孫鈺博，禹方曉，韋英益，于美玲，梁萬(wàn)文，李 旻，覃志彪*，胡庭俊*

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西南寧 530021）

羅非魚(yú)蛋白質(zhì)含量較高[1]，肉質(zhì)白嫩，且富含人體所需的8種必需氨基酸，享有“白肉三文魚(yú)”“21世紀(jì)之魚(yú)”等美稱(chēng)。羅非魚(yú)養(yǎng)殖要求低，近年來(lái)已成為養(yǎng)殖、加工、出口的水產(chǎn)新星。但養(yǎng)殖戶(hù)操作不良或水體環(huán)境惡劣，常導(dǎo)致羅非魚(yú)群暴發(fā)細(xì)菌性疾病。代表性病原菌包括無(wú)乳鏈球菌、海豚鏈球菌和嗜水氣單胞菌，以無(wú)乳鏈球菌最為典型[2]。養(yǎng)殖戶(hù)常為預(yù)防此類(lèi)疾病而在水體和餌料中濫用抗生素，導(dǎo)致藥殘嚴(yán)重超標(biāo)、出貨優(yōu)品率下降等問(wèn)題。因此，找到低藥殘、低污染、純天然綠色的中草藥迫在眉睫。

黃連、黃芩和大黃均具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。其中，黃芩的臨床抗菌性更優(yōu)，且不產(chǎn)生抗藥性[3]。三黃連散由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)，是黃連、黃芩和大黃等中藥配伍制成的復(fù)方中草藥散劑，可應(yīng)用于預(yù)防羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病[4-6]。本試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行三黃連散對(duì)靶動(dòng)物（羅非魚(yú)）的安全性評(píng)價(jià),為三黃連散的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物

三黃連散由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院研制，山西首愛(ài)動(dòng)物藥業(yè)有限公司中試生產(chǎn)（批號(hào)：20170703，規(guī)格：每克含黃芩苷不少于80 mg，包裝：100 g/袋）。

1.1.2 試驗(yàn)飼料

羅非魚(yú)膨化配合餌料403（百洋產(chǎn)業(yè)投資集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，編號(hào)：Q/BYS 003—2019，凈含量25 kg/袋）；水產(chǎn)藥物及餌料專(zhuān)用黏合劑（北京鑫洋水產(chǎn)高新技術(shù)有限公司生產(chǎn)，凈含量250 g/袋）。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

150尾羅非魚(yú)，每尾重50～100 g，臨床健康，未檢出無(wú)乳鏈球菌等致病菌，購(gòu)自廣西水產(chǎn)研究所羅非魚(yú)養(yǎng)殖基地。試驗(yàn)前進(jìn)行場(chǎng)地適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。每日投喂飼料量按魚(yú)體重的3%稱(chēng)取，每日投喂2次（9：00、18：00）。

1.2 給藥方式

采用與臨床應(yīng)用相同的給藥途徑，拌餌投喂。餌料粉碎，取相應(yīng)重量的三黃連散與等重量黏合劑混合，加適量水?dāng)嚢?，與餌料攪拌混勻。陰干8 h，分裝后密封保存于塑料袋，4℃保存。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取已經(jīng)過(guò)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d且規(guī)格相同的羅非魚(yú)150尾，隨機(jī)分為5組，分別為對(duì)照組以及1、3、5、10倍劑量組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10尾魚(yú)，分別飼養(yǎng)于400 L的塑料桶中。試驗(yàn)期14 d。連續(xù)飼喂7 d后停止投藥，只投喂基礎(chǔ)飼料。于試驗(yàn)第8、第15 d采樣。試驗(yàn)期間飼養(yǎng)條件不變。具體分組處理見(jiàn)表1。

表1 三黃連散靶動(dòng)物安全性試驗(yàn)分組及處理Tab.1 Grouping and treatment of safety test of three coptis isolated target animals

1.4 樣品前處理

每尾魚(yú)血液樣本分為2份：0.50 mL血液加抗凝劑EDTA-K2混勻，立即測(cè)定全血常規(guī)生理指標(biāo)；剩余血液保存于無(wú)菌EP管，4℃靜置過(guò)夜，3 000 r/min離心10 min，取血清，分裝標(biāo)記，-80℃保存，以測(cè)定血清生化指標(biāo)。采集肝、脾，以10%福爾馬林固定，應(yīng)用于病理組織學(xué)檢查。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 臨床癥狀

試驗(yàn)期間觀察記錄各組羅非魚(yú)的臨床表現(xiàn)和采食情況等。若試驗(yàn)期間羅非魚(yú)出現(xiàn)臨床病理變化或死亡等異常情況，詳細(xì)記錄情況出現(xiàn)時(shí)間、數(shù)量和臨床癥狀等，解剖死亡魚(yú)并確定死亡原因。

1.5.2 生長(zhǎng)性能

試驗(yàn)開(kāi)始前和給藥后的第8、第15 d，分別稱(chēng)量記錄羅非魚(yú)的體重。采血后處死魚(yú)，采摘完整的肝臟和脾臟進(jìn)行稱(chēng)重并記錄，計(jì)算肝臟指數(shù)脾臟和指數(shù)。

1.5.3 血液生理指標(biāo)的測(cè)定

取抗凝全血檢測(cè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、血紅蛋白濃度（HGB）、淋巴細(xì)胞（LY）、粒細(xì)胞（GRAN）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、紅細(xì)胞比容（HCV）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、紅細(xì)胞分布寬度變異指數(shù)（RDW-CV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量（MCH）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）和平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）指標(biāo)，均使用全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。

1.5.4 血液生化指標(biāo)的測(cè)定

取離心后的血清檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總蛋白、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、白蛋白、總膽固醇、肌酐、總膽紅素、甘油三酯、血尿素氮和堿性磷酸酶指標(biāo)，均采用南京建成試劑盒測(cè)定，操作步驟參照說(shuō)明書(shū)。

1.5.5 病理組織學(xué)檢查

取10%的福爾馬林固定后的肝、脾，包埋切片、HE染色，鏡檢，觀察臟器內(nèi)中各細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 三黃連散對(duì)羅非魚(yú)體重及器官指數(shù)的影響（見(jiàn)表2、表3）

由表2可知，給藥7 d后各組的增重率、脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表2 給藥7 d對(duì)羅非魚(yú)體重及臟器指數(shù)的影響Tab.2 Weight and organ indexes after seven days of administration

由表3可知，停藥7 d后，與對(duì)照組相比，3倍劑量組和10倍劑量組羅非魚(yú)的增重率均顯著降低（P＜0.05）。各組初重、末和肝臟、脾臟指數(shù)均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表3 停藥7 d對(duì)羅非魚(yú)體重及臟器指數(shù)的影響Tab.3 Weight and organ indexes after seven days of withdrawal

2.2 三黃連散對(duì)羅非魚(yú)血液生理指標(biāo)的影響（見(jiàn)表4、表5）

表5 停藥7 d對(duì)羅非魚(yú)血液生理指標(biāo)的影響Tab.5 Blood physiological indexes after seven days of withdrawal

由表4可知，給藥7 d后，與對(duì)照組相比，1倍劑量組、5倍劑量組和10倍劑量組的GRAN和MCH均顯著降低（P＜0.05），各劑量組的MCV均極顯著降低（P＜0.01），各劑量組的MCHC均極顯著升高（P＜0.01）。

表4 給藥7 d對(duì)羅非魚(yú)血液生理指標(biāo)的影響Tab.4 Blood physiological indexes after seven days of administration

各組WBC、LY、RBC、HGB、HCV、RDW-CV、PLT均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

續(xù)表5 停藥7 d對(duì)羅非魚(yú)血液生理指標(biāo)的影響Tab.5（continue）Blood physiological indexes after seven days of withdrawal

由表5可知，與對(duì)照組相比，停藥7 d后，5倍劑量組和10倍劑量組的WBC均極顯著降低（P＜0.01）；各劑量組的MCV和MCH均極顯著降低（P＜0.01）；5倍劑量組的LY、GRAN和MCHC均顯著降低（P＜0.05）。

2.3 三黃連散對(duì)羅非魚(yú)血液生化指標(biāo)的影響（見(jiàn)表6、表7）

表7 停藥7 d對(duì)羅非魚(yú)血液生化指標(biāo)的影響Tab.7 Blood biochemical indexes after seven days of withdrawal

由表6可知，與對(duì)照組相比，給藥7 d后，5倍劑量組的白蛋白含量極顯著升高（P＜0.01），10倍劑量組的總蛋白含量極顯著升高（P＜0.01）。

表6 給藥7 d對(duì)羅非魚(yú)血液生化指標(biāo)的影響Tab.6 Blood biochemical indexes after seven days of administration

各組堿性磷酸酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性以及甘油三酯、肌酐、血尿素氮、總膽固醇、總膽紅素的含量均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

由表7可知，與對(duì)照組相比，停藥7 d后，3倍劑量組的白蛋白含量極顯著升高（P＜0.01）；1倍劑量組總蛋白含量顯著升高（P＜0.05），3倍劑量組的總蛋白含量顯著降低（P＜0.05）；5倍劑量組和10倍劑量組的甘油三酯的含量顯著升高（P＜0.05），1倍劑量組數(shù)值有所增高，但差異不顯著（P＞0.05）；5倍劑量組和10倍劑量組的總膽固醇含量極顯著降低（P＜0.01）；10倍劑量組肌酐含量顯著升高（P＜0.05）。

各組堿性磷酸酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性及血尿素氮、總膽固醇的含量則均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.4 組織切片結(jié)果（見(jiàn)圖1～圖4）

圖1 給藥7 d羅非魚(yú)肝臟病理組織學(xué)結(jié)果Fig.1 Histopathological results of liver of tilapia after seven days administration

圖2 停藥7 d羅非魚(yú)肝臟病理組織學(xué)結(jié)果Fig.2 Histopathological results of liver of tilapia after seven days of withdrawal

由圖1～圖4可知，于給藥7 d和停藥7 d后解剖羅非魚(yú)，經(jīng)眼觀和組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，三黃連散各劑量組臟器均無(wú)明顯眼觀病變，病理組織切片未發(fā)現(xiàn)藥物引起的細(xì)胞毒性變化。

3 討論

鏈球菌病一直是羅非魚(yú)養(yǎng)殖戶(hù)面臨最大的難題[7]，其中以無(wú)乳鏈球菌感染首當(dāng)其沖。目前，漁業(yè)高密度養(yǎng)殖的環(huán)境下，無(wú)乳鏈球菌病初期病癥不明顯，很可能造成難以估計(jì)的損失。因此，養(yǎng)殖戶(hù)為節(jié)約成本，多選擇大劑量、大面積地潑灑抗生素類(lèi)藥物，導(dǎo)致鏈球菌的多重耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重[8]。近年來(lái)，有關(guān)部門(mén)嚴(yán)令禁止飼料中添加抗生素，要求生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)僅可添加中藥類(lèi)促生長(zhǎng)類(lèi)飼料添加劑；在多重因素的影響下，進(jìn)一步促進(jìn)了中獸藥制劑的研發(fā)。

多種中草藥有效成分均具有良好的抗菌效果，能夠提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。陳奇等[9]研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量的山豆根多糖對(duì)人工感染羅非魚(yú)鏈球菌病具有不同程度抵抗效果，可有效降低羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后的病死率。徐晴等[10]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素對(duì)感染鼠傷寒沙門(mén)氏菌的小鼠具有明顯的治療作用。薛芳翰等[11]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)繁殖具有顯著抑制作用，可能與藥物干擾細(xì)菌細(xì)胞膜通透性有關(guān)。王寧等[12]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪提取物對(duì)常見(jiàn)的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌等致病菌具有較明顯的體內(nèi)外抑菌作用。倪建騰等[13]研究發(fā)現(xiàn)，黃連、黃芩體外對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌具有一定的抑制作用。阿木古楞等[14]研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮、訶子、黃芩等3味蒙藥對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌綜合抑菌效果均可達(dá)到極度敏感或高度敏感的程度。張照紅[15]研究發(fā)現(xiàn)，大黃、黃芩和黨參等7種中藥制成的復(fù)方制劑，連續(xù)飼喂羅非魚(yú)45 d，可表現(xiàn)顯著增重作用。獸用中草藥制劑發(fā)展前景廣闊，為水產(chǎn)養(yǎng)殖的防病、治病提供了新思路。

三黃連散是由廣西大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)，經(jīng)過(guò)中獸醫(yī)辨證論治、科學(xué)配伍研制而成的中獸藥復(fù)方制劑。靶動(dòng)物安全試驗(yàn)通過(guò)飼喂羅非魚(yú)不同劑量的三黃連散，檢測(cè)器官指數(shù)、血液生理指標(biāo)、血液生化指標(biāo)和病理組織學(xué)細(xì)胞形態(tài)的變化，得到三黃連散對(duì)羅非魚(yú)的臨床影響情況。

本研究中，羅非魚(yú)各器官指數(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各劑量組羅非魚(yú)的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均無(wú)顯著差異，表明三黃連散對(duì)羅非魚(yú)臟器無(wú)明顯毒副作用。

本研究中，羅非魚(yú)的血液生理指標(biāo)顯示，與對(duì)照組相比，各三黃連散劑量組羅非魚(yú)的平均紅細(xì)胞體積均顯著降低，表明羅非魚(yú)代謝能力增強(qiáng)[16]；給藥期間各劑量組的平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度均極顯著升高，表明羅非魚(yú)血液氧氣運(yùn)輸量增加[17-18]。

本研究中，羅非魚(yú)的血液生化指標(biāo)顯示，與對(duì)照組相比，停藥前后1、5、10倍劑量組的總蛋白含量均顯著升高，且總蛋白含量隨中藥劑量升高而增加，表明三黃連散可促進(jìn)機(jī)體代謝速度及蛋白質(zhì)的吸收與合成[19]。停藥前各劑量組總膽固醇含量未見(jiàn)明顯增高，表明使用三黃連散不會(huì)引起羅非魚(yú)體內(nèi)脂肪堆積[20]，對(duì)脂質(zhì)代謝造成壓力[21]。停藥7 d后，5、10倍劑量組總膽紅素含量均顯著降低，但丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和堿性磷酸酶的活性等均無(wú)顯著差異，表明三黃連散對(duì)羅非魚(yú)肝臟功能無(wú)不良影響[22]。停藥前后，1、3、5倍劑量組血尿素氮和肌酐含量均無(wú)顯著差異，表明三黃連散對(duì)羅非魚(yú)的腎臟功能無(wú)不良影響。

本試驗(yàn)病理組織學(xué)結(jié)果顯示，停藥前后各劑量組肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，肝臟細(xì)胞清晰可見(jiàn)，與對(duì)照組比均無(wú)明顯的病理變化，表明三黃連散對(duì)代謝和免疫無(wú)影響。停藥前后各劑量組與對(duì)照組的脾臟組織切片上均存在少量含鐵血黃素，與黃明[23]的試驗(yàn)結(jié)果相似，可能與紅細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡有關(guān)。病理切片顯示無(wú)其他明顯的病理變化和細(xì)胞毒性變化，表明三黃連散對(duì)羅非魚(yú)對(duì)造血和免疫無(wú)影響。結(jié)合停藥前后的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)數(shù)據(jù)分析表明，1～10倍推薦劑量的三黃連散對(duì)羅非魚(yú)無(wú)不良影響。

4 結(jié)論

以三黃連散臨床推薦劑量的1、3、5、10倍，連續(xù)給藥7 d及停藥7 d后，各劑量組羅非魚(yú)均未出現(xiàn)臨床病理變化，且臟器指數(shù)、血液生理指標(biāo)、血液生化指標(biāo)和病理組織學(xué)結(jié)果與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異。研究表明，三黃連散在1～10倍推薦劑量下連續(xù)飼喂安全可靠。