劉 宇， 于 航， 謝云飛， 楊方威， 姚衛(wèi)蓉

(江南大學(xué) 食品學(xué)院， 江蘇 無錫 214122)

蔬菜腐敗主要是由腐敗細(xì)菌定殖造成的，胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwiniacarotovora)是一種典型的革蘭氏陰性腐敗菌[1]，也是引起蔬菜變質(zhì)的主要細(xì)菌之一[2]。胡蘿卜軟腐歐氏桿菌造成食品腐敗變質(zhì)的主要原因是生物被膜的形成和其他毒力因子的分泌，如胞外多糖、胞外蛋白酶、纖溶酶等[3]，這些毒力因子主要受細(xì)菌群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)的細(xì)胞信號機制調(diào)控[4]。QS系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)特定靶點基因的表達，控制多種生理過程，是細(xì)菌引起的食品腐敗的主要因素。針對細(xì)菌的QS調(diào)控機制，人們開始尋找有效的QS抑制劑(quorum sensing inhibitors，QSI)[5]。

天然植物精油來源廣泛且安全、無毒，隨著植物精油提取技術(shù)的日漸成熟，越來越多植物精油被用于食品工業(yè)作為調(diào)味劑[6]和抗菌劑[7]。近年來，將精油成分應(yīng)用于QSI的相關(guān)研究也越來越多，如亞最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)的精油成分姜油酮具有顯著抑制銅綠假單胞菌QS的作用，在濃度較低的情況下即可有效降低其致病性因子的形成[8-9]；亞MIC濃度的精油成分百里酚也被證實能抑制熒光假單胞菌生物被膜的形成，以及細(xì)菌胞外多糖(extracellular polysaccharide，EPS)、海藻酸鈉等一些毒力因子的釋放[10]。與此同時，人們還發(fā)現(xiàn)，部分精油成分之間存在協(xié)同抑菌效果，如水楊酸與百里酚聯(lián)用時，對番茄枯萎病菌的生長有顯著的抑制作用，聯(lián)合作用時MIC明顯低于單獨使用[11]。目前，將具有協(xié)同效應(yīng)的精油成分組合應(yīng)用于抑制腐敗菌QS的研究仍屬探索階段，只有少量研究將精油成分與其他抗菌物質(zhì)同時作用于QS，如精油成分芳樟醇與脫氧核糖核酸酶I(可水解胞外DNA)聯(lián)用，能有效提高精油成分抑制副溶血弧菌生物被膜的活性[12]。因此如果能篩選出對腐敗菌QS現(xiàn)象具有協(xié)同抑制作用的精油成分組合，將意味著能進一步降低單體精油成分的使用量，并在較低的濃度下即可抑制腐敗菌的腐敗特性，從而達到延長食品貯藏期的目的，這將很大程度提高精油成分作為保鮮劑的安全性和降低精油使用成本。

己醛在食品工業(yè)中可作為食品增香劑，在前期的研究中已經(jīng)證明己醛能顯著抑制胡蘿卜軟腐歐氏桿菌的運動性、EPS的分泌和生物被膜的形成[13-14]。在實際使用時，因為己醛的氣味較為濃厚，將其用做保鮮劑可能會對食品風(fēng)味造成一定干擾，因此本研究擬基于胡蘿卜軟腐歐氏桿菌的MIC和分級抑菌濃度(fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC)指數(shù)，從9種精油成分中篩選出與己醛具有協(xié)同抑菌效應(yīng)的精油成分組合，將其組合應(yīng)用于抑制胡蘿卜軟腐歐氏桿菌的QS調(diào)控，并將能判別兩種物質(zhì)是否具有協(xié)同作用的金(正均)氏公式[15]用于判別群體感應(yīng)的協(xié)同抑制作用，以期科學(xué)地篩選出對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌既有協(xié)同抑菌作用又有協(xié)同抑制QS效應(yīng)的精油成分組合。本研究旨在為將精油作為食品工業(yè)抗菌劑的實際應(yīng)用中降低復(fù)配精油成分使用量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和材料

純度均大于95%的精油有效成分(己醛、香芹酮、香芹酚、檸檬醛、香葉醇、水楊酸、肉桂酸、百里酚、丁香酚和肉桂醛)，購于上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、氯化鈉、無水乙醇、甘油乙酸、乙酸鈉、卡那霉素、結(jié)晶紫和Tris- HCl緩沖液，均購于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無菌96孔微量培養(yǎng)板、無菌12孔微量培養(yǎng)板，購于美國Thermo Fisher Scientific公司；C6- HSL、Syto9染料和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液，購于Sigma Aldrich公司(美國密蘇里州圣路易斯)。實驗所用化學(xué)試劑均為分析純。細(xì)胞爬片購于無錫耐思生物科技有限公司。胡蘿卜軟腐歐氏桿菌購買于中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)。紫色桿菌CV026來自渤海大學(xué)勵建榮教授課題組，菌株在-80 ℃儲存在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%甘油營養(yǎng)肉湯中。紫色桿菌CV026在含20 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中生長，胡蘿卜軟腐歐氏桿菌通常在營養(yǎng)肉湯中生長，兩種菌株均在28 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)基的pH值為7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS- 3C型pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；DHG- 9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)烘箱，蘇州納美瑞電子科技有限公司；BSA224S型電子分析天平，德國Sartorius儀器公司；Sorvall ST16R型冷凍高速離心機，美國Thermo Fisher Scientific公司；SU8100型掃描電子顯微鏡，日本株式會社日立高新技術(shù)公司；LSM710型激光共聚焦顯微鏡，德國蔡司公司；UV- 1800型紫外可見光分光光度計，日本島津公司；BPC- 500F型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。GI54DW型立式自動壓力蒸汽滅菌器，廈門致微儀器有限公司；M5型酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司。

1.3 QS抑制實驗

1.3.1MICs的測定

按照參考文獻[16]，將胡蘿卜軟腐歐氏桿菌在28 ℃下的瓊脂平板上生長過夜，參照0.5號麥?zhǔn)媳葷峁軐⒐温涞募?xì)菌在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%的NaCl溶液中稀釋至106CFU/mL用于測定。使用96孔微量培養(yǎng)板進行MIC的測試。在每一孔中加入100 μL培養(yǎng)基后，分別取100 μL單體精油成分和復(fù)配精油成分加至第一孔中，隨后在培養(yǎng)基中進行連續(xù)2倍稀釋。將100 μL細(xì)菌接種物加入所有孔中，并將平板在28 ℃培養(yǎng)24 h后使用酶標(biāo)儀在OD600檢測細(xì)菌活性。每種精油成分做3個平行實驗，在同一塊板上做一組陰性對照實驗(以體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇為陰性對照)。最后的結(jié)果以FIC指數(shù)作為聯(lián)合抗菌試驗的判定依據(jù)。FIC的計算公式見式(1)。

(1)

當(dāng)FIC≤0.5，表示協(xié)同作用；0.52，表示拮抗作用。

1.3.2紫色桿菌素抑制率的測定

紫色桿菌素抑制實驗參照文獻[17]的方法。將菌株CV026過夜活化兩次后，按1%的體積分?jǐn)?shù)接種于含有質(zhì)量濃度為20 μg/mL的卡那霉素的新鮮LB肉湯中，振蕩培養(yǎng)24 h后取1 mL菌液與100 mL含有20 μg/mL C6- HSL(信號分子)的LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，倒平板，待凝固后使用無菌軟木塞鉆孔器在瓊脂中鉆孔(直徑4 mm)。將100 μL不同濃度的單體精油成分和復(fù)配精油成分分別加到瓊脂孔中，其中復(fù)配精油成分濃度為0.5 MIC，單體精油成分濃度為各復(fù)配體系中單體精油成分的濃度。以質(zhì)量濃度為50 μg/mL的呋喃酮C30[18](一種已知的QSI)為陽性對照，使用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇作為陰性對照。

根據(jù)參考文獻[19]，將菌株CV026過夜活化后，按體積分?jǐn)?shù)為1%接種于含有不同精油成分(0.5 MIC)的LB培養(yǎng)基中，并加入20 μg/mL C6- HSL，160 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。以50 μg/mL的呋喃酮C30為陽性對照，使用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇作為陰性對照。將來自每孔的1 mL培養(yǎng)物以13 000 r/min離心5 min沉淀紫色菌素。通過旋渦振蕩器使沉淀的紫色菌素完全溶解在0.5 mL的DMSO中。將混合物再次離心以除去細(xì)菌細(xì)胞，使用酶標(biāo)儀在OD585定量。菌株的紫色菌素抑制率計算公式見式(2)。

(2)

1.3.3游泳和群集運動抑制率的測定

游泳和群集運動實驗參照文獻[20]的方法。將各菌株復(fù)配精油成分與冷卻至40 ℃的游泳運動瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%)和群集運動的瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%)混勻，倒平板，使平板中復(fù)配精油成分的濃度為目的終劑量(0.5 MIC)。冷卻后，向平板中央接種5 μL過夜活化兩次的胡蘿卜軟腐歐氏桿菌菌液，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察測試菌的遷移情況。以體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液為陰性對照。菌株運動性抑制率計算公式見式(3)。

(3)

1.3.4胞外多糖抑制率的測定

按照參考文獻[21]的方法測定細(xì)菌產(chǎn)生的胞外多糖(EPS)。將過夜活化后的胡蘿卜軟腐歐氏桿菌分別與新鮮的LB培養(yǎng)液按1%的體積分?jǐn)?shù)混勻后，取5 mL分裝至無菌的6孔板中。在孔板中加入終劑量為0.5 MIC的精油成分，以體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液為陰性對照。培養(yǎng)后，將取3 mL培養(yǎng)液以5 000 r/min離心30 min。將經(jīng)過濾的上清液(0.22 μm)加入3倍體積的乙醇中，并在4 ℃下孵育過夜沉淀。在4 ℃下以5 000 r/min離心30 min收集沉淀中的EPS，并將沉淀溶解在1 mL去離子水中，并在-20 ℃下儲存直至進一步使用。EPS中的總碳水化合物含量通過使用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)的苯酚- 硫酸法來量化。

1.3.5生物被膜形成抑制率的測定

按照參考文獻[22]，將過夜活化后的胡蘿卜軟腐歐氏桿菌分別與新鮮的LB培養(yǎng)液按1%混勻，取2 mL分裝至無菌的12孔板中。在孔板中加入終劑量為0.5 MIC的精油成分，以體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液為陰性對照，28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測定其菌液密度后，棄去培養(yǎng)液。用雙蒸水仔細(xì)沖洗孔以除去松散附著的細(xì)胞，無菌風(fēng)干燥固定30 min，隨后加入300 μL 0.2%結(jié)晶紫溶液染色壁上黏附的細(xì)胞15 min(室溫下)，用沖洗去除多余的染色劑，最后用1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33%的冰醋酸溶液洗脫，使用酶標(biāo)儀(Biotek)在OD595測量強度，以定量生物被膜形成量。生物被膜形成抑制率計算公式見式(4)。

(4)

1.3.6生物被膜觀察

按照參考文獻[23]的方法，用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscop, CLSM)和掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)對細(xì)菌生物被膜進行觀察。將1%的過夜培養(yǎng)物與終濃度為0.5 MIC的精油成分一起加入含有直徑18 mm的細(xì)胞爬片的新鮮培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h。以體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液為陰性對照。

1) CLSM分析。將細(xì)胞爬片上的浮游細(xì)胞用PBS漂洗除去后用25 μmol/L的Syto9染色，室溫下避光染色15 min，用PBS沖洗后吸干，隨后通過CLSM觀察染色的生物被膜，并利用COMSTAT 2程序?qū)ι锉荒さ娜S結(jié)構(gòu)(生物量、平均厚度、表面積與體積比)進行量化。

2) SEM分析。將細(xì)胞爬片上浮游細(xì)胞用PBS漂洗除去，放入經(jīng)4 ℃預(yù)冷過的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液中浸泡4 h，取出后，用梯度濃度的乙醇脫水，自然干燥后噴金處理，用SEM觀察生物被膜。

1.4 精油成分聯(lián)合效應(yīng)的計算

通過金式Q值法[15]，判別精油成分的聯(lián)合作用是否具有協(xié)同效應(yīng)，計算方法如式(5)。

(5)

式(5)中，EA、EB為單獨作用效果，EA+B為A和B聯(lián)用聯(lián)合作用效果，其中A、B單獨使用的濃度等于聯(lián)用時A和B各自的濃度。Q<0.85為拮抗作用，0.85≤Q<1.15為相加作用，Q≥1.15為協(xié)同作用。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)以3次平行實驗測定數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示。使用SPSS軟件進行方差分析，使用Tukey檢驗進行95%顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 精油成分的最小抑菌濃度分析

表1顯示了己醛聯(lián)合其他9種精油成分(香芹酮、香芹酚、檸檬醛、香葉醇、水楊酸、肉桂醛、百里酚、丁香酚和肉桂酸)對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌的MIC，復(fù)配成分中兩種精油成分的質(zhì)量濃度比為1∶1。己醛和百里酚聯(lián)合作用時的MIC值最小，均只有0.08 mg/mL。根據(jù)精油成分單獨作用和聯(lián)合作用的MIC得到了FIC指數(shù)，發(fā)現(xiàn)己醛分別與丁香酚、香葉醇、百里酚和肉桂酸這4種成分組合對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌的生長存在協(xié)同抑制作用(FIC≤0.5)，其他的組合則是相加和無關(guān)作用。具有協(xié)同抑制作用的精油成分的MIC，復(fù)配使用時可以明顯降低有效濃度(降低4～8倍)，如己醛和香葉醇聯(lián)合作用的MIC對應(yīng)的己醛濃度只有單獨作用時的1/4，而其中香葉醇的使用濃度更是其單體MIC的1/8(表1)。

目前未見研究表明協(xié)同抑菌作用與協(xié)同抑制群體感應(yīng)具有相關(guān)性，本研究將進一步探索具有協(xié)同抑菌作用的復(fù)配組合是否具有抑制QS活性。因此選取4組濃度為0.5MIC具有協(xié)同抑菌效應(yīng)的精油成分組合(己醛和香葉醇、己醛和百里酚、己醛和丁香酚、己醛和肉桂酸)用于后續(xù)CV026的QS抑制實驗，篩選與己醛具有協(xié)同抑制群體感應(yīng)的復(fù)配組合。

表1 精油成分單獨和聯(lián)合MIC及協(xié)同抑菌效應(yīng)組合的篩選Tab.1 Individual and combined MIC of essential oil components and screening of synergistic antibacterial effect combination

2.2 精油成分對CV026產(chǎn)紫色菌素的群體感應(yīng)抑制作用

細(xì)菌模型紫色桿菌CV026被廣泛應(yīng)用于QSI的篩選中[24]。本研究通過CV026產(chǎn)紫色菌素的抑制率來評價各單體精油成分以及組合精油成分的QSI活性(見圖1)。由圖1可知，表1中具有協(xié)同抑菌效應(yīng)的4組濃度為0.5MIC的精油成分組合及其單體成分(己醛、香葉醇、百里酚、丁香酚和肉桂酸)均與陽性對照C30一樣存在明顯的紫色菌素抑制帶，而含50%乙醇的陰性對照組周圍則沒有抑制帶，說明這4種精油成分組合都具有QSI活性。紫色菌素的定量實驗也進一步驗證了4種精油成分組合及其單體成分都可以顯著抑制紫色桿菌素的產(chǎn)生(P<0.05)。根據(jù)Q值的大小判斷(Q>1.15為協(xié)同作用)，只有己醛和香葉醇對紫色桿菌素的產(chǎn)生具有協(xié)同抑制效應(yīng)，抑制率為52.91%，也要高于其他3組復(fù)配精油成分，此時己醛和香葉醇的有效濃度僅為其單體MIC的1/8和1/16。在其他QSI研究中，肉桂醛質(zhì)量濃度為0.105 mg/mL時，對紫色桿菌素產(chǎn)生的抑制率為51.03%[25]，檸檬醛質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL時的抑制率為50%[26]，而本研究采用的0.5MIC的己醛和香葉醇的復(fù)配精油成分中己醛和香葉醇的實際使用質(zhì)量濃度僅為0.08 mg/mL。當(dāng)0.08 mg/mL的己醛和香葉醇單獨使用時抑制率分別只有22.13%和27.45%，但是當(dāng)兩者聯(lián)合使用時就可與這些物質(zhì)的作用效果接近，這說明己醛聯(lián)合香葉醇也具有較好的群體感應(yīng)抑制效果并具有協(xié)同效應(yīng)。

圖(a)中1～3分別為0.08 mg/mL的己醛、香葉醇和己醛+香葉醇，4～6分別為0.04 mg/mL的己醛、百里酚和己醛+百里酚，7～9分別為0.08 mg/mL的己醛、丁香酚和己醛+丁香酚，10～12分別為0.08 mg/mL的己醛、肉桂酸和己醛+肉桂酸。圖(a)中不同小寫字母表明組間具有顯著性差異(P<0.05)。圖1 精油成分對CV026產(chǎn)紫色菌素的抑制作用和 聯(lián)合抑制效果Fig.1 Inhibitory effect and combined inhibitory effect of essential oil components on violacein production of CV026

2.3 精油成分對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌游泳和群集運動的抑制作用

細(xì)菌的游泳和群集運動是細(xì)菌在接觸表面遷移的兩種形式，也是由胡蘿卜軟腐歐氏桿菌QS系統(tǒng)介導(dǎo)所展現(xiàn)的一種重要的毒力因子，在細(xì)菌定植時附著于接觸面表面和形成生物被膜的過程中發(fā)揮著重要作用[20]。為了解己醛和香葉醇對生物被膜的破壞作用，先研究了不同組合的精油成分對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌游泳和群集運動能力的影響，實驗結(jié)果見圖2。圖2(a)和圖2(b)表明，所有0.5MIC濃度的精油成分組合對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌和的游泳、群集都具有顯著的抑制作用(P<0.05)，其中己醛聯(lián)合香葉醇對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌游泳和群集運動的抑制率最高，分別為58.19%和51.49%。由圖2(c)可見，己醛和其他精油成分的聯(lián)合使用相比單獨使用對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌運動性具有更強的抑制效果，同時相比前期的研究結(jié)果[14]，己醛單獨作用游泳和群集運動的抑制率接近60%時需要0.1 mg/mL的，而0.5 MIC的己醛聯(lián)合香葉醇中己醛的濃度只有0.078 mg/mL，有效地降低了己醛的使用濃度。如圖2(d)所示，根據(jù)Q值的大小判斷，4組復(fù)配精油成分中對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌游泳運動的抑制作用均沒有協(xié)同效應(yīng)，而對群集運動的抑制作用則有己醛聯(lián)合香葉醇呈協(xié)同效應(yīng)，胡蘿卜軟腐歐氏桿菌可能與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)類似，游泳運動和群集運動分別受不同操縱子調(diào)控[27]。這些結(jié)果表明，通過精油成分的復(fù)配可以有效降低精油成分的使用濃度的同時，對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌運動性具有相同或者更好的抑制效果。

1～12各精油成分濃度參照圖1。圖(a)和圖(b)中不同小寫字母表明組間具有顯著性差異(P<0.05)。圖2 精油成分對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌游泳和群集運動的抑制作用和聯(lián)合抑制效果Fig.2 Inhibitory effect and combined inhibitory effect of essential oil components on swimming and swarming movement of Erwinia carotovora

2.4 精油成分對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌EPS分泌的抑制作用

1～12各精油成分濃度參照圖1。圖(a)中不同小寫字母表明組間具有顯著性差異(P<0.05)。圖3 精油成分對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌EPS分泌的抑制作用和聯(lián)合抑制效果Fig.3 Inhibitory effect and combined inhibitory effect of essential oil components on extracellular polysaccharide secretion of Erwinia carotovora

胞外多糖(EPS)是生物被膜基質(zhì)的重要組成成分，在生物被膜形成初期,浮游細(xì)菌會分泌具有黏彈性的胞外多糖基質(zhì)，增強細(xì)菌附著在物體表面的能力，從而加快生物被膜的形成[28]。為考察各精油成分對EPS分泌的抑制作用，實驗結(jié)果如圖3。由3(a)可知，在不同精油成分的作用下培養(yǎng)24 h后，胡蘿卜軟腐歐氏桿菌EPS的分泌受到顯著的抑制作用(P<0.05)。己醛聯(lián)合香葉醇對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌EPS分泌的抑制率高達65.03%時，己醛和香葉醇的濃度均僅為0.08 mg/mL，相比前期的研究[14]，0.1 mg/mL的己醛抑制率只有54.52%。除此之外己醛聯(lián)合百里酚、丁香酚、肉桂酸的抑制效果也較為不錯，分別為53.15%、59.19%和52.55%。由圖3(b)可知，根據(jù)Q值的大小判斷，4組復(fù)配精油成分中己醛聯(lián)合香葉醇、丁香酚對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌EPS的分泌具有協(xié)同抑制作用，而己醛聯(lián)合百里酚、肉桂酸則是相加作用，這可能與精油成分作用于QS系統(tǒng)中的各自位點不同而產(chǎn)生不同的效應(yīng)有關(guān)，如精油成分姜油酮作用于AHL 合成酶影響其活性[29]，精油成分肉桂醛則作用于LuxR受體蛋白，影響AHLs- LuxR復(fù)合物的形成[25]。

2.5 精油成分對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌生物被膜形成的抑制作用

細(xì)菌生物被膜是微生物的結(jié)合體，其中細(xì)胞通過鞭毛和分泌的多糖基質(zhì)相互黏附并附著在接觸表面上(圖4)。由圖4(a)可知，通過結(jié)晶紫實驗結(jié)果顯示不同精油成分的作用下，培養(yǎng)24 h后胡蘿卜軟腐歐氏桿菌EPS的分泌受到顯著的抑制作用(P<0.05)。己醛聯(lián)合香葉醇(質(zhì)量濃度均為0.08 mg/mL)對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌生物被膜形成的抑制率高達69.84%時，己醛聯(lián)合百里酚、丁香酚、肉桂酸也有較好的抑制作用，聯(lián)合作用的抑制效果均要高于精油成分單獨作用的抑制效果，但是只有己醛聯(lián)合香葉醇、百里酚時才有協(xié)同抑制作用[圖4(b)]，與抑制EPS協(xié)同效應(yīng)類似，這可能和精油成分作用的位點不同而產(chǎn)生不同的效應(yīng)有關(guān)。有研究報道[12]，精油成分芳樟醇與DNasesI聯(lián)用時對副溶血弧菌生物被膜的抑制率為63%，并成功將其應(yīng)用于海產(chǎn)品的保鮮，與其相比，本研究中的己醛聯(lián)合香葉醇在質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL時就對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌的生物被膜有較好的抑制效果。

細(xì)菌的運動性、胞外多糖的分泌和生物被膜的形成密不可分，浮游細(xì)菌通過鞭毛的運動和胞外多糖的黏附性附著在接觸物體的表面[30]，而本研究中各精油成分組合對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌的運動性分別有不同程度的抑制作用，特別是己醛聯(lián)合香葉醇對群集運動和EPS均有協(xié)同抑制作用，這也在一定程度上促成了對生物被膜的形成也具有的協(xié)同抑制作用。生物被膜的形成是受QS調(diào)控，成熟的生物被膜形成之后，可有效延緩抗生素的滲透，從而使病原體對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性[28]。本研究中的精油成分作為天然提取QSI，可有效抑制腐敗菌的QS并防止其產(chǎn)生耐藥性，特別是經(jīng)復(fù)配后得到協(xié)同作用的精油成分具有更安全、高效且低成本的優(yōu)點，能被開發(fā)成新型植物源保鮮劑。

1～12各精油成分濃度參照圖1。圖(a)中不同小寫字母表明組間具有顯著性差異(P<0.05)。圖4 精油成分對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌生物被膜形成的抑制作用和聯(lián)合抑制效果Fig.4 Inhibitory effect and combined inhibitory effect of essential oil components on biofilm formation of Erwinia carotovora

2.6 精油成分處理過后的生物被膜結(jié)構(gòu)分析

本研究表明，4種具有協(xié)同抑制胡蘿卜軟腐歐氏桿菌生長的精油成分組合中，只有0.5 MIC的己醛和香葉醇的復(fù)配精油成分對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌的生物被膜有較好的抑制作用。通過SEM和CLSM觀察己醛和香葉醇的復(fù)配精油成分處理過的生物被膜，進一步確認(rèn)該組合精油成分對生物被膜的協(xié)同抑制作用，實驗結(jié)果見圖5。由圖5可知，通過SEM觀察胡蘿卜軟腐歐氏桿菌的生物被膜發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜軟腐歐氏桿菌不經(jīng)任何處理能夠形成強黏附性的生物被膜，且含有較多的細(xì)胞外基質(zhì)和附著細(xì)菌。相比之下，在經(jīng)過己醛和香葉醇處理后可以清晰地觀察到生物被膜的完整性被破壞，表面的附著細(xì)菌也隨精油成分的作用減少，也明顯能看出己醛和香葉醇聯(lián)合作用時比單獨作用破壞效果要更好。CLSM分析可進一步看出，己醛聯(lián)合香葉醇對生物被膜的破壞作用，未經(jīng)處理的生物被膜結(jié)構(gòu)保持緊密，而經(jīng)處理的樣品則出現(xiàn)解體。COMSTAT2分析結(jié)果見表2。由表2可知，經(jīng)己醛和香葉醇處理后胡蘿卜軟腐歐氏桿菌生物被膜生物量、平均厚度、表面積與體積比都逐漸下降，并表現(xiàn)出顯著的差異性(P<0.05)，且己醛和香葉醇聯(lián)合使用時生物量、平均厚度、表面積與體積比下降的要更多，這也說明己醛和香葉醇聯(lián)用時對生物被膜的抑制效果更好。顯微鏡觀察的結(jié)果與前期結(jié)晶紫分析生物被膜的結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

本研究從精油成分之間協(xié)同抑制細(xì)菌的群體感應(yīng)角度出發(fā)，在降低精油使用量的同時還能有效抑制致腐菌的腐敗特性。先通過MIC和FIC指數(shù)的分析，篩選出4種具有協(xié)同抑菌的精油成分組合(己醛和香葉醇、己醛和百里酚、己醛和丁香酚、己醛和肉桂酸)。通過紫色桿菌CV026實驗證明4種精油組合及其單體均有群體感應(yīng)抑制作用，同時只有己醛聯(lián)合香葉醇組合對CV026紫色菌素的產(chǎn)生具有協(xié)同抑制作用且是4組精油成分組合中抑制效果最好的。隨后將4種精油成分組合應(yīng)用于腐敗菌胡蘿卜軟腐歐氏桿菌群體感應(yīng)現(xiàn)象的抑制作用研究，結(jié)果表明4個精油成分組合對群體感應(yīng)均有抑制作用，但只有己醛和香葉醇對細(xì)菌的運動性、胞外多糖分泌和生物被膜形成具有協(xié)同抑制作用，這也進一步驗證了CV026紫色菌素抑制實驗的結(jié)果。己醛聯(lián)合香葉醇對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌QS系統(tǒng)的具體協(xié)同抑制機理還未明晰，需要進一步研究相應(yīng)的信號分子合成、相應(yīng)的受體蛋白以及有關(guān)調(diào)控基因等。后續(xù)也將進一步研究精油成分組合在蔬菜防腐中的應(yīng)用，同時也會對所應(yīng)用蔬菜產(chǎn)品進行詳述的感官評價。

SEM和CLSM的放大倍數(shù)均為3 000倍。圖5 己醛、香葉醇單獨和聯(lián)合使用對胡蘿卜軟腐歐氏桿菌生物被膜形成的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of hexanal and geraniol alone or in combination on formation of biofilm of Erwinia carotovora

表2 Comstat 2分析經(jīng)己醛、香葉醇單獨和聯(lián)合作用后的胡蘿卜軟腐歐氏桿菌生物被膜

本研究表明，精油成分之間的協(xié)同群體感應(yīng)抑制作用可以有效地解決實際應(yīng)用中精油等高濃度天然提取物的高成本問題，實現(xiàn)在較低的濃度下就能有效抑制腐敗菌的腐敗特性，因此可將篩選出來的己醛和香葉醇組合應(yīng)用于食品保鮮劑，通過抑制生物被膜的形成來延長食品的保藏期。