吳滔 陳楚濤 楊莉娟 鄒耀威 馬劍達 徐延卉 賈磊 戴冽

【摘要】目的 探討血清學(xué)自身抗體陰性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者抗氨基甲?；鞍祝–arP）抗體水平及其臨床意義。方法 納入301例RA患者及55名健康體檢者作為正常對照。收集患者的人口學(xué)特征和臨床資料包括血清RF和抗環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體水平，采用ELISA檢測IgG型抗CarP抗體水平。結(jié)果 根據(jù)正常對照組的第95個百分位數(shù)確定抗CarP抗體滴度的正常參考值范圍為 ≤31 U/ml。在301例RA患者中，RF、抗CCP抗體及抗CarP抗體陽性率分別為74.8%（225/301）、75.1%（226/301）和15.9%（48/301）。其中RF陰性的RA患者、抗CCP抗體陰性的RA患者抗CarP抗體的陽性率分別為19.7%（15/76）和20.0%（15/75）。在RF陰性的RA患者中，若增加抗CCP抗體的檢測，可使抗體陰性的RA患者減少39.5%（30/76）;若增加抗CarP抗體的檢測，可使抗體陰性的RA患者減少19.7%（15/76）;若同時增加抗CCP抗體和抗CarP抗體的檢測，可使抗體陰性的RA患者減少50.0%（38/76）。在46例RF和抗CCP抗體均陰性的血清陰性RA患者中，若增加抗CarP抗體的檢測，可使血清陰性的RA患者減少17.4%（8/46）。結(jié)論 臨床上增加抗CarP抗體的檢測對血清學(xué)自身抗體陰性RA患者具有一定的補充診斷價值，血清陰性RA的診斷仍是臨床目前的難點。

【關(guān)鍵詞】類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;抗氨基甲?；鞍卓贵w;類風(fēng)濕因子;診斷;抗環(huán)瓜氨酸肽抗體

【Abstract】Objective To probe into the level and clinical significance of anti-carbamylated protein （CarP） antibody in serologically negative patients with rheumatoid arthritis （RA）. Methods A total of 301 RA patients and 55 healthy controls were recruited. Demographic characteristics and clinical data including serum levels of rheumatoid factor （RF） and anti-cyclic citrullinated peptide （CCP） antibody were collected. Serum levels of IgG anti-CarP antibody were determined by ELISA. Results According to the 95th percentile of the anti-CarP antibody level in 55 healthy controls， the ceiling of normal value was ≤31 U/ml. Among 301 RA patients， the positive rates of RF， anti-CCP antibody and anti-CarP antibody were 74.8% （225/301）， 75.1% （226/301） and 15.9% （48/301）， respectively. The positive rates of anti-CarP antibody were 19.7% （15/76） in RA patients with negative RF and 20.0% （15/75） in RA patients with negative anti-CCP antibody， respectively. In negative-RF RA patients， additional detection of anti-CCP antibody could reduce the percentage of serologically negative RA patients by 39.5% （30/76）. Additional detection of anti-CarP antibody could lower the percentage by 19.7% （15/76）. Additional detection of both anti-CCP antibody and anti-CarP antibody could decrease the percentage by 50.0% （38/76）. In serologically negative RA patients （negative for both RF and anti-CCP antibodies）， additional detection of anti-CarP antibody could lower the percentage of serologically negative RA patients by 17.4% （8/46）. Conclusion Additional detection of anti-CarP antibody has supplementary value for the diagnosis of serologically negative RA which is currently a difficult issue in clinical practice.

【Key words】Rheumatoid arthritis; Anti-carbamylated protein antibody; Rheumatoid factor; Diagnosis;Anti-cyclic citrullinated peptide antibody

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種常見的慢性炎癥性自身免疫病，主要表現(xiàn)為受累關(guān)節(jié)滑膜炎癥以及進行性且不可逆性軟骨或骨破壞。然而，臨床尚無有效的針對逆轉(zhuǎn)軟骨或骨破壞的治療手段，因此RA的早期診斷與治療尤為重要[1]。目前與RA診斷相關(guān)的血清學(xué)自身抗體主要有RF、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（抗CCP抗體），且均已納入2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（ACR/EULAR）聯(lián)合修訂的早期RA分類標準，對早期RA的識別和診斷具有較高的臨床實用價值[2]。然而，臨床上仍有1/4～1/3的RA患者RF及抗CCP抗體呈血清學(xué)陰性，容易被漏診、誤診。這部分患者是目前臨床RA診斷的難點，因此探索新型自身抗體的補充診斷價值尤為迫切[3]。

2011年Shi等[4]將氨基甲?；ヅＱ遄鳛榉磻?yīng)抗原，首次發(fā)現(xiàn)在RA患者血清中存在抗氨基甲?；鞍卓贵w（抗CarP抗體），并且發(fā)現(xiàn)在臨床前期RA及確診RA患者的血清均能檢測出抗CarP抗體，為RA的實驗室診斷提供了新的指標。目前國內(nèi)關(guān)于抗CarP抗體的臨床研究較少[5]。本研究采用ELISA對RA患者血清的抗CarP抗體進行了檢測，旨在了解RA患者抗CarP抗體水平及其臨床意義。

對象與方法

一、研究對象

納入2011年12月至2018年7月在我科就診的RA患者，其診斷均符合2010年ACR/EULAR聯(lián)合修訂的早期RA分類標準[2]。排除合并其他風(fēng)濕性疾?。ㄈ鏢LE、系統(tǒng)性硬化病、皮肌炎等）、嚴重感染、器官功能衰竭或惡性腫瘤的患者。正常對照組選自同期我院的健康體檢者。本研究獲中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院倫理委員會批準（SYSEC-2009-06和SYSEC-KY-KS-012），所有參與者均已簽署知情同意書。

二、臨床資料收集

收集RA患者的人口學(xué)特征和臨床資料，包括年齡、性別、病程及RA疾病活動指標，RA活動指標包括28個腫脹關(guān)節(jié)數(shù)（28SJC）、28個壓痛關(guān)節(jié)數(shù)（28TJC）、患者總體病情活動度評估（PtGA，0～10 cm）、醫(yī)生總體病情活動度評估（PrGA，0～10 cm）、疼痛視覺模擬評分（VAS， 0～10 cm）、ESR、CRP，并計算基于CRP的28個關(guān)節(jié)疾病活動度評分（DAS28-CRP）、簡化疾病活動指數(shù)（SDAI）和臨床疾病活動指數(shù)（CDAI）。根據(jù)CDAI，將RA病情活動度分為緩解期（CDAI≤2.8）、低度活動期（2.822.0）。

三、RF、抗CCP抗體和抗CarP抗體水平的檢測

RA患者和正常對照組入組的同時留取血清，?80 ℃凍存。RF采用散射比濁法檢測（德國西門子公司），正常參考值范圍為0～20 IU/mL?？笴CP抗體采用ELISA檢測（德國AESKU公司），正常參考值范圍為0～18 IU/mL。RF和抗CCP抗體均陰性為血清陰性RA患者，RF和（或）抗CCP抗體陽性則為血清陽性RA患者。RA患者和正常對照組血清中的IgG型抗CarP抗體采用ELISA測定（美國ABSCI-BIO公司）。用標準品的吸光度作為Y軸、濃度作為X軸建立標準曲線。樣本的抗CarP抗體濃度根據(jù)標準品的標準曲線得出，抗CarP抗體滴度的正常參考值范圍定義為正常對照組抗CarP抗體水平的第95個百分位數(shù)。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的連續(xù)變量資料以? 表示，組間比較采用t檢驗。非正態(tài)分布的連續(xù)變量資料，以M（P25， P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。分類變量以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、RA患者的一般情況

本研究共納入RA患者301例，其中女性238例（79.1%），年齡為（48.5±12.3）歲，中位病程48（13， 96）月。258例（85.7%）RA患者處于活動期，66例（21.9%）為低度活動期，101例（33.6%）為中度活動期，91例（30.2%）為高度活動期。血清陰性 RA患者共46例，占15.3%。與血清陽性RA患者相比，血清陰性 RA患者中女性占比高（91.3% vs. 76.9%）， 而其病情活動指標包括PtGA（3 cm vs. 5 cm）、疼痛VAS（3 cm vs. 4 cm）、ESR（24 mm/h vs. 41 mm/h）、CRP（5.6 mg/L vs. 10.4 mg/L）均較低（P均< 0.05），見表1。

二、抗CarP抗體滴度正常參考值范圍的確定

共納入55名健康體檢者作為正常對照組，其中女40名（72.7%），年齡為（38.3±12.0）歲。以每份標準品（0、2、4、8、16、32、64 U/ml）的吸光度為Y軸，以相應(yīng)的濃度為X軸建立標準曲線，讀取樣本抗體的濃度。由于正常對照組的抗CarP抗體滴度呈非正態(tài)分布，因此采用第95個百分位數(shù)確定抗CarP抗體滴度的正常參考值范圍為≤31 U/mL，見圖1。

三、RA患者抗CarP抗體的分布情況

301例RA患者中，RF、抗CCP抗體及抗CarP抗體陽性率分別為74.8%（225/301）、75.1%（226/301）和15.9%（48/301）。RF陽性和RF陰性RA患者抗CarP抗體的陽性率分別為14.7%（33/225）和19.7%（15/76），兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ? = 1.090，P = 0.297）?？笴CP抗體陽性和抗CCP抗體陰性的RA患者抗CarP抗體的陽性率分別為14.6%（33/226）和20.0%（15/75），兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ? = 1.224，P = 0.269）。血清陽性和血清陰性的RA患者抗CarP抗體的陽性率分別為15.7%（40/225）和17.4%（8/46），兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ? = 0.085，P = 0.771），見圖2。

四、抗CarP抗體對血清陰性RA患者的補充診斷價值

301例RA患者中，若檢測抗CarP抗體，陽性率為15.9%（48/301）。RF陰性的RA患者76例（25.2%），若增加抗CCP抗體的檢測，則可以使抗體陰性的RA患者減少39.5%（30/76）;若增加抗CarP抗體的檢測，則可以使抗體陰性的RA患者減少19.7%（15/76）;若同時增加抗CCP抗體和抗CarP抗體的檢測，則可使抗體陰性的RA患者減少50.0%（38/76），見圖3。而在46例RF和抗CCP抗體均陰性的血清陰性RA患者中，增加抗CarP抗體檢測，則可使血清陰性的RA患者減少17.4%（8/46）。

討論

RA患者在出現(xiàn)臨床癥狀、影像學(xué)及組織學(xué)變化前，即可在血清中檢測到RA相關(guān)的自身抗體。RF是最早發(fā)現(xiàn)的RA自身抗體，可見于70%的RA患者，但特異性不強。它也可出現(xiàn)在RA以外的多種風(fēng)濕性疾病和非風(fēng)濕性疾病中，在約5%的正常人血清中也可檢測到低滴度的RF?？笴CP抗體是于1998年被發(fā)現(xiàn)的另一種RA自身抗體，對RA的診斷具有較高的靈敏度和特異度，并且可在RA患者臨床癥狀前4.5（0.1，13.8）年檢測到，更有利于RA患者的早期診斷[6]。近年研究者發(fā)現(xiàn)，翻譯后蛋白修飾產(chǎn)生自身抗體是RA的重要發(fā)病機制，修飾主要包括瓜氨酸化、氨甲?；?、乙酰化、甲基化、磷酸化等。除了RF和抗CCP抗體外，RA患者血清中還可檢測到多種針對不同修飾蛋白的新型自身抗體，如抗突變型瓜氨酸波形蛋白（MCV）抗體、抗肽基精氨酸脫亞胺酶4（PAD4）抗體、抗瓜氨酸化α烯醇化酶多肽1（CEP-1）抗體和抗CarP抗體等[7]。這些新型自身抗體的檢測是今后RA早期診斷、鑒別診斷、判斷疾病的嚴重程度及預(yù)后評估等方面的重要研究方向。例如抗MCV抗體，有研究提示其對RA的診斷價值并不優(yōu)于抗CCP抗體[8]。但在筆者團隊的既往研究中，其對RA患者尤其是血清陰性的RA患者具有重要的補充診斷價值，并且與RA患者1年放射學(xué)關(guān)節(jié)破壞進展相關(guān)[9-10]?？筂CV抗體不僅能對RA診斷起到補充作用，也有助于評估病情活動及預(yù)測預(yù)后。

抗CarP抗體也屬于翻譯后蛋白修飾抗體，是由氨基甲?；a(chǎn)生的自身抗體。氨基甲?；倪^程由氰化物介導(dǎo)，使賴氨酸轉(zhuǎn)化為高瓜氨酸[11-13]。在生理條件下，人體內(nèi)氰酸鹽含量很低，并與尿素形成化學(xué)平衡。但在某些情況，如尿素水平升高、吸煙、炎癥等，均可引起氰化物水平升高，繼而導(dǎo)致氨基甲?；皆黾?，引起蛋白質(zhì)和細胞功能障礙，并可破壞機體免疫耐受，導(dǎo)致抗CarP抗體的產(chǎn)生[12， 14]。文獻報道，在14%～53%的RA患者血清中可檢測到抗CarP抗體，其中以抗氨基甲?；奶ヅＱ蹇贵w、抗氨基甲?；睦w維蛋白原抗體和抗氨基甲?；牟ㄐ蔚鞍卓贵w這3種類型最為多見[11， 15]。RA患者在出現(xiàn)早期癥狀或明確診斷之前即可在血清中檢測到抗CarP抗體，且抗CarP抗體存在于幾乎所有抗CCP抗體陽性以及10%～20%的抗CCP抗體陰性的RA患者體內(nèi)[11]。本研究顯示，RA患者抗CarP抗體的陽性率為15.9%，在抗CCP抗體陰性的RA患者中也有20%的患者抗CarP抗體陽性;但在抗CCP抗體陽性的RA患者中，抗CarP抗體的陽性率僅為14.6%，與國外文獻報道不一致，提示不同地區(qū)、種族之間，抗CarP抗體可能存在一定的差異。

胎牛血清中含有氨基甲?；鞍踪|(zhì)的混合物，因此實驗室最常使用胎牛血清作為抗原檢測抗CarP抗體[11， 13]。亦有研究者使用其他的CarP，如絲蛋白、波形蛋白、烯醇酶和膠原作為抗原[11]。國外文獻大多數(shù)報道用胎牛血清氰酸化孵育過夜作為包被抗原，建立ELISA檢測體系，但有文獻提出此抗原制備法得到的CarP水平較低且不穩(wěn)定[16]。另外，由于組成抗原表位的高瓜氨酸殘基的相鄰結(jié)構(gòu)可能存在差異，后續(xù)誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗CarP抗體識別的抗原表位、親和力及結(jié)合活性不盡相同，導(dǎo)致抗CarP抗體在RA患者中的陽性率出現(xiàn)較大差異[4]。因此在抗CarP抗體作為臨床診斷指標前，亟需優(yōu)化CarP抗原的制備程序，同時完善檢測體系，以得到更準確、穩(wěn)定的結(jié)果。此外，對于抗CarP抗體的正常參考值范圍的確定尚無統(tǒng)一的標準。目前較常見的正常上限截斷值為正常人抗CarP抗體滴度平均值+2個標準差或第95個百分位數(shù)[7]。正常參考值范圍的確立亦會影響診斷的陽性率，因此，納入足夠樣本的正常中國人數(shù)據(jù)、確定更精確的抗CarP抗體正常界值亦是保障該領(lǐng)域研究進展的基石。

Verheul等[17]的研究顯示，RF、抗CCP抗體和抗CarP抗體同時陽性幾乎僅出現(xiàn)在RA患者中，而在其他類型的早期關(guān)節(jié)炎中非常罕見，對早期關(guān)節(jié)炎的鑒別診斷起到了極大的作用，對于RA的診斷具有極高的特異度（98%～100%），提示在RF和抗CCP抗體的基礎(chǔ)上檢測抗CarP抗體對于潛在RA患者的識別、早期關(guān)節(jié)炎的鑒別診斷及臨床RA的診斷都具有一定的價值。本研究顯示，在RF和抗CCP抗體均呈陰性的血清陰性RA患者中抗CarP抗體的陽性率為17.4%，即在檢測RF和抗CCP抗體的基礎(chǔ)上增加抗CarP抗體的檢測可進一步識別17.4%的血清學(xué)陰性RA。然而，荷蘭萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心前瞻性隊列研究納入838例未分化關(guān)節(jié)炎患者的隨訪結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基線檢測抗CarP抗體未能提高RA早期診斷的準確性，提示抗CarP抗體對未分化關(guān)節(jié)炎發(fā)展為早期RA的預(yù)測價值仍有待進一步研究[18]。另外，對于明確診斷的RA患者，抗CarP抗體與DAS28評分之間的關(guān)系尚不明確。研究者發(fā)現(xiàn)，抗CarP抗體陽性與RA患者的關(guān)節(jié)破壞進展相關(guān)[19]。一項針對3個歐洲人群的縱向隊列研究結(jié)果提示，抗CarP抗體陽性會增加RA患者的總病死率，提示抗CarP抗體對于RA患者的預(yù)后有一定的預(yù)測價值[20]。

總之，作為RA自身抗體的新型標志物，抗CarP抗體的檢測對血清學(xué)陰性RA患者具有一定的補充診斷價值，并且在病情評估及預(yù)后預(yù)測方面有一定的潛力，值得今后進一步進行大樣本且長期的前瞻性研究。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-09-01）

（本文編輯：林燕薇）