陳偉華 李超 林德輝 譚煥民

【摘要】目的：探討猴頭菇多糖（HEP）聯(lián)合順鉑（DDP）抑制肺腺癌的作用。方法：采用 MTT 法檢測不同濃度 HEP 分別作用肺腺癌細(xì)胞株48 h、72 h 的細(xì)胞抑制率，不同濃度 DDP 作用肺腺癌細(xì)胞株48 h 的細(xì)胞抑制率，及 HEP 聯(lián)合 DDP 作用肺腺癌細(xì)胞株48 h 的細(xì)胞抑制率。設(shè)對照組、HEP 組、DDP 組和聯(lián)合組，觀察 HEP 聯(lián)合 DDP 對移植瘤的作用，采用 ELISA 法檢測各組裸鼠血清中 IL-2水平。結(jié)果： HEP 對肺腺癌細(xì)胞具有一定的抑制作用，且具有時間和濃度依賴性。 DDP 能顯著抑制肺腺癌細(xì)胞。HEP 可以促進(jìn) DDP 對于肺腺癌細(xì)胞和裸鼠移植瘤的抑制作用，可減輕 DDP 對裸鼠體重的影響。HEP 組和聯(lián)合組小鼠血清中 IL-2水平顯著高于 DDP 組。結(jié)論：猴頭菇多糖可有效增強(qiáng)順鉑的抗肺腺癌作用，并減輕其不良反應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】猴頭菇多糖;肺腺癌;順鉑;IL-2

[中圖分類號]R285.5[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]2096-5249（2022）01-0012-04

Effect ofHericiumerinaceus polysaccharide combined with cisplatin on lung adenocarcinoma

CHEN Wei-hua*， LI Chao， LIN De-hui， TAN Huan-min （Department of oncology，Anhua County Peoples Hospital， Yiyang Hunan413500， China）

[Abstract] Objective： To study the effect of Hericiumerinaceus polysaccharide combined with cisplatin on lung adenocarcinoma. Methods： MTT assay was used to detect the cell inhibition rates of the lung adenocarcinoma cell lines treated with HEP for 48 h and 72 h， DDP for 48 h， and HEP combined with DDP for 48 h. The effect of HEP combined with DDP on transplanted tumor was observed in the control group， the HEP group， the DDP group and the combined group. The serum levels of IL-2 in four groups were detected by ELISA. Results： HEP could inhibit the lung adenocarcinoma cells in a time and concentration-dependent manner. DDP could significantly inhibit the lung adenocarcinoma cells. HEP could promote the inhibitory effect of DDP on the lung adenocarcinoma cells and the transplanted tumors of the nude mice. Moreover， it could reduce the weight loss of nude mice in the DDP group. The serum levels of IL-2 in the HEP group and the combined group were significantly higher than that in DDP group. Conclusion： Hericiumerinaceus polysaccharide might effectively enhance the anti-tumor effect of cisplatin on lung adenocarcinoma.

[Key words] Hericiumerinaceus polysaccharide; Lung adenocarcinoma; Cisplatin; IL-2

猴頭菇，又名猴頭菌，性甘、平，是一種藥食兼用的真菌，其營養(yǎng)價值豐富。研究結(jié)果顯示，猴頭菇作用廣泛，其具有良好的抗氧化活性，可增強(qiáng)細(xì)胞的抗疲勞和抗衰老能力[1]，能增強(qiáng)免疫力[2]。猴頭菇多糖（Hericiumerinaceus polysaccharide， HEP）是猴頭菇中一種重要的活性成分，可以開發(fā)成免疫佐劑 [3]，抗?jié)冃越Y(jié)腸炎[4]。值得一提的是，猴頭菇多糖還有一定的抑制肺癌等腫瘤的作用[5-6]。目前肺癌的發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中均位列第一，其中最常見的類型為肺腺癌。根據(jù)2021版肺癌 NCCN 指南，針對不同基因突變，不斷有新的靶向藥物被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。但是對于沒有基因突變的晚期肺腺癌患者，標(biāo)準(zhǔn)治療仍然為以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療 [7]。因此本研究將從體外和體內(nèi)層面探討 HEP 與順鉑 DDP 在肺腺癌治療中是否具有協(xié)同作用，為臨床治療提供新思路。

1 材料

HEP 委托湖南省中醫(yī)藥大學(xué)提純制備，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 75.22%，使用前用細(xì)胞培養(yǎng)液配置，DDP（Sigma- Aldrich 公司）;人肺上皮細(xì)胞 BEAS -2B、肺腺癌細(xì)胞株株 A549、H1299均購自中南大學(xué)高等研究中心;BEGM Kit 培養(yǎng)液（美國 Lonza 公司），RMPI- 1640細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）（美國 Gibco 公司）;5周齡 BALB/c 雌性裸鼠（18±2）g，購自上海斯泰克實驗動物有限責(zé)任公司。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) BEAS -2B 用BEGMKit培養(yǎng)液， A549、H1299細(xì)胞用含有10% FBS 的 RMPI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5% CO2，37℃，飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。

2.2腫瘤細(xì)胞增殖實驗肺腺癌細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用胰酶消化，細(xì)胞計數(shù)后用細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個 /mL。取96孔板，每孔接種100 μL細(xì)胞懸液，孵育24 h 后，更換培養(yǎng)液為100μL 含有不同濃度測試藥物的新鮮培養(yǎng)液。每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)置純培養(yǎng)液為空白組，不加藥物的細(xì)胞懸液為對照組。將96孔板置于 CO2培養(yǎng)箱孵育48 h 或72 h 后，每孔加入10 μL新鮮配置的噻唑藍(lán)（MTT）溶液，孵育3～4 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μL 的 DMSO，用酶標(biāo)儀檢測492 nm 處的吸收值（A）。計算腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率 I（%），抑制率=[1-（A藥物-A空白）/（A 對照-A空白）]×100%。

2.3異種移植瘤裸鼠體內(nèi)實驗 A549細(xì)胞長至對數(shù)生長期，及時用胰酶消化，分別用 PBS 液洗滌 2次，不含血清的 RMPI-1640洗滌1次。再用不含血清的培基配成1×107個 /mL 的細(xì)胞懸液，每只注射100μL 于背部皮下。模型裸鼠隨機(jī)分組，分別腹腔注等量空白溶劑（對照組，n=6），猴頭菇多糖200 mL/kg（HEP 組，n=6），順鉑2 mg/kg（DDP 組，n=6）， HEP 200 mL/kg+DDP 2 mg/kg（聯(lián)合組，n=6）。HEP 和DDP 均為隔日給藥，連續(xù)給藥21d，結(jié)束實驗。

2.3.1檢測抑瘤率分別在給藥前、給藥14 d、21 d 記錄裸鼠體重。給藥前、給藥2周用游標(biāo)卡尺測量瘤體的長徑、短徑，根據(jù)體積（mm3）=長徑×短徑2 /2計算腫瘤體積，根據(jù)抑瘤率=（對照組平均體積-藥物組平均體積）/對照組平均體積×100%計算抑瘤率。

2.3.2白細(xì)胞介素（interleukin，IL）IL-2的檢測給藥21 d 后麻醉處死裸鼠，摘除眼球取血，提取血清。采用 ELISA 法檢測各組裸鼠血清中 IL-2含量。

2.4統(tǒng)計學(xué)方法使用 SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，所得結(jié)果用x ±s 表示，多組間數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1猴頭菇多糖對肺腺癌細(xì)胞株的抑制作用MTT 法常用來檢測不同物質(zhì)抑制細(xì)胞活力的作用強(qiáng)度。我們選用常見的人肺上皮細(xì)胞 BEAS-2B、肺腺癌細(xì)胞 A549、H1299細(xì)胞株，采用 MTT 法檢測0、4、8、16、32 μg/mL HEP 分別作用48 h、72 h 對細(xì)胞活力的影響。如圖1所示，HEP 對人肺上皮細(xì)胞BEAS-2B 基本無影響，但是對肺腺癌細(xì)胞具有一定的抑制作用，且具有時間和濃度依賴性。兩種肺腺癌細(xì)胞株的抑制率無明顯差異，但是在不同時間點， A549細(xì)胞的抑制率均大于 H1299細(xì)胞。

3.2DDP 對肺腺癌細(xì)胞株的抑制作用如圖2所示，分別用為0、2、4、8、16、32 μM的 DDP 處理不同肺腺癌細(xì)胞48 h 后，其細(xì)胞增殖受到抑制。且隨著 DDP 濃度升高，A549細(xì)胞和 H1299細(xì)胞的抑制率均逐漸升高，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。通過計算，DDP 對 A549細(xì)胞和 H1299細(xì)胞的 IC50分別為5.19μM 和5.66μM。

3.3 HEP 聯(lián)合 DDP 對肺腺癌細(xì)胞株的抑制作用根據(jù)3.1、3.2的結(jié)果，HEP 和 DDP 對于 A549細(xì)胞株的抑制作用強(qiáng)于 H1299細(xì)胞株，因此我們選用 A549細(xì)胞株做后續(xù)實驗。我們分別選用0、8、16μg/mL 的 HEP 分別聯(lián)合0、4、8 μM的 DDP 作用肺腺癌，用 MTT 法檢測48 h 對細(xì)胞的抑制率。如表2所示，猴頭菇可以促進(jìn) DDP 對于肺腺癌細(xì)胞株的抑制作用，顯著高于相應(yīng)濃度單藥組（P<0.05）。

3.4 HEP 與 DDP 聯(lián)用對荷瘤裸鼠的作用根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，我們選擇 HEP 和 DDP 的實驗濃度分別為100 mg/kg、1 mg/kg。與對照組相比，14 d 開始DDP 對裸鼠體重有影響（P<0.05），但是 HEP 單獨應(yīng)用與 DDP 聯(lián)合應(yīng)用對裸鼠體重?zé)o明顯影響（P>0.05），詳見表3。藥物干預(yù)前對照組，DDP 組、HEP 組和聯(lián)合組的裸鼠腫瘤體積無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。治療14 d 開始，與對照組相比，DDP 組、聯(lián)合組移植瘤體積開始逐漸顯著減小（P<0.05），第21 d HEP 組移植瘤體積顯著減小，聯(lián)合組與 DDP 組間差異顯著，詳見表4。

3.5不同組別裸鼠血清 IL-2含量變化與對照組比較，HEP 組和聯(lián)合組小鼠血清中 IL -2水平比 DDP 組高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），詳見表5。

4 討論

研究表明許多傳統(tǒng)植物中包含有效成分，提取的多糖作用非常廣泛：黃芪多糖有助于減少缺血再灌注人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，減輕氧化損傷，抑制炎癥介質(zhì)分泌[8];紅毛五加多糖可顯著激活小鼠巨噬細(xì)胞[9];白毛藤多糖和地參多糖具有抗腫瘤作用[10-11]。既往研究發(fā)現(xiàn)從猴頭菇中提取的多糖在腫瘤中具有一定的作用，可作為一種免疫佐劑促進(jìn)腫瘤疫苗的作用[12]，對 Lewis 肺癌也有一定的抑制作用。我們的實驗結(jié)果表明隨著猴頭菇多糖濃度的增加，其對于正常的支氣管上皮無影響，但對肺腺癌的抑制作用逐漸加強(qiáng)。

順鉑等鉑類藥物抗癌譜廣、作用性強(qiáng)。由于鉑類藥物為強(qiáng)蓄積性藥物，在治療惡性腫瘤有較大的毒性，容易產(chǎn)生腎毒性、消化道反應(yīng)以及骨髓抑制等副作用[13]。我們發(fā)現(xiàn)：與單用猴頭菇多糖、順鉑相比，猴頭菇多糖可增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤作用，且可以減輕順鉑對裸鼠體重的影響，說明猴頭菇多糖可能在一定程度上還能減輕順鉑的不良反應(yīng)。

IL-2是第一個被分子克隆的細(xì)胞因子，許多實驗表明 IL-2是 T 細(xì)胞增殖、生成效應(yīng)細(xì)胞和記憶細(xì)胞所必需的 T 細(xì)胞生長因子，能促進(jìn) Treg 細(xì)胞的生成、存活和功能活動，因此具有雙重和相反的功能，維持 Treg 細(xì)胞以控制免疫應(yīng)答和刺激常規(guī) T 細(xì)胞以促進(jìn)免疫應(yīng)答[14]。IL -2還可以刺激 NK 細(xì)胞活化、分化和增殖，且與其他細(xì)胞因子協(xié)同作用，放大免疫效應(yīng)。本實驗結(jié)果顯示猴頭菇多糖可明顯提高聯(lián)合組裸鼠血清中 IL-2水平，提示猴頭菇多糖可能通過提高 IL-2水平來促進(jìn)順鉑的抗腫瘤作用，但是其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

猴頭菇多糖由猴頭菇中提取，后者是一類常見易獲得的藥食兼?zhèn)涞氖澄?。我們的研究結(jié)果說明猴頭菇多糖可協(xié)同順鉑明顯抑制肺腺癌的生長，其遠(yuǎn)期應(yīng)用前景值得期待。我們將通過細(xì)胞實驗和已成功構(gòu)建的裸鼠成瘤模型，深入探討其具體作用通路和分子機(jī)制，為肺腺癌臨床治療提供新的有效方案。

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基金項目：湖南省自然科學(xué)基金項目資助（編號：2018LL2002）

作者簡介：陳偉華（1977-），女，湖南益陽人，學(xué)士，湖南省安化縣人民醫(yī)院腫瘤科。

通信作者：陳偉華，E-mail：2625809700@qq.com。

（收稿日期：2021-12-7 接受日期：2021-12-17）