張 成，王玉婷，楊勇飛，柳 璇，吳錦艷，尚佑軍，李有文*

（1.塔里木大學動物科學學院 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學動物科學學院 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團南疆動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆阿拉爾 843300；3.中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730046）

羊痘（capripoxvirus disease）是由羊痘病毒引起一種羊口腔、唇部、乳房等部位出現(xiàn)痘疹的急性、烈性傳染病[1-2]。羊痘發(fā)病率高，羔羊感染率達到100%，病死率可達80%；成年羊病死率相對較低，但可引發(fā)其他病原微生物的感染[3-4]。羊痘在世界各地廣泛流行，羊痘病毒對我國的危害較為嚴重，尤其是在養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達的地區(qū)，可對我國養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[2]。山羊痘病毒是在胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制的雙鏈DNA病毒，電鏡下可觀察到卵圓形或磚形顆粒，大小約194～200 nm[5-8]，基因組中含有147個開放式閱讀框（open reading frame，ORFs），分為核心編碼區(qū)和側(cè)翼區(qū)。核心編碼區(qū)參與病毒復(fù)制、細胞內(nèi)成熟和細胞外包膜病毒體構(gòu)成和組裝、RNA修飾和病毒的轉(zhuǎn)錄[9]，而側(cè)翼區(qū)主要與病毒的毒力和宿主免疫逃避有關(guān)。

轉(zhuǎn)錄因子是一種特殊的蛋白質(zhì)，能夠調(diào)控基因、表達相關(guān)的功能蛋白，與啟動子中順式作用原件相互結(jié)合的DNA蛋白[10-12]。基因的前段含有轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）的結(jié)合位點，與轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合后對基因的表達具有一定的作用[13-17]。晚轉(zhuǎn)錄因子（VLTF）是生化反應(yīng)后期起理化作用的轉(zhuǎn)錄因子。羊痘病毒含有4個晚期轉(zhuǎn)錄因子，其中兩個中期轉(zhuǎn)錄因子VLTF-3（GTPV-099、115）均位于病毒的核心區(qū)。因此，轉(zhuǎn)錄因子在病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程中意義重大。本研究構(gòu)建了VLTF-1的原核表達載體并進行了蛋白表達，為進一步了解羊痘病毒晚轉(zhuǎn)錄因子1（VLTF-1）的生物學特性，系統(tǒng)研究羊痘病毒的轉(zhuǎn)錄機制和轉(zhuǎn)錄因子的功能、特性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山羊痘病毒SS株、原核表達的DH5α、BL21感受態(tài)細胞，保存于塔里木畜牧科技重點實驗室。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：PCR Mix（紐英侖生物科技公司）、Prime STAR聚合酶（大連寶生物科技公司）；EcoR1、Xho I等限制性內(nèi)切酶以及dNTPs、PCR試劑（Thermo生物科技公司）；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒（OMEGA生物科技有限公司）等。

主要儀器：干式恒溫箱（杭州奧盛儀器有限公司）、DK-8D電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、伯樂T100梯度PCR儀（北京智杰方遠有限公司）、凝膠成像分析系統(tǒng)（ChemiDoc XRS）。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank上發(fā)表的山羊痘病毒Pellor株（登錄號：NC-004003.1）的基因序列，利用DNAstare軟件對VLTF-1基因設(shè)計一對合理的、特異性強的引物。為便于載體構(gòu)建，在引物5'端添加酶切切位（劃線處）；引物送往上海生工生物工程股份有限公司合成。引物合成信息見表1。

表1 引物合成Tab.1 Primer synthesis table

1.3.2 羊痘病毒SS基因組的提取

取2 cm2的病料、5 mL維持液、0.5 mL青霉素、0.5 mL鏈霉素和適量高壓滅菌的石英砂，充分研磨病料后4℃保存過夜，4 000 r/min離心5min。取200～300μL按照Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒說明書提取DNA，檢測濃度。

1.3.3 目的基因PCR擴增及回收

以提取羊痘病毒SS株的基因組為模板，以特異VLTF-1F、VLTF-1R和primer star聚合酶擴增目的基因。

PCR反應(yīng)體系為（25μL）：模板1μL、引物F 0.5μL、引物R 0.5μL、buffer 5μL、dNTP 1μL、prime star酶1μL、ddH2O 16μL。

PCR擴增程序：95℃5 min，94℃45 s，52℃30 s，72℃90 s，40個循環(huán)。

擴增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，DNA凝膠回收試劑盒回收目的基因。

1.3.4 原核表達載體的構(gòu)建

1.3.4.1 酶切

將回收的VLTF-1基因片段和pET42b載體利用NdeⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切。

50μL酶切體系為：VLTF-1基因片段（載體）25μL、1×Buffer 5μL、NdeⅠ2μL、XhoⅠ2μL、ddH2O 16μL?；靹蚝蠓湃?7℃水浴鍋中酶切3 h，酶切的片段和pET42b載體切膠回收。

1.3.4.2 連接

在PCR管中加入酶切回收的7.5μLVLTF-1基因和1μL載體，加入0.5μL T4連接酶、1μL 10×Buffer混勻，16℃水浴過夜。

1.3.4.3 轉(zhuǎn)化與鑒定

將連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入已經(jīng)制備好的感受態(tài)細胞DH5α中，在含有氨芐西林（amoxicillin，AMP）抗性的LB平板37℃培養(yǎng)16 h，挑取單個菌落利用PCR鑒定。鑒定成功后，提取大量質(zhì)粒酶切鑒定。提取的質(zhì)粒送生工生物工程股份有限公司做測序鑒定，測序結(jié)果采用DNAstar軟件進行序列和遺傳進化分析。

1.3.5 VLTF-1的原核表達

經(jīng)鑒定陽性的原核表達載體轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞，挑取單菌落含有AMP抗性的LB平板培養(yǎng)皿，采用0.1 mmol/L IPTG進行誘導(dǎo)表達，12 000 r/min離心3 min去上清，沉淀加入25μL 5×buffer，煮沸10 min，采用SDSPAGE對蛋白的表達情況進行檢測。

1.3.6 Western Blot鑒定

誘導(dǎo)表達的VLTF-1經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，加入10 mL 5%的脫脂牛奶，4℃封閉過夜，TBST洗滌3次，每次5min。加入10 mL TBST1∶2 000稀釋鼠源一抗含GST標簽，室溫搖床孵育1～2 h，TBST洗滌3次，每次10 min。加入10 mL TBST1∶10 000稀釋的HRP羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗，室溫搖床孵育1 h，DAB染色觀察。

1.3.7 生物信息學分析

利用ProtParam、ProtScale、SignalP 4.1Server、NetPhos 3.1 Server、TMHMM Server v.2.0和SOPMA服務(wù)器對晚轉(zhuǎn)錄因子VLTF-1蛋白的生物信息進行系統(tǒng)的分析和研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 晚轉(zhuǎn)錄因子VLTF-1基因PCR產(chǎn)物電泳（見圖1）

圖1 晚轉(zhuǎn)錄因子VLTF-1基因PCR產(chǎn)物電泳Fig.1 Electrophoresis of PCR products of late transcription factor VLTF-1 gene

由圖1可知，目的基因通過PCR擴增并用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大小約783 bp，與理論大小相符。

2.2 pET42b載體PCR產(chǎn)物電泳（見圖2）

圖2 p ET42b載體PCR產(chǎn)物電泳Fig.2 Electrophoresis of PCR products of pET42b vector

由圖2可知，目的基因片段與pET42b載體構(gòu)建的表達載體用PCR檢測，結(jié)果與預(yù)期相符。

2.3 酶切VLTF-1質(zhì)粒產(chǎn)物（見圖3）

圖3 酶切VLTF-1質(zhì)粒產(chǎn)物Fig.3 Enzyme digestion of VLTF-1 plasmid product

由圖3可知，采用質(zhì)粒小提試劑盒提取構(gòu)建好的pET42b-GTPV-054質(zhì)粒，NdeⅠ、XhoⅠ酶切鑒定構(gòu)建成功。

2.4 序列分析

利用DNAMAN、DNAStar將目的基因與設(shè)計的引物和Pellor基因進行同源性分析，同源性為100%。

2.5 晚轉(zhuǎn)錄因子VLTF-1遺傳進化樹分析（見圖4）

由圖4可知，在NCBI上查找VLTF-1同源性接近的基因只有1個，利用DNAStar進行遺傳進化樹分析。結(jié)果顯示，目的基因與山羊痘毒株屬同一分支，其保守性較強，遺傳關(guān)系親近。

圖4 晚轉(zhuǎn)錄因子VLTF-1遺傳進化樹分析Fig.4 Genetic evolution tree analysis of late transcription factor VLTF-1

2.6 晚轉(zhuǎn)錄因子VLTF-1蛋白電泳及Western Blot檢測（見圖5、圖6）

圖5 晚轉(zhuǎn)錄因子VLTF-1蛋白表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳Fig.5 SDS-PAGE electrophoresis of late transcription factor VLTF-1 protein expression products

由圖5、圖6可知，對重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)BL21表達蛋白并進行活化、誘導(dǎo)表達蛋白，進行SDS-PAGE電泳和Western Blot鑒定，得到大小為27 kDa的蛋白，Western Blot檢測該蛋白特異性表達。

圖6 晚轉(zhuǎn)錄因子VLTF-1蛋白Western Blot鑒定Fig.6 Western Blot identification of late transcription factor VLTF-1 protein

2.7 晚轉(zhuǎn)錄因子VLTF-1蛋白親疏水性分析（見圖7）

由圖7可知，該蛋白含有260個氨基酸，分子式為：C1354H2133N353O388S15，分子量為30 ku，等電點為8.10，含有負電荷氨基酸29個，正電荷氨基酸31個，不穩(wěn)定系數(shù)46.17（＞40），說明VLTF-1蛋白屬于不穩(wěn)定性蛋白。脂肪族系數(shù)98.92，平均親水值-0.030，PoatScale服務(wù)器對晚轉(zhuǎn)錄因子VLTF-1蛋白的親疏水性分析，標度值在大于0的區(qū)域比較密集，結(jié)合親水值判斷該蛋白為親水性蛋白。

圖7 晚轉(zhuǎn)錄因子VLTF-1蛋白親疏水性分析Fig.7 Hydrophilicity analysis of late transcription factor VLTF-1 protein

2.8 晚轉(zhuǎn)錄因子VLTF-1蛋白信號肽、磷酸化位點及跨膜域結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析(見圖8、圖9）

圖8 晚轉(zhuǎn)錄因子VLTF-1蛋白的磷酸化位點Fig.8 Phosphorylation sites of late transcription factor VLTF-1 protein

圖9 晚轉(zhuǎn)錄因子VLTF-1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域Fig.9 Transmembrane domain of late transcription factor VLTF-1 protein

由圖8、圖9可知，利用signalP 4.1 Server服務(wù)器分析顯示，VLTF-1蛋白無信號肽；NetPhos 3.1 Server分析表明，當閾值為0.5時，晚轉(zhuǎn)錄因子VLTF-1蛋白有26個磷酸化位點，絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸磷酸化位點分別為18、5、3個；TMHMM Server v.2.0服務(wù)器分析表明，VLTF-1蛋白有1個跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.9 晚轉(zhuǎn)錄因子VLTF-1蛋白的二級結(jié)構(gòu)（見圖10）

圖10 晚轉(zhuǎn)錄因子VLTF-1蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.10 Secondary structure of late transcription factor VLTF-1 protein

由圖10可知，VLTF-1蛋白的二級結(jié)構(gòu)由27.31%的α-螺旋（h）、12.69%的β-轉(zhuǎn)角（t）、23.08%的無規(guī)則卷曲（c）和36.92%的延伸鏈（e）組成。

優(yōu)勢的抗原表位區(qū)域為：5～6、29～33、41～46、52～54、60～64、69～72、81～84、90～96、101～103、110～121、128～131、132～137、163～165、173～176、181～186、218～223、233～237、246～250、257～260。

3 討論

轉(zhuǎn)錄是在細胞核內(nèi)進行的、以堿基互補配對為原則、以DNA一條鏈為模板合成mRNA的過程，是蛋白生物合成的第一步。真核生物含有DNA復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄的機器，許多病毒依賴于宿主實現(xiàn)復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，故需要在細胞核中完成病毒轉(zhuǎn)錄。但在DNA病毒中，痘病毒科家族是例外，其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄均在細胞質(zhì)內(nèi)進行，需要病毒編碼因子參與成熟mRNA的產(chǎn)生過程，如RNA聚合酶因子Rpo147、Rpo132和轉(zhuǎn)錄因子VTF等。轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄過程中扮演關(guān)鍵的角色。痘病毒中，vRNAP能夠根據(jù)DNA模版催化合成RNA，但需要其他輔助因子。病毒早期基因的轉(zhuǎn)錄需要早期轉(zhuǎn)錄因子（異二聚體VETF），晚期轉(zhuǎn)錄時也需要VLTF。本研究主要對山羊痘病毒的晚轉(zhuǎn)錄因子VLTF-1蛋白原核表達和蛋白的基本特性進行簡單的研究，為進一步研究山羊痘病毒的機制和其他功能性蛋白提供參考。

羊痘病毒含有4個晚轉(zhuǎn)錄因子，本研究對其中之一的VLTF-1基因進行PCR擴增，得到其大小為783 bp。通過同源性比較發(fā)現(xiàn)，SS株的VLTF-1基因與印度綿羊的親緣關(guān)系最近為100%，推測此毒株可能由印度傳播到中國新疆。遺傳進化樹分析表明，羊痘病毒屬的3個種各分成一個分支，而SS株的VLTF-1基因與山羊痘病毒屬同一分支。對VLTF-1進行原核表達，SDS-PAGE電泳和Western Blot驗證得到大小為27 kDa的蛋白。但其以包涵體形式表達在沉淀中，與生物信息分析其為親水性蛋白存在差異，原因可能與表達條件的選擇有關(guān)，應(yīng)進一步優(yōu)化表達條件，獲得可溶性表達的蛋白。

痘病毒的轉(zhuǎn)錄含有5'帽子和poly-A尾巴，與宿主細胞產(chǎn)生mRNA類似。帽子結(jié)構(gòu)包含一個N7-甲基化鳥苷殘基，通過一個反向的5'-5'三磷酸連接加到新產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5'端，加帽過程發(fā)生在轉(zhuǎn)錄起始后不久[18]。對VLTF-1蛋白的氨基酸特性進行分析，發(fā)現(xiàn)其上有26個磷酸化位點，具有上述轉(zhuǎn)錄因子的特點。因此，該蛋白可能具有識別蛋白激酶的位點，干擾宿主機體信號傳導(dǎo)。VLTF-1蛋白是一個膜蛋白，可能與其進出核膜或發(fā)揮其他生物學功能有關(guān)。

痘病毒的轉(zhuǎn)錄在胞質(zhì)中完成，但整個過程中不可能與胞核無關(guān)；且作為典型的轉(zhuǎn)錄因子，應(yīng)含有DNA結(jié)合區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、寡聚化位點以及核定位信號等功能區(qū)域。二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，VLTF-1蛋白為混合型蛋白，無規(guī)則卷曲和α-螺旋結(jié)構(gòu)占主導(dǎo)位置，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)比較少。無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)與抗體結(jié)合是形成抗原表位的關(guān)鍵，故VLTF-1蛋白可能含有許多B細胞抗原表位[19]。但不排除其他區(qū)域也存在抗原表位，是否存在還需要進一步研究加以確認。

4 結(jié)論

本研究成功克隆晚轉(zhuǎn)錄因子VLTF-1基因，通過原核表達系統(tǒng)制備了VLTF-1蛋白，并利用生物信息學分析研究蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，為全面研究山羊痘病毒提供參考。