且洗脫較慢，注射后需要較長(zhǎng)時(shí)間才能達(dá)到理想的本底。Yang等[16]的研究表明，18F-FETNIM比18F-FMISO具有更高的親水性，在乳腺癌小鼠移植瘤模型中，18F-FETNIM注射4 h后的腫瘤/血液比(T/B)明顯高于18F-FMISO。趙偉等[25]發(fā)現(xiàn)在SPCA-1人肺腺癌裸鼠移植瘤模型中，18F-FETNIM在腎中代謝最高，而在脂肪和骨骼中代謝較低，腫瘤/非腫瘤(T/NT)比值較高且隨時(shí)間增加，腫瘤/血液攝取比(T/B)為1.69±0.37，腫瘤/肌肉攝取比(T/M)為1.57±0.47。Lehti?等[26]利用18F-FETNIM檢測(cè)頭頸腫瘤患者的乏氧情況，3小時(shí)的腫瘤/肌肉比(T/M)在1～4，優(yōu)于18F-FMISO。國(guó)內(nèi)外有較多研究討論了18F-FETNIM進(jìn)行乏氧顯像的價(jià)值，發(fā)現(xiàn)18F-FETNIM的周圍組織代謝率、乏氧組織代謝率、脫氟率、脂/水溶性均適合于PET乏氧顯像[27-29]，表明18F-FETNIM是一種具有較大潛力的乏氧顯像劑。

自Yang及Grierson分別報(bào)道了18F-FMISO及18F-FETNIM的合成路線[16,30]，國(guó)內(nèi)外有關(guān)乏氧顯像劑的研究主要集中于硝基咪唑類乏氧衍生物前體的開發(fā)，而對(duì)相關(guān)制備工藝的研究較少。本研究在Yang等[16]所報(bào)道合成路線的基礎(chǔ)上，利用優(yōu)化后制備工藝及CFN-MPS-200合成系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了18F-FETNIM的快速穩(wěn)定合成。眾所周知，在18F親核取代反應(yīng)過(guò)程中，即使微量水的引入也會(huì)導(dǎo)致氟化失敗，且該因素是導(dǎo)致此類正電子藥物合成失敗的重要原因。在對(duì)前體進(jìn)行18F氟化前，可以選擇向反應(yīng)瓶中直接加入前體，或加入一次或者多次無(wú)水乙腈除水。本課題組嘗試過(guò)向反應(yīng)瓶中直接加入前體，合成失敗率超過(guò)30%，大概率是因?yàn)榉磻?yīng)瓶及合成管線殘留有微量水的原因，而加入一次無(wú)水乙腈除水后則未出現(xiàn)合成失敗的情況。因此，本研究選擇在氟化前向反應(yīng)瓶中加入一次無(wú)水乙腈除水，保證了合成的穩(wěn)定性。同時(shí)本研究也對(duì)氟化時(shí)間及溫度進(jìn)行了對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)在105 ℃氟化5 min能夠達(dá)到24%～30%的合成產(chǎn)率，在此條件上，降低氟化溫度或時(shí)間則明顯降低合成產(chǎn)率，而增加氟化溫度或時(shí)間則合成產(chǎn)率無(wú)明顯改變。因此，本研究在18F氟化這一步選擇105 ℃氟化5 min，保證其在較短的時(shí)間內(nèi)能夠得到較高的合成產(chǎn)率。Yang等[16]所報(bào)道的合成產(chǎn)率在20%～30%，但其合成時(shí)間大約為70 min；Gr?nroos等[20]所報(bào)道的合成時(shí)間約為50 min，但其合成產(chǎn)率為13%～20%。本研究基于優(yōu)化后的制備工藝及CFN-MPS-200合成系統(tǒng)，合成時(shí)間約為50 min，產(chǎn)率在24%～30%之間，其合成時(shí)間更短，合成產(chǎn)率更高。18F標(biāo)記正電子藥物半衰期為109.8 min，需醫(yī)療機(jī)構(gòu)現(xiàn)制現(xiàn)用，縮短合成時(shí)間及提高合成產(chǎn)率能夠促進(jìn)其臨床研究及應(yīng)用。

在分離純化這一步我們采用半制備型HPLC對(duì)粗產(chǎn)品進(jìn)行分離純化。如圖4A所示，分離純化得到的產(chǎn)品具有較高的放射化學(xué)純度且在4 h內(nèi)穩(wěn)定。同時(shí)從圖4C及圖4D中的結(jié)果可以看到，除了產(chǎn)品中含有少量的抗壞血酸及其可能的氧化產(chǎn)物外，產(chǎn)品無(wú)其他化學(xué)雜質(zhì)。分離得到的產(chǎn)品被加入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中除去流動(dòng)相中溶劑再用生理鹽水溶解，其臨床應(yīng)用安全性得到了一定的保障。另外如圖4B所示，合成得到的產(chǎn)品與19F-FETNIM標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致，從色譜的角度確認(rèn)本方法合成得到的產(chǎn)品是18F-FETNIM。

綜上，本研究詳細(xì)報(bào)道了18F-FETNIM的制備、分離純化及質(zhì)控方法，其方法穩(wěn)定，所需合成時(shí)間短，產(chǎn)率高，且產(chǎn)品無(wú)溶劑，所得到的結(jié)果將促進(jìn)18F-FETNIM的臨床推廣應(yīng)用。同時(shí)一些其他18F標(biāo)記正電子藥物如18F-FMISO、18F-氟乙基酪氨酸(O-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tyrosine,18F-FET)、18F-氟代胸腺核苷(3’-deoxy-3’-18F-fluorothymidine,18F-FLT)的制備過(guò)程也大多包括氟化、水解、分離純化步驟[31-33]，其制備工藝與本文所報(bào)道18F-FETNIM的制備工藝類似。因此，本研究所報(bào)道的方法對(duì)其他18F標(biāo)記正電子藥物的制備具有一定的指導(dǎo)作用。

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