羅 應(yīng)，彭美琪，肖正泮，羅承慧，王大勇，裴業(yè)春*

(1.海南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，海口570228；2.海南大學(xué)全健康研究院，?？?570228)

螨類變應(yīng)原在過敏性疾病中扮演了重要的角色[1]。熱帶無爪螨(Blomiatropicalis，Bt)也稱熱帶螨，屬于無爪螨屬[2]，是塵螨中最主要的螨種之一，尤其是在熱帶以及亞熱帶地區(qū)，熱帶螨是熱帶地區(qū)最為常見的優(yōu)勢螨種[3]，熱帶地區(qū)的家居環(huán)境中普遍發(fā)現(xiàn)分布有熱帶螨或其變應(yīng)原。塵螨能夠引起強(qiáng)烈的過敏反應(yīng)，包括過敏性皮炎、過敏性鼻炎、過敏性哮喘等[4]。塵螨不僅是人類的變應(yīng)原，同樣也是動物(尤其是寵物)的重要變應(yīng)原，在人類和犬類過敏性皮炎相關(guān)的眾多環(huán)境變應(yīng)原中，塵螨變應(yīng)原是最常見的變應(yīng)原之一[5]。例如，有研究表明過敏的犬類對粉塵螨提取物的特異性檢測呈陽性[6]，而熱帶螨同樣可以誘導(dǎo)動物產(chǎn)生過敏反應(yīng)，如通過皮試試驗(yàn)證實(shí)，過敏犬皮試陽性的致敏原中最主要的是熱帶螨[7]。通過比較兩類犬，第一類是非食物引起的特應(yīng)性皮炎(non-food-induced atopic dermatitis，NFIAD)的犬，第二類是食物誘發(fā)的特應(yīng)性皮炎(food-induced atopic dermatitis，F(xiàn)IAD)的犬，研究發(fā)現(xiàn)第一類犬對屋塵螨提取物的皮內(nèi)試驗(yàn)反應(yīng)更強(qiáng)烈，這可能是由于屋塵螨蛋白酶抗原、或其主要變應(yīng)原Der p 1、蛋白酶活動相關(guān)的表皮皮膚屏障缺陷而發(fā)生共同致敏[8]。研究人員使用皮內(nèi)試驗(yàn)和免疫斑點(diǎn)法檢測16只過敏性犬對螨的粗提變應(yīng)原的反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)這16只過敏性犬均對螨變應(yīng)原敏感，均表達(dá)抗粉塵螨變應(yīng)原的IgE抗體[9]。英國過敏性犬的血清樣本中同樣發(fā)現(xiàn)了粉塵螨特異性IgE抗體[10]。國內(nèi)獸醫(yī)臨床上也有犬過敏案例報(bào)道[11]。目前，獸醫(yī)臨床上缺乏防治塵螨過敏，尤其是熱帶螨過敏的動物疫苗。研究表明，Blo t 5是熱帶螨的主要變應(yīng)原[12]，有高達(dá)92%的過敏患者對其過敏[13]。Blo t 21是近些年新發(fā)現(xiàn)的熱帶螨的變應(yīng)原，用核磁共振方法研究Blo t 21的結(jié)構(gòu)和IgE表位，發(fā)現(xiàn)Blo t 21是具有相似結(jié)構(gòu)和致敏性的Blo t 5變應(yīng)原的旁系同源物，和Blo t 5有40.7%的序列相似性，但兩者之間有較低的交叉反應(yīng)性[14]。大部分熱帶螨過敏的病患對Blo t 5和Blo t 21顯示出共同致敏化[15]。過敏反應(yīng)與變應(yīng)原特異性Th1和Th2細(xì)胞平衡失調(diào)有關(guān)，主要表現(xiàn)為Th2細(xì)胞反應(yīng)性過強(qiáng)，過敏患者表達(dá)高水平的Th2細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子[16]。變應(yīng)原特異性免疫療法(allergy specific immunotherapy，AIT)是基于對致病變應(yīng)原的管理，以誘導(dǎo)由變應(yīng)原特異性IgG抗體組成的“反免疫反應(yīng)”，IgG可減緩IgE與變應(yīng)原的結(jié)合，以及細(xì)胞免疫反應(yīng)的改變，特別是減少變應(yīng)原特異性Th2反應(yīng)[17]。許多變應(yīng)原具有間接支持Th2細(xì)胞分化的酶活性。例如，來自屋塵螨的主要變應(yīng)原Der p 1是一種蛋白水解酶，可分解B細(xì)胞上的CD23。由于CD23通常抑制IgE的合成，因此，CD23的分解，可間接促進(jìn)IgE合成的上調(diào)。IgE可以與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上的IgE高親和力受體(IgE-FcεRI)結(jié)合，當(dāng)細(xì)胞結(jié)合的IgE識別變應(yīng)原后，導(dǎo)致肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯等過敏介質(zhì)，誘發(fā)過敏[17-18]。

免疫刺激DNA序列(immuncostimulatar DNA sequence, ISS)為非甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸重復(fù)序列，即CpG基序，是一種強(qiáng)有力的非特異性免疫刺激DNA序列[19]。非甲基化CpG基序可直接刺激人B細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cell, pDC)，從而促進(jìn)1型T輔助細(xì)胞(Th1)和抗原遞呈細(xì)胞的成熟/激活[20]。因此，非甲基化的CpG基序可以作為免疫佐劑，通過保持CpG DNA和變應(yīng)原之間的緊密物理接觸來優(yōu)化這些效果。將CpG DNA與多種疫苗共同使用，可改善動物感染模型中的保護(hù)性免疫力[20]。臨床試驗(yàn)表明，CpG具有良好的安全性，并可以提高共同接種疫苗的免疫原性[21]。

疫苗是預(yù)防和控制傳染病的最成功的公共衛(wèi)生干預(yù)措施之一，DNA疫苗又稱為第三代疫苗，可以誘導(dǎo)有效的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，而無需任何額外的佐劑，DNA疫苗穩(wěn)定易保存、方便運(yùn)輸，成本低等優(yōu)勢使其成為近年來研究較熱的基因工程疫苗。DNA疫苗是編碼免疫原或與免疫原相關(guān)的真核表達(dá)質(zhì)粒 DNA(有時(shí)也可能是 RNA)，在強(qiáng)大的組成活性啟動子[如巨細(xì)胞病毒(CMV)]的控制下，通過注射器或推進(jìn)裝置(如基因槍)將DNA疫苗接種到宿主的肌肉或皮膚中，使DNA被吸收到細(xì)胞中，目的基因在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯，此蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性和特異性兩種免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而起到免疫保護(hù)作用[22]。DNA疫苗除了能夠引發(fā)體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)外，還被認(rèn)為比傳統(tǒng)疫苗更安全。它相對更穩(wěn)定，并且在制造和存儲方面可能更具成本效益?？梢詫⒍喾N抗原組合成一個(gè)質(zhì)粒，以靶向多種病原體或單一病原體的多種組分[23]。編碼過敏原的DNA疫苗有望通過誘導(dǎo)過敏原特異性Th1反應(yīng)來預(yù)防或治療過敏癥。編碼屋塵螨變應(yīng)原Der p 2的DNA疫苗對未處理小鼠進(jìn)行免疫接種，研究發(fā)現(xiàn)通過偏向Th1免疫反應(yīng)阻止屋塵螨過敏的發(fā)生，其特征是變應(yīng)原特異性IgE、IL-5和肺部炎癥顯著降低，同時(shí)誘導(dǎo)高滴度特異性IgG2a[24]。編碼屋塵螨變應(yīng)原Der p 2的DNA疫苗pVAX1-Der p 2-A20免疫小鼠后，小鼠血清 Der p 2特異性IgE、IL-4和IL-13表達(dá)水平受到抑制，而Der p 2 特異性IgG2a和IFN-γ表達(dá)水平升高，血清和脾CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞群增加，明顯改善了Der p 2引起的過敏鼻炎[25]。

目前，熱帶螨引起的過敏性疾病的應(yīng)對方法主要有3種：(1)規(guī)避變應(yīng)原，(2)藥物抑制過敏反應(yīng)，(3)特異性免疫治療。規(guī)避變應(yīng)原最為有效，但是也最難實(shí)現(xiàn)，因?yàn)榄h(huán)境中的熱帶螨無處不在。藥物抑制過敏反應(yīng)，主要是采用抗組胺藥、減充血?jiǎng)┗蛘咂渌恍┧幬?。但是這些藥物只能緩解過敏癥狀，并不能從機(jī)體免疫系統(tǒng)角度去抑制過敏反應(yīng)。特異性免疫療法是可以通過少量逐步攝入特異性變應(yīng)原，誘導(dǎo)部分患者對原本過敏的變應(yīng)原發(fā)生免疫耐受，從而減輕病痛，提高生活質(zhì)量，該方法的缺點(diǎn)是治療時(shí)間長，往往需要持續(xù)較長的時(shí)間才能達(dá)到理想的效果[26]，另外熱帶螨的粗提物不是單一物質(zhì)，容易誘發(fā)過敏。DNA疫苗安全可靠，制備簡便，便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，使得DNA疫苗的前景更加廣闊?；谝陨显颍髡邩?gòu)建了融合熱帶螨主要變應(yīng)原Blo t 5和Blo t 21融合基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒還包含CpG基序和Th通用抗原表位PADRE，將其免疫小鼠，檢測其免疫效果，為進(jìn)一步開發(fā)防治熱帶螨過敏性疾病的動物疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 4～8周齡健康的雌性BALB/c小鼠從廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心購買，飼養(yǎng)于海南大學(xué)動物房，保持在特定的無病原體條件下飼養(yǎng)，食物和墊料均為SPF級。所有動物試驗(yàn)均嚴(yán)格按照海南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理要求，并經(jīng)海南大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 菌株、載體和試劑 大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自生工生物工程(上海)股份有限公司；pVAX1真核表達(dá)載體和HEK293細(xì)胞均由海南大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)院生物技術(shù)與分子藥理實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒小提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(貨號：A2492)和T4 DNA連接酶購自Promega公司；HindⅢ和XbaⅠ限制性內(nèi)切酶均購自NewEnglandBiolabs公司；Biotin 4D9 Anti Blo t 5抗體(貨號：MA-4D9)購自Indoor Biotechnologies公司；山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa Fluor? 488)，(Abcam,貨號：AB150113)；HRP標(biāo)記兔抗小鼠IgG(Sangon Biotech，貨號：D110098)、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG1(ThermoFisher，貨號：TL2682370)、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG2a(ThermoFisher，貨號：A-10685)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 Reagent購自 Invitrogen 公司；流式抗體和胎牛血清均購自Biolegend公司；DMEM培養(yǎng)基和Opti-MEMI培養(yǎng)基均購自Gibco公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG真核表達(dá)載體的構(gòu)建 熱帶螨主要變應(yīng)原Blot5(U59102)、Blot21(DQ788677.1)基因序列來自NCBI GenBank庫，進(jìn)行密碼子優(yōu)化后的序列兩端分別加入HindⅢ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)，并在N端加上Th通用抗原表位PADRE(AKFVAAWTLKAAA, 序列：5′-GCCAAGTTCGTGGCCGCCTGGACCCTGAAGGCCGCCGCC-3′)，在C端加上CpG(TCTCCCAGCGTGCGCCAT)序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon)進(jìn)行合成，利用HindⅢ和XbaⅠ酶切回收，連接至經(jīng)HindⅢ和XbaⅠ酶切回收的pVAX1質(zhì)粒載體上，最終構(gòu)建pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG真核表達(dá)載體(質(zhì)粒圖譜見圖1A)。

1.2.2 重組質(zhì)粒 pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞的鑒定

1.2.2.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的準(zhǔn)備：轉(zhuǎn)染前 24 h，將培養(yǎng)狀態(tài)良好的HEK293細(xì)胞傳代培養(yǎng)于含10%FCS 的 DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，次日細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%，更換為Opti-MENI培養(yǎng)基(添加量比平時(shí)所加培養(yǎng)基的量少)。

1.2.2.2 轉(zhuǎn)染試劑的配制：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將細(xì)胞分成3組進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，分別為對照組(pVAX1空載體組)、試驗(yàn)組(pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組)和空白組(沒有轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞組)。將130 μL Opti-MEN培養(yǎng)液分別用于稀釋 10 μL 的LipofectamineTM2000 Reagent 和2 μg 的重組質(zhì)粒，室溫放置5 min，將兩液體混合，室溫靜置 20 min，使其形成 DNA 轉(zhuǎn)染復(fù)合物，從而完成轉(zhuǎn)染液的配制。

1.2.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞：將DNA-LipofectamineTM2000 Reagent 復(fù)合物添加到HEK293細(xì)胞中，5%CO2，37 ℃培養(yǎng) 4～6 h。轉(zhuǎn)染 5～6 h 后，輕柔吸取細(xì)胞上層的液體換成含10%FCS的DMEM培養(yǎng)基，每皿3 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞總蛋白的提?。恨D(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞密度達(dá)80%～90%，收集細(xì)胞。棄去培養(yǎng)基，加入預(yù)先預(yù)冷的PBS輕輕晃動清洗培養(yǎng)皿3次，以除去培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)皿置于冰上。每個(gè)培養(yǎng)皿中加入150 μL的細(xì)胞裂解液，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮至培養(yǎng)皿一側(cè)(動作要快)，置于冰上裂解30 min后(為使細(xì)胞裂解充分，要經(jīng)?；蝿优囵B(yǎng)皿，此過程均置冰上進(jìn)行)，用注射器吹打細(xì)胞10～12次。裂解完成后，將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 mL EP管中。于4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中，-80 ℃保存待用。

1.2.2.5 細(xì)胞裂解液配制：細(xì)胞裂解液RIPA裂解體系[150 mmol·L-1NaCl，10 mmol·L-1Tris(pH 7.4)，1% NP-40，2 mmol·L-1的 EDTA、EGTA和0.1% SDS溶解于80 mL超純水中，待溶解后加入HCl調(diào)pH至7.4.定容至100 mL]。10 mmol·L-1PMSF(稱量17.419 g PMSF，溶解于10 mL的無水乙醇)。使用前加入30 mL RIPA+3 mL PMSF+1片復(fù)合試劑(含終濃度為2 μg·μL-1的aprotintin和2 μg·μL-1的Leupetin)。

1.2.2.6 Western blot檢測重組質(zhì)粒pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG的真核表達(dá)：將收集到的細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將膠條裁至適合大小，與膠條大小一致的NC膜和濾紙浸入轉(zhuǎn)膜液中浸透。按濾紙-NC膜-膠-濾紙(自下而上)的順序放置在半干轉(zhuǎn)膜儀上，用玻璃棒輕輕滾壓濾紙以除去氣泡。20 V恒壓，轉(zhuǎn)膜30 min。結(jié)束后，用5%的脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，用1×TBST洗膜5次，每次5 min；用自制的羊抗兔的anti-rBlo t 5-21的一抗(1∶210稀釋)和鼠源的anti-Blo t 5一抗(1∶3 000稀釋)4 ℃孵育過夜；1×TBST漂洗5次，每次5 min；用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶5 000稀釋)室溫避光孵育2 h；1×TBST漂洗5次，每次5 min。TyphoonFLA9500熒光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測。

1.2.3 pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG疫苗免疫小鼠 為了檢測pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG核酸疫苗的免疫效果，選擇小鼠進(jìn)行免疫試驗(yàn)，設(shè)置pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG疫苗組(n=6)，同時(shí)設(shè)未免疫對照組(n=6)。分別在第0、14天時(shí)，通過耳頸后皮下多點(diǎn)注射(100 μL，1 mg·mL-1)兩次，然后在第28天通過眼框采血，離心，取血清，存于-20 ℃待用。

1.2.4 ELISA法檢測小鼠血清中IgG、IgG1和IgG2a的水平 用包被緩沖液將Blo t 5-21(作為抗原)稀釋至10 μg·mL-1(100 μL·孔-1)，4 ℃包被96孔酶標(biāo)板，過夜后棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次。然后用5%脫脂奶粉封閉酶標(biāo)板，37 ℃孵育1 h后，同樣使用洗滌液洗滌5次，將得到的小鼠血清進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專?00 μL·孔-1加入到酶標(biāo)板中在37 ℃孵育2 h，洗滌步驟如上。然后每孔中加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體，檢測血清中相應(yīng)的IgG、IgG1和IgG2a的水平，在37 ℃中孵育2 h，同樣洗滌5次后，每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù) 免疫小鼠完成后，第28天取小鼠脾，制備脾淋巴細(xì)胞懸液，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

1.2.5.1 脾淋巴細(xì)胞懸液的制備：無菌條件下分離小鼠脾，根據(jù)小鼠淋巴細(xì)胞分離液說明書制備脾單細(xì)胞懸液，具體步驟，①將脾置于含有 PBS 的試管中，加入1 mL小鼠淋巴細(xì)胞分離液，用注射器研磨脾(時(shí)間控制在5 min內(nèi))完全后；立即將脾細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，用尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞，再取3 mL分離液清洗尼龍網(wǎng)上殘余的淋巴細(xì)胞。②添加0.5～1 mL RPMI1640培養(yǎng)基，保持液面分界明顯，室溫下800 r·min-1離心30 min。設(shè)置較慢的加速度和減速度。離心后上層為RPMI1640，次為淋巴細(xì)胞層，分離液層，紅細(xì)胞及其他細(xì)胞和死細(xì)胞碎片；③吸出淋巴細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入 1640 培養(yǎng)基，混勻，室溫250 r·min-1離心10 min收集細(xì)胞；④棄上清，加入1640 完全培養(yǎng)基(含100 μg·mL-1胎牛血清，100 μg·mL-1鏈霉素和 100 U·L-1青霉素)重懸細(xì)胞，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為(1～5)×106后，待流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5.2 細(xì)胞表面熒光抗體染色：①收集細(xì)胞，即取部分細(xì)胞，總數(shù)1×106～2×106脾淋巴細(xì)胞置于1.5 mL EP管中，350 r·min-1離心5 min，棄上清。②染色，去除上清，加入預(yù)混抗體的PBS(10%胎牛血清)，將細(xì)胞混勻，避光，4 ℃或冰上，染色30～60 min，反應(yīng)總體積100 μL。③清洗，加入至少2 mL的PBS洗滌，350 r·min-1離心5 min，棄上清，洗滌2次。④檢測，去除上清，再加入500 μL PBS，吹打混勻后置于冰上，待流式儀檢測。

1.2.5.3 細(xì)胞內(nèi)染色方案：使用Fix/permeabilizatioin Buffer(biolegend)固定破膜劑。①固定，進(jìn)行細(xì)胞表面抗原染色后，在黑暗中在室溫下于0.5 mL·管-1固定緩沖液中固定細(xì)胞20 min。以350 r·min-1離心5 min，棄去上清液，使用PBS將細(xì)胞洗滌1次。將細(xì)胞重懸于細(xì)胞染色緩沖液中。②細(xì)胞膜透化作用，即用去離子水中將10×細(xì)胞內(nèi)染色透化緩沖液(intracellular staining permeabilizatioin wash buffer，簡寫為Perm buffer)稀釋至1×。將固定的細(xì)胞重懸于1×Perm buffer中，并以350 r·min-1離心5～10 min。重復(fù)清洗兩次。③細(xì)胞內(nèi)染色，即將上述細(xì)胞重懸于1×Perm buffer，并在室溫下于避光加入目標(biāo)熒光基團(tuán)偶聯(lián)抗體或適當(dāng)?shù)年幮詫φ?0～60 min。用2 mL 1×Perm buffer洗滌2次，并以350 r·min-1離心5 min。將細(xì)胞重懸于0.5 mL PBS中，并用適當(dāng)?shù)膶φ者M(jìn)行流式細(xì)胞檢測。

2 結(jié) 果

2.1 載體構(gòu)建

純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)HindⅢ和XbaⅠ雙酶切后，插入到pVAX1表達(dá)載體中，構(gòu)建成功的表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG經(jīng)HindⅢ和XbaⅠ雙酶切，電泳結(jié)果表明，PADRE-Blo t 5-21-CpG基因片段與目的條帶大小(801 bp)一致(圖1B)。將質(zhì)粒測序，測序結(jié)果與原始序列比對完全一致，表明，pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

A.pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG 質(zhì)粒圖譜；B.pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG重組質(zhì)粒雙酶切鑒定(M.DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.重組質(zhì)粒對照；2.重組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ單酶切產(chǎn)物；3.重組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和XbaⅠ雙酶切產(chǎn)物)

2.2 Western blot 檢測重組質(zhì)粒PADRE-Blo t 5-21-CpG蛋白的真核表達(dá)

重組質(zhì)粒pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG和空載體pVAX1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，分別收取轉(zhuǎn)染48 h后的2組細(xì)胞，進(jìn)行Western blot檢測PADRE-Blo t 5-21-CpG蛋白的表達(dá)。經(jīng)鼠源Biotin4D9 Anti Blo t 5抗體(貨號：MA-4D9)為一抗，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗鼠二抗進(jìn)行免疫檢測，結(jié)果如圖2所示，轉(zhuǎn)染pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG重組質(zhì)粒的細(xì)胞可以看見特異性條帶，大小符合預(yù)期。而轉(zhuǎn)染空載體pVAX1組和HEK293細(xì)胞對照組沒有特異性條帶的出現(xiàn)，表明所構(gòu)建的pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG重組質(zhì)?？梢栽隗w外細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)。

M.預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.HEK293細(xì)胞裂解物；2.轉(zhuǎn)染pVAX1質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞裂解物；3.空白泳道；4.轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG的HEK293細(xì)胞裂解物

2.3 小鼠血清中特異性IgG、IgG1和IgG2a的水平變化

小鼠經(jīng)兩次免疫后，在第28天采血，采用ELISA法檢測小鼠血清中特異性IgG、IgG1和IgG2a水平，結(jié)果如圖3A所示，與正常小鼠未免疫對照組(na?ve)相比，pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG免疫后小鼠血清中特異性IgG和IgG2a水平顯著升高(P<0.05)，特異性IgG1水平顯示升高趨勢，但是和正常小鼠組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。統(tǒng)計(jì)IgG2a/IgG1的比值發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠組相比，pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG免疫后小鼠的血清IgG2a/IgG1的比值顯著升高(圖3B，P<0.05)，這暗示了pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG質(zhì)粒免疫小鼠后，小鼠體內(nèi)免疫偏向Th1型反應(yīng)。

A.小鼠血清中特異性IgG、IgG1、IgG2a水平；B.小鼠血清中特異性IgG2a和IgG1的比值。兩個(gè)試驗(yàn)組間比較(n=6)，*.P<0.05；**.P<0.01；ns.P>0.05

2.4 小鼠脾淋巴細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測

小鼠經(jīng)兩次免疫后，在第28天分離小鼠脾制備脾淋巴細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞變化。結(jié)果如圖4所示，與正常小鼠組(na?ve)相比，pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG免疫后小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞水平顯著升高(圖4C，P<0.05)，這表明pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG核酸疫苗可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

3 討 論

熱帶螨(Blomiatropicalis)變應(yīng)原是熱帶地區(qū)最重要的螨變應(yīng)原，海南島因其獨(dú)特的地理位置和氣候條件，年平均溫度22～26 ℃，相對濕度在76%～86%，是我國最適宜熱帶螨孳生地之一。研究已經(jīng)證實(shí)Blo t 5是主要的變應(yīng)原[27]。Blo t 21是具有相似致敏性的第5組變應(yīng)原(Blo t 5)的旁系同源物[14]。大部分的過敏患者對Blo t 5和Blo t 21這兩個(gè)變應(yīng)原同時(shí)敏感[28]。Blo t 5和Blo t 21被認(rèn)為是熱帶螨的主要變應(yīng)原[29]，而隨著城市化的發(fā)展，在熱帶和亞熱帶地區(qū)，由熱帶螨變應(yīng)原誘發(fā)的過敏性疾病日益增多，包括寵物和人群。因此迫切需要開發(fā)能夠防治熱帶螨過敏癥的候選疫苗。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了包含熱帶螨主要變應(yīng)原Blo t 5和Blo t 21的真核表達(dá)載體pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，Western blot驗(yàn)證該重組質(zhì)粒能在體外真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)，證明該核酸疫苗構(gòu)建成功，為進(jìn)一步小鼠免疫試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。ELISA試驗(yàn)表明，pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG核酸可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平IgG，而有研究表明，使用針對特異性皮炎犬的病毒樣顆粒疫苗治療時(shí)，可以誘導(dǎo)犬產(chǎn)生高滴度的IgG，從而消除了屋塵螨致敏和誘導(dǎo)犬致敏產(chǎn)生的瘙癢癥狀[30]。在本試驗(yàn)中，IgG2a/IgG1的比值升高，提示pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG核酸可能誘使小鼠體內(nèi)偏向Th1型的免疫反應(yīng)。而Mousavi 等[31]的研究表明，使用變應(yīng)原和CpG的變應(yīng)原免疫療治療時(shí)，顯著地提高了過敏模型小鼠血清中IgG2a/IgG1的比值，阻止了Th2介導(dǎo)的過敏反應(yīng)[31]。

支氣管哮喘是一種典型的Ⅰ型超敏反應(yīng)引起的疾病，支氣管哮喘發(fā)病的T細(xì)胞和肥大細(xì)胞/嗜堿性粒細(xì)胞聯(lián)合致病，即抗原遞呈細(xì)胞(APC)加工后的抗原片段與MHC Ⅱ類分子形成復(fù)合物，呈遞給CD4+T細(xì)胞被活化。嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞分泌的IL-4 促進(jìn)Th0向Th2分化，后者在受到變應(yīng)原刺激后分泌IL-4、IL-5和IL-13等Th2型細(xì)胞因子，通過與相應(yīng)受體結(jié)合介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)IgE受體(FcεR Ⅰ)結(jié)合誘發(fā)支氣管哮喘的發(fā)生。當(dāng)機(jī)體處于正常狀態(tài)時(shí)，Th1和Th2處于動態(tài)平衡狀態(tài)。一旦機(jī)體受到外來抗原的刺激，Th1和Th2的表達(dá)水平就會發(fā)生變化，導(dǎo)致特定類型的免疫反應(yīng)顯示出優(yōu)勢，導(dǎo)致Th1/Th2失衡[32-33]，這種失衡是變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病機(jī)制[34]。研究表明，偏向Th1的Th1/Th2失衡可降低過敏性野生型小鼠的氣道高反應(yīng)性和Th2介導(dǎo)的肺部炎癥[35]。在CpG基序與變應(yīng)原相結(jié)合的免疫療法治療哮喘的馬中發(fā)現(xiàn)，該免疫療法通過下調(diào)IL-4等Th2細(xì)胞因子的免疫反應(yīng)，改善了馬哮喘的臨床反應(yīng)[36]。Th1細(xì)胞通過產(chǎn)生IL-2、TGF-β和IFN-γ，可以抑制過敏反應(yīng)，在細(xì)胞免疫的發(fā)展中起關(guān)鍵作用[37-38]。IL-4 和 IL-13 與過敏性哮喘患者血清 IgE 產(chǎn)生的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，這兩種細(xì)胞因子在Th2 哮喘的病理生理學(xué)中的相關(guān)性使它們成為治療哮喘的合適目標(biāo)[39]，因此可以通過下調(diào)Th2的細(xì)胞因子的表達(dá)量來抑制過敏反應(yīng)。本試驗(yàn)構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG核酸疫苗免疫小鼠，其血清中IgG2a、IgG2a/IgG1比例均升高，這暗示了小鼠體內(nèi)偏向Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)。而IgG2a在抑制支氣管哮喘發(fā)生方面比IgG1更有效[40]。因此，當(dāng)pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG質(zhì)粒免疫小鼠后，小鼠體內(nèi)免疫偏向Th1型細(xì)胞反應(yīng)，具有抑制熱帶螨過敏反應(yīng)的發(fā)生的潛力。此外，在構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG中，作者引入了CD4+T輔助細(xì)胞的通用抗原表位PADRE和一段CpG序列。研究表明PADRE可以有效地誘導(dǎo)Th1型反應(yīng)，且細(xì)胞因子IFN-γ呈高表達(dá)[41]。CpG寡脫氧核苷酸與變應(yīng)原特異性免疫療法結(jié)合可以抑制Th2 偏向的超敏反應(yīng)。例如，含有寡脫氧核苷酸的免疫刺激性CpG被證明可以抑制小鼠過敏性結(jié)膜炎和哮喘的發(fā)展[42-43]。這可能與CpG基序能激活包括B淋巴細(xì)胞和類漿細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞，并誘導(dǎo)產(chǎn)生以Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)為主的免疫應(yīng)答有關(guān)[44]。因此，CpG基序可以添加到DNA或常規(guī)蛋白質(zhì)疫苗，以提高Th1免疫反應(yīng)[45]。DNA疫苗為Ⅰ型過敏的保護(hù)性和治療性治療開辟了廣闊的范圍。與傳統(tǒng)的免疫療法(SIT)相比，DNA疫苗的抗過敏作用可以明確歸因于其Th1誘導(dǎo)能力[46]。由于多種天然和重組蛋白不容易分離且易于降解，很難純化出足夠數(shù)量的蛋白質(zhì)用于產(chǎn)生抗體等，所以基于DNA的免疫是一種有吸引力的替代策略，它繞開了抗原純化步驟，直接注射機(jī)體以產(chǎn)生抗體[47]。但是DNA疫苗仍有局限性，如DNA疫苗往往具有相對較弱的免疫原性，常常需要大劑量才能有效[23]。通常在小鼠中每次注射(肌肉內(nèi))劑量為25～100 μg已經(jīng)足夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，但在靈長類動物或人類中似乎需要更高的劑量[20]。

表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子 Foxp3 的調(diào)節(jié) T 細(xì)胞(Tregs)在維持免疫自我耐受性和預(yù)防自身免疫力方面發(fā)揮著重要作用[48]，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以發(fā)揮免疫抑制作用，抑制過敏性疾病的發(fā)生，或者緩解嚴(yán)重過敏性反應(yīng)[49]。比如Treg細(xì)胞能夠抑制過敏性Th2細(xì)胞反應(yīng)的發(fā)展[50]。使用變應(yīng)原特異性免疫療法治療患有特異性過敏皮炎的狗時(shí)，發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-10的含量都顯著增加以及血IgE水平顯著下降[51]，說明Tregs可能在動物皮炎和其他過敏性疾病特應(yīng)性治療中發(fā)揮重要作用，本試驗(yàn)構(gòu)建熱帶螨主要變應(yīng)原Blo t 5和Blo t 21融合基因的真核表達(dá)載體pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG，免疫小鼠后可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，這表明表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG可能可以抑制熱帶螨誘發(fā)的過敏性疾病，下一步計(jì)劃利用Blo t 5-21重組蛋白或者熱帶螨粗提物誘導(dǎo)過敏性小鼠模型，然后利用pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG疫苗治療過敏模型小鼠，評估該核酸疫苗抑制小鼠過敏癥狀的效果及深入探究其機(jī)制，這為開發(fā)防治熱帶螨過敏癥的獸用疫苗奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建熱帶螨主要變應(yīng)原融合基因的真核表達(dá)載體pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG，該核酸疫苗可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性IgG，且IgG2a/IgG1比值升高，暗示了核酸疫苗pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG可誘導(dǎo)小鼠機(jī)體發(fā)生偏向Th1型的免疫反應(yīng)，此外，pVAX1-PADRE-Blo t 5-21-CpG還可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，為進(jìn)一步開發(fā)防治熱帶螨過敏癥的獸用核酸疫苗奠定了基礎(chǔ)。