何姝凡，岳 華,2，湯 承,2，劉 杰,2*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041；2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

牛腺病毒3型(bovine adenovirus type 3，BAdV-3)為腺病毒科(Adenoviridae)哺乳動(dòng)物腺病毒屬(Mastadenovirus)的成員，為無囊膜的線性雙鏈DNA病毒，可引起牛發(fā)熱、呼吸道癥狀、犢牛肺炎和輕微腸道癥狀，是導(dǎo)致牛呼吸道疾病的重要病原之一[1-2]。牛呼吸道疾病綜合征(bovine respiratory disease complex, BRDC)是由多種病原體混合感染引起的一類危害嚴(yán)重的牛呼吸系統(tǒng)疾病[3]，該病在世界范圍內(nèi)廣泛存在，據(jù)統(tǒng)計(jì)養(yǎng)牛業(yè)中65%的疾病與牛的呼吸道疾病相關(guān)，感染率達(dá)100%，死亡率可達(dá)35%或更高，該病每年給全世界養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。先前的研究認(rèn)為導(dǎo)致BRDC的病毒主要有牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)、牛副流感3型病毒(bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3)、牛呼吸道合胞體病毒(bovine respiratory syncytial virus，BRSV)、牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒(bovine viral diarrhoea virus，BVDV)等[5-7]。但最近陸續(xù)有研究報(bào)道BAdV-3在出現(xiàn)BRDC癥狀的牛群中被廣泛檢出，并且與該病的發(fā)生顯著相關(guān)(P<0.000 1)[8-9]。本實(shí)驗(yàn)室對四川11個(gè)引種肉牛場暴發(fā)的BRDC進(jìn)行病原學(xué)檢測，結(jié)果顯示，BAdV-3的陽性率高達(dá)78.7%，并成功分離到1株纖突基因(fiber)存在缺失和替換的BAdV-3毒株(BO/YB24/17/CH)，并且證實(shí)該缺失型在我國具有廣泛的地域分布[10]。由此可見BAdV-3也是引發(fā)BRDC的一個(gè)重要病毒性病原，在我國可能存在獨(dú)特的進(jìn)化趨勢，應(yīng)引起足夠的重視。因此本文綜述了BAdV-3在生物學(xué)特性、流行病學(xué)、致病性、檢測技術(shù)等方面的國內(nèi)外最新進(jìn)展，以期為后續(xù)科學(xué)研究以及相關(guān)疾病的有效防控提供參考。

1 BAdV-3的生物學(xué)特性

1.1 結(jié)構(gòu)

BAdV-3為無囊膜包裹的線性雙鏈DNA病毒，核衣殼呈二十面體立體對稱，直徑為70～90 nm。其核衣殼由252個(gè)殼粒組成，包括240個(gè)六鄰體(hexon)和12個(gè)五鄰體(penton)。六鄰體是二十面體的20個(gè)面和棱的主要組成部分，五鄰體是由寬7 nm的基部與由基部外伸出的長約15 nm的纖突(fiber)組成，位于病毒粒子的12個(gè)頂端。纖突分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域：尾區(qū)(tail)、軸區(qū)(shaft)和旋鈕區(qū)(knob)，其長度因不同的血清型而異，knob區(qū)位于頂端是一個(gè)直徑4 nm的球狀物，血凝素(HA)也位于該部位，病毒感染細(xì)胞時(shí)knob區(qū)首先與細(xì)胞受體結(jié)合。

1.2 基因組特征及編碼蛋白

1.2.1 基因組結(jié)構(gòu) BAdV-3的基因組全長約為34 kb, 其中G+C的比例約為54%，A+T的含量約為46%[11]?；蚪M的5′和3′兩端各有一段約195 bp的反向末端重復(fù)序列(inverted terminal repeats，ITR)。根據(jù)病毒入侵細(xì)胞之后各個(gè)基因表達(dá)時(shí)間的差異，將其分為早期基因(E1～E4)、中期基因(plX、IVa2)和晚期基因(L1～L7)(圖1)。

圖1 BAdV-3的基因組結(jié)構(gòu)模式圖

早期基因E1區(qū)位于基因組左末端，主要參與病毒的復(fù)制，可以進(jìn)一步分為E1A和E1B。病毒進(jìn)入細(xì)胞核后，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子首先與E1A區(qū)上游的增強(qiáng)子結(jié)合，表達(dá)E1A蛋白，該蛋白的作用包括兩個(gè)方面：1)調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，使病毒更易在細(xì)胞中復(fù)制，2)激活 E1B等其他早期轉(zhuǎn)錄單位的啟動(dòng)子[12]。最近的研究發(fā)現(xiàn)BAdV-3 E1區(qū)編碼了一種新的結(jié)構(gòu)蛋白155R，但該結(jié)構(gòu)蛋白不參與病毒的復(fù)制[13]，其具體作用還有待進(jìn)一步研究；E2區(qū)包括E2A和E2B，E2A編碼DNA結(jié)合蛋白(DNA binding protein, DBP)，E2B編碼DNA聚合酶(Pol)和末端前體蛋白(pTP)。3個(gè)蛋白參與了病毒的復(fù)制以及誘導(dǎo)晚期基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯；E3區(qū)編碼兩種蛋白284R和121R，雖然不參與病毒基因組的復(fù)制，但其產(chǎn)物可抑制MHC Ⅰ類抗原的呈遞以及腫瘤壞死因子的表達(dá)，從而破壞宿主的免疫防御機(jī)制[14]；E4區(qū)位于基因組3′端的末端，包含5個(gè)開放閱讀框(ORF1～ORF5)，其編碼蛋白在不同層面上參與了病毒感染過程。E4區(qū)域缺失的病毒在DNA復(fù)制、晚期mRNA合成以及宿主細(xì)胞蛋白合成等方面存在嚴(yán)重缺陷[15]。

中期基因主要編碼兩種結(jié)構(gòu)蛋白：pIX蛋白和IVa2蛋白。pIX蛋白是病毒粒子的一種結(jié)構(gòu)成分，含有125個(gè)氨基，起著轉(zhuǎn)錄激活因子的作用[16]。IVa2 蛋白功能為促進(jìn)主要晚期啟動(dòng)子(MLP)的活化，并且參與核/核仁定位以及與PV蛋白的相互作用[17-18]。此外IVa2 蛋白還可作為ATP酶為腺病毒基因組包裝到衣殼中提供動(dòng)力[19]。

晚期基因 L1區(qū)包含52K、IIIA、III(penton)和pVII四種蛋白。52K蛋白含有331個(gè)氨基酸，與其他腺病毒相比，相似性為21%～61%。IIIA蛋白是病毒粒子上的一種磷蛋白，參與形成六鄰體多肽，在病毒組裝過程中被病毒蛋白酶水解[20]。III蛋白與纖突蛋白一起組成五鄰體，在病毒入侵宿主細(xì)胞中起著重要的作用。pVII蛋白是構(gòu)成腺病毒核心的主要蛋白，參與了腺病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核以及子代DNA包裝到衣殼的過程。也有報(bào)道證明BAdV-3能將pVII蛋白轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞的線粒體上，通過抑制線粒體膜電位(MMP)的丟失和增加線粒體Ca2+和ATP的產(chǎn)生來干擾細(xì)胞凋亡[21-23]。L2區(qū)只編碼pV蛋白，含有423個(gè)氨基酸。pV蛋白是病毒顆粒正常組裝所必需的，當(dāng)其缺失會(huì)影響衣殼的完整性，從而導(dǎo)致BAdV-3的感染性消失[24]；L3區(qū)編碼pX蛋白，pX蛋白中心結(jié)構(gòu)域富含堿性氨基酸，該區(qū)域可能介導(dǎo)了與病毒DNA的結(jié)合[25]；L4 區(qū)編碼pVI 蛋白，包含263個(gè)氨基酸，是病毒粒子衣殼的組成成分；L5區(qū)域編碼六鄰體蛋白和蛋白酶。L6區(qū)域編碼結(jié)構(gòu)蛋白pVIII和非結(jié)構(gòu)蛋白100K、33K。pVIII是一種六鄰體相關(guān)蛋白，在病毒感染過程中起著重要的作用，其與真核生物啟動(dòng)因子6(eIF6)的相互作用可能有助于在腺病毒感染的后期階段優(yōu)先翻譯腺病毒基因[26]。33K蛋白是一種多功能蛋白，在病毒感染過程中與100K和pV蛋白發(fā)生相互作用[27]。100K蛋白能將六鄰體多肽折疊，所以也稱為六鄰體組裝蛋白。L7區(qū)域主要編碼纖突蛋白。

1.2.2 BAdV-3的主要蛋白 在此著重介紹DNA結(jié)合蛋白、六鄰體蛋白和纖突蛋白。

1.2.2.1 DNA結(jié)合蛋白基因及其編碼蛋白：DBP基因長度約為1 298 bp，編碼432個(gè)氨基酸，主要參與病毒DNA的復(fù)制。DBP含有一個(gè)可變的氨基端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)保守的羧基端結(jié)構(gòu)域。N-末端為弱保守區(qū)域，能被廣泛磷酸化，其對于DNA復(fù)制是非必需的，但它含有核定位信號(NLS)，決定著宿主的特異性。非磷酸化的C-末端結(jié)構(gòu)域在各種血清型中高度保守，具有核酸結(jié)合特性，它們在DNA結(jié)合和復(fù)制以及主要晚期啟動(dòng)子(MLP)的轉(zhuǎn)錄激活中起重要作用。在DNA復(fù)制過程中，DBP具有催化DNA解旋，使得DNA雙鏈不穩(wěn)定的能力，所以又稱之為螺旋失穩(wěn)蛋白。在鏈的延伸過程中DBP能保護(hù)置換合成的單鏈不受核酸酶的攻擊，增加DNA聚合酶的合成速率[28-29]。

1.2.2.2 六鄰體基因及其編碼的蛋白：Hexon基因長度為2 706～2 733 bp，編碼約910個(gè)氨基酸，是BAdV-3的主要抗原蛋白。Hexon是BAdV-3最保守的基因之一，不同型別的六鄰體相似性可以達(dá)到78%～95%，因此常被選作PCR檢測BAdV-3的靶基因。型特異性和群特異性表位位于這些保守區(qū)域，可作為病毒感染性疾病診斷的靶抗原位點(diǎn)[30]。Hexon的分子結(jié)構(gòu)為緊密排列的同源三聚體，每個(gè)亞基被鎖定在適當(dāng)?shù)奈恢?，形成保護(hù)病毒粒子內(nèi)部的蛋白外殼。Hexon分子的塔區(qū)由3個(gè)loop環(huán)構(gòu)成(L1、L2、L4)，L1和L2環(huán)中的氨基酸序列存在多個(gè)位置高度可變，被定義為7個(gè)高變區(qū)(HVRs)。中和抗原表位存在于這7個(gè)HVRs上，產(chǎn)生的中和抗體具有型別特異性，可以使其不再被同型的腺病毒所感染[31-32]。研究表明，人腺病毒3型(HAdV-3)病毒HVRs的變異可能會(huì)破壞因先前感染而獲得的免疫，發(fā)生免疫逃避[33]。

1.2.2.3 纖突基因及其編碼的蛋白：BAdV-3完整的fiber基因長度為2 931 bp，編碼976個(gè)氨基酸，主要參與病毒與細(xì)胞表面受體的初始附著。Fiber包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域：尾區(qū)(tail)、軸區(qū)(shaft)和旋鈕區(qū)(knob)。尾區(qū)高度保守，以非共價(jià)方式與多肽III連接，共同構(gòu)成五鄰體。旋鈕區(qū)為氨基酸羧基末端片段折疊而成的直徑為4 nm的球狀物，能與細(xì)胞受體結(jié)合，同時(shí)其上含有抗原表位，能產(chǎn)生抗BAdV-3的中和抗體，與六鄰體一起參與誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答。兩個(gè)末端結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域?yàn)檩S區(qū)，含有 46.5 個(gè)重復(fù)基序[34-36]。目前研究表明軸區(qū)的長短以及旋鈕區(qū)的變異對病毒的組織嗜性和免疫逃避起決定性作用。Shayakhmetov等[37]通過構(gòu)建一系列含有軸區(qū)長短不一的腺病毒5型的衣殼載體，發(fā)現(xiàn)這些載體在細(xì)胞吸附和感染方面存在顯著差異。Wu和Tikoo[38]發(fā)現(xiàn)通過用人腺病毒5型(HAdV-5)替換BAdV-3的knob區(qū)域后，病毒組織嗜性發(fā)生了改變，對非牛源的細(xì)胞系也易感。而Myhre等[39]通過缺失HAdV-5的knob區(qū)后發(fā)現(xiàn)，可以使重組病毒具有逃避中和抗體的作用。

1.3 遺傳與進(jìn)化

目前，GenBank中有11個(gè)BAdV-3全基因組數(shù)據(jù)和13個(gè)hexon和fiber基因序列，其中10個(gè)全基因組數(shù)據(jù)來自國外，其相似性為100%(登錄號為AC_000002.1、AX338887.1、AR178749.1、AF030154.1、BD133132.1、BD409754.1、DD453126.1、DL136070.1、NC001876.1和 HV975272.1)，只有1個(gè)全基因組來自中國(登錄號為JN381195.1)，為朱遠(yuǎn)茂等于2009年在黑龍江的1頭患有呼吸道疾病病牛的鼻拭子分離得到，命名為 HLJ0955株。中國毒株與國外毒株核苷酸相似性為95.5%，主要差異表現(xiàn)為HLJ0955株的ITR區(qū)、E1B區(qū)和E4 ORF1區(qū)與國外毒株相比存在堿基缺失。在13個(gè)完整的hexon和fiber序列中，包括了本實(shí)驗(yàn)室登錄的BO/YB24/17/CH株(登錄號為MN912513.1和MN912514.1)。Hexon基因之間的核苷酸和氨基酸相似性分別為90.10%～100.00%和92.9%～100.0%，fiber基因之間的核苷酸和氨基酸相似性分別為83.17%～100.00%和71.27%～100.00%。對BAdV-3基因組以及完整的hexon和fiber基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，中國的兩株BAdV-3毒株與國外毒株有明顯差異，聚為不同的分支上，表明BAdV-3在我國有不同的遺傳進(jìn)化方向(圖2、圖3)。

GenBank登錄號和病毒名稱的縮寫在分支的末端(B.牛；C.犬；F.禽；Fr.青蛙；H.人；O.羊；P.豬；T.火雞；WS.白鱘；■.中國毒株 HLJ0955 的序列)

A.Hexon基因進(jìn)化分析；B.Fiber基因進(jìn)化分析；GenBank登錄號和病毒名稱的縮寫在分支的末端(B.牛；C.犬；F.禽；Fr.青蛙；H.人；O.羊；P.豬；T.火雞；WS.白鱘；▲.BO/YB24/17/CH毒株；■.HLJ0955毒株)

1.4 體外培養(yǎng)特性

BAdV-3 能夠在牛腎細(xì)胞系(MDBK)生長良好，也能在牛鼻甲細(xì)胞(BTu)、鹿鼻甲細(xì)胞(DTu)、牛甲狀腺細(xì)胞(CTY)、牛睪丸細(xì)胞(CT)中增殖[40-42],并產(chǎn)生特征性細(xì)胞病變：細(xì)胞腫脹變圓，顆粒增多，折光性變強(qiáng)，拉絲、細(xì)胞膜萎縮聚集，形成嗜堿性或嗜酸性核內(nèi)包涵體，最后自瓶壁脫落。牛腎細(xì)胞系是BAdV-3最易感的細(xì)胞系，因此作為常用的體外細(xì)胞模型。

2 BAdV-3流行與病毒分離

自1965年Darbyshire等[43]首次從健康牛結(jié)膜中分離到BAdV-3，BAdV-3已在多個(gè)國家被檢出，包括英國、美國、日本、伊朗、土耳其、芬蘭、巴西、中國等，地域涵蓋亞洲、歐洲、非洲、南美洲、北美洲[9,44-46]。血清學(xué)調(diào)查顯示在伊朗、波蘭、比利時(shí)等地的牛群中抗體陽性率為46.7%～61.9%[47-49]，而Yeilba等[50]對土耳其部分牛場的未免疫的牛群進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查，研究表明 BAdV-3特異性中和抗體陽性率竟高達(dá)92.3%。最近日本學(xué)者Ng等[8]對50頭有BRDC癥狀的加州乳牛通過宏基因組學(xué)的方法對其鼻拭子中的病毒進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示BAdV-3在鼻腔分泌物中陽性檢出率高達(dá)48%，與BRDC的發(fā)生顯著相關(guān)(P<0.000 1)，說明BAdV-3不僅呈現(xiàn)高檢出率，并且與呼吸道疾病的發(fā)生有緊密聯(lián)系。2009年，國內(nèi)首次報(bào)道從黑龍江的1頭患有呼吸道疾病病牛的鼻拭子中分離到1株BAdV-3，證實(shí)了國內(nèi) BAdV-3 的存在[51]。隨后嚴(yán)昊等[52]對哈爾濱市周邊地區(qū)的牛場進(jìn)行了檢測，BAdV-3 血清陽性率為20.6%。2015年，楊萌[53]對我國咸陽市部分奶牛場進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，陽性率為46.65%，說明BAdV-3已在國內(nèi)普遍流行。2018年，本實(shí)驗(yàn)室對四川省11個(gè)引種肉牛場中患BRDC的牛進(jìn)行檢測，對采集的108份BRDC臨床樣本進(jìn)行熒光定量PCR檢測，BAdV-3檢出率高達(dá)78.7%，并成功分離到1株fiber基因存在缺失和變異的BAdV-3毒株(BO/YB24/17/CH)，其在fiber shaft區(qū)域缺失79個(gè)氨基酸并有55個(gè)獨(dú)特的氨基酸替換，knob 區(qū)域有16個(gè)獨(dú)特的氨基酸替換(圖4)。進(jìn)一步流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示該缺失株在引種肉牛中普遍存在，且來自5個(gè)省區(qū)(山東、遼寧、山西、黑龍江和內(nèi)蒙古自治區(qū))，具有廣泛的地域分布，這可能反映了BAdV-3在我國具有獨(dú)特的進(jìn)化趨勢[10]。并且張穎慧等[54]對這批BRDC樣本進(jìn)行混合感染調(diào)查，結(jié)果共檢測出9種呼吸道常見病原，包括牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛支原體(M.bovis)和溶血性曼氏桿菌(M.haemolytica)等，表明BAdV-3常與其他病毒混合感染。此外，BAdV-3除了感染牛外，在異種動(dòng)物山羊、綿羊以及羊駝中也有檢測到BAdV-3陽性抗體，表明BAdV-3可能存在跨種間傳播[55-56]。

虛線表示BO/YB24/17/CH的軸區(qū)192～270位氨基酸缺失；黑框內(nèi)顯示BO/YB24/17/CH與所有現(xiàn)有的9個(gè)BAdV-3完整fiber序列相比獨(dú)特的氨基酸突變

3 BAdV-3的致病性

BAdV-3在自然條件下主要感染牛，常常伴隨其他呼吸道病原混合感染，單獨(dú)感染時(shí)臨床表現(xiàn)輕微，主要引起呼吸道癥狀和腸道癥狀。不同年齡的牛均可感染BAdV-3，但不同年齡表現(xiàn)出的癥狀有所不同，成年牛通常無癥狀或僅有溫和的上呼吸道癥狀，犢牛則可表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀。對新生犢牛進(jìn)行人工攻毒試驗(yàn)，可導(dǎo)致犢牛出現(xiàn)肺炎、雙向熱、呼吸困難、食欲減退等癥狀[57]。BAdV-3感染牛的病理變化主要局限于肺，組織病理學(xué)變化表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤、壞死性支氣管炎，Ⅱ型肺泡細(xì)胞增生、肺泡壁增厚等[58]。Narita 等[59]通過支氣管插管的方法對1周齡和3月齡的小牛進(jìn)行BAdV-3攻毒試驗(yàn)，攻毒后均出現(xiàn)壞死性支氣管炎和肺泡炎，并伴有炎癥細(xì)胞的浸潤和Ⅱ型肺細(xì)胞增生，僅在一周齡小牛退化的上皮細(xì)胞中檢測到核內(nèi)包涵體、BAdV-3抗原和病毒顆粒。此外，BAdV-3還對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有致病性。Mittal等[60]通過滴鼻接種棉鼠發(fā)現(xiàn)，BAdV-3能夠在棉鼠肺和氣管有限復(fù)制，病理組織學(xué)變化表現(xiàn)為肺泡上皮細(xì)胞脫落和壞死、支氣管上皮細(xì)胞增生、嗜酸性包涵體、肺泡內(nèi)Ⅱ型增生性肺炎以及淋巴細(xì)胞浸潤，與BAdV-3在牛上的癥狀一致。史鴻飛[61]對中國分離到的BAdV-3 HLJ0955株進(jìn)行致病性的研究，分別人工感染了BALB/c小鼠和豚鼠，發(fā)現(xiàn)病毒主要在肺進(jìn)行復(fù)制，且病毒在豚鼠體內(nèi)存在的時(shí)間更長、病毒載量也更高，豚鼠對BAdV-3的敏感性顯著高于BALB/c小鼠。用分離得到的fiber基因缺失株對BALB/c小鼠進(jìn)行致病性研究，發(fā)現(xiàn)病毒能造成肺出血點(diǎn)和脾腫大，且可以在小鼠全身各個(gè)組織器官及血液內(nèi)被檢測到，這與之前報(bào)道該病毒僅限于肺組織增殖有所不同，這可能與fiber基因變異導(dǎo)致病毒組織嗜性發(fā)生改變有關(guān)[10]。

4 BAdV-3檢測技術(shù)

由于引起牛呼吸系統(tǒng)感染的病毒性疾病在臨床癥狀上都比較相似，表現(xiàn)為呼吸困難、精神倦怠、食欲不振等，很難從臨床表現(xiàn)上將這些病毒感染加以區(qū)分。因此，必須依靠實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行檢測。目前主要從病原學(xué)檢測和抗體檢測來對BAdV-3感染進(jìn)行診斷，這些方法的建立為BAdV-3的病原學(xué)和流行病學(xué)調(diào)查提供了重要工具。

4.1 病原檢測

病原學(xué)的方法主要包括病毒分離、PCR方法、基于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的雙抗體夾心法等。病毒分離是最經(jīng)典也最直觀的實(shí)驗(yàn)室檢測和鑒定病毒的方法，目前已有報(bào)道BAdV-3能夠從健康牛結(jié)膜中、病牛的呼吸道分泌物、眼分泌物、糞便中分離得到[43,51,53]。但該方法由于采樣的時(shí)間不確定，樣本中病毒的滴度可能很低且不穩(wěn)定，所以使得該方法靈敏度不高。

PCR技術(shù)相對于其他方法，具有敏感性高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠快速區(qū)分BAdV-3和其他病原。目前已有針對該病毒的普通PCR、Real-time PCR、套式PCR等多種分子生物學(xué)檢測方法。朱遠(yuǎn)茂等[51]針對E2A區(qū)域的DNA結(jié)合蛋白基因序列設(shè)計(jì)了一對特異性引物用于普通PCR對病毒的檢測，該方法雖然檢測成本低，但是耗時(shí)較長且檢測靈敏度較低。史鴻飛[61]針對E3區(qū)域建立了基于TaqMan MGB探針的Real-time熒光定量PCR，隨后Ng等[8]通過宏基因測序獲得BAdV-3 hexon的基因序列，并用一種含ZEN雙淬滅基團(tuán)的探針法Real-time PCR對樣本進(jìn)行BAdV-3復(fù)核。探針法方便快速、靈敏度高，但是合成探針的成本較高，不宜推廣。Shen等[10]在此基礎(chǔ)上建立了以hexon作為靶點(diǎn)的TB Green染料的Real-time PCR方法，該方法特異性雖不及探針法，但檢測成本低，靈敏度高，適用性更強(qiáng)。由于牛腺病毒存在不同的血清型且往往與其他牛呼吸道病毒混合感染，Motes等[62]針對不同血清型的牛腺病毒的hexon基因建立了套式PCR方法用于牛腺病毒的分型，Kishimoto等[63]開發(fā)了一套牛呼吸道疾病相關(guān)病原的Real-time PCR檢測系統(tǒng)，可同時(shí)檢測BAdV-3等16種牛呼吸道病原。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行抗原抗體檢測的方法，是免疫學(xué)經(jīng)典方法之一。Isakova等[64]用BAdV-3 Hexon單克隆抗體和幾種不同的哺乳動(dòng)物腺病毒Hexon多克隆抗體建立了雙抗體夾心法，能夠檢測不同血清型腺病毒，檢測范圍在10-9和10-8g·mL-1。嚴(yán)昊[52]利用重組Hexon蛋白制備抗體，建立了雙抗體夾心法用于檢測 BAdV-3病原, 該方法的靈敏度為101.8TCID50·mL-1，與PCR檢測結(jié)果符合率為95%，用該方法對黑龍江省哈爾濱市附近牛群進(jìn)行抽檢，隨機(jī)采取102份鼻拭子樣本，共檢出21份陽性樣品，陽性率為20.6%。

4.2 抗體檢測

針對BAdV-3抗體檢測方法主要是基于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的間接ELISA法，Pardon、Krzysiak、Roshtkhari、Yeilba等分別通過建立間接ELISA方法對比利時(shí)、波蘭、伊朗、土耳其暴發(fā)呼吸道疾病的部分牛場展開血清學(xué)調(diào)查，BAdV-3抗體陽性率分別為46.7%、60.2%、61.9%、92.3%[47-50]。楊萌[53]通過制備的全病毒作為包被抗原，建立了檢測牛腺病毒的間接 ELISA 方法，并用該方法對咸陽市部分奶牛場進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，平均陽性率為46.65%。該方法靈敏度高，特異性好，但操作相對PCR方法較繁瑣，且交互反應(yīng)發(fā)生的概率較高。

5 展 望

BAdV-3作為引發(fā)BRDC的一個(gè)重要病毒性病原，在我國牛群中已經(jīng)普遍存在，但目前國內(nèi)有關(guān)BAdV-3的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究還很薄弱，今后的研究重點(diǎn)可以集中在以下幾個(gè)方面：1)應(yīng)加強(qiáng)對BAdV-3的分子流行病學(xué)調(diào)查，進(jìn)一步對病毒進(jìn)行分離鑒定、分子特征分析；2)在致病機(jī)制上，有報(bào)道證實(shí)人腺病毒感染呼吸道上皮細(xì)胞以及禽腺病毒感染肝細(xì)胞后能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬[65-66]。但目前直接有關(guān)BAdV-3致病機(jī)制的報(bào)道還太少，需要進(jìn)一步開展研究。3)隨著BAdV-3新的基因缺失和替換株的出現(xiàn)，可能會(huì)導(dǎo)致其組織嗜性的改變以及影響中和抗體的產(chǎn)生，這些均可導(dǎo)致病毒致病性發(fā)生改變。下一步應(yīng)對基因變異與致病性之間的聯(lián)系展開研究。4)最近有報(bào)道顯示腺病毒感染能夠抑制宿主的先天免疫反應(yīng)[67-68]。結(jié)合我們的研究結(jié)果，BAdV-3感染引起B(yǎng)ALB/c小鼠脾腫大，這說明BAdV-3感染能對宿主的免疫應(yīng)答造成影響。而臨床上BAdV-3多呈混合感染，是否其對宿主免疫功能的抑制促進(jìn)了其他病原菌的繼發(fā)感染值得進(jìn)一步研究。5)在應(yīng)用研究上，由于腺病毒具有易感染性，宿主范圍廣，毒性低，可以承接大片段基因等特點(diǎn)，常被用來研究開發(fā)疫苗載體，這是BAdV-3一個(gè)潛在的應(yīng)用方向[69]。而目前針對BAdV-3自身的疫苗還很少，國內(nèi)尚無合適的疫苗用于預(yù)防和控制本病。因此研發(fā)新的疫苗和相應(yīng)診斷制劑具有重大的意義。