謝河秋，李 力，楊紫芳

（駐馬店市中心醫(yī)院a.疼痛科；b.神經(jīng)外科，河南駐馬店463000）

骨質(zhì)疏松癥是一種臨床常見(jiàn)的代謝性骨病，隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸加劇，尤其是在絕經(jīng)后的女性中［1］。骨質(zhì)疏松會(huì)導(dǎo)致骨礦物質(zhì)密度下降、骨質(zhì)量下降以及骨骼的微結(jié)構(gòu)性骨折，而骨質(zhì)疏松患者的骨折修復(fù)難度極大，有效促進(jìn)骨折愈合具有重要的臨床意義［2］。研究發(fā)現(xiàn)，核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2）/OH-1通路在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)病過(guò)程中起重要作用，其激活可以增強(qiáng)對(duì)內(nèi)源性抗氧化劑對(duì)活性氧（ROS）的抑制作用，從而促進(jìn)骨再生［3］。體外沖擊波（extracorporeal shock waves,ESW）主要被用于結(jié)石的治療，近年來(lái)研究顯示，ESW可以促進(jìn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP），從而加速骨形成和骨愈合［4，5］。中藥也在骨質(zhì)疏松的治療中起到了重要作用，鳶尾素（irisin）主要由骨骼肌合成和分泌，可促進(jìn)成骨細(xì)胞的再生，增加皮質(zhì)骨的質(zhì)量和強(qiáng)度，并使破骨細(xì)胞減少，從而發(fā)揮增加骨量的作用，研究發(fā)現(xiàn)，其可通過(guò)調(diào)控Nrf2抑制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠成骨細(xì)胞凋亡，緩解骨質(zhì)疏松［6］，然而是否會(huì)促進(jìn)骨折愈合仍不清楚。本文主要分析鳶尾素聯(lián)合ESW治療去勢(shì)骨質(zhì)疏松性骨折模型大鼠的作用機(jī)制，為臨床更好地治療骨質(zhì)疏松性骨折提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

80只雌性SD大鼠隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組、模型組、模型+ESW組、模型+鳶尾素組、模型+ESW+鳶尾素組，每組16只。

1.2 動(dòng)物模型建立與處理

1:1體積的鹽酸甲苯噻嗪（5 mg/kg）和鹽酸唑拉西泮（20 mg/kg）麻醉大鼠，切除大鼠的兩個(gè)卵巢（ovariectomy,OVX)［7］。其中，假手術(shù)組大鼠僅行開(kāi)腹，沒(méi)有切除卵巢。

OVX術(shù)后12周后再次麻醉大鼠，切開(kāi)并暴露右側(cè)股骨，通過(guò)擊打的方法建立股骨骨折模型，然后使用1 mm克氏針固定。影像檢查確認(rèn)建模情況，并肌肉注射8萬(wàn)單位青霉素預(yù)防感染。

ESW干預(yù)通過(guò)ESW治療儀進(jìn)行［8］，能量密度為0.25 mJ/mm2，頻率為5 Hz，脈沖次數(shù)為1 600次，每周1次，共治療8周。鳶尾素的干預(yù)方法為骨折部位局部注射，濃度為500 ng/ml，劑量為0.1 ml，每周1次，連續(xù) 8 周［9］。

藥物干預(yù)8周后，對(duì)大鼠采用二氧化碳安樂(lè)死，分別進(jìn)行以下檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 骨密度和破骨細(xì)胞指數(shù)

采用小動(dòng)物骨密度儀檢測(cè)左側(cè)股骨密度。然后，取出中段骨痂組織，將組織在4%的多聚甲醛中浸泡過(guò)夜將其固定，固定后使用石蠟進(jìn)行常規(guī)包埋。然后利用切片機(jī)將樣本切成5 μm厚的切片。制作成玻片標(biāo)本后加入蘇木精（10%，室溫，10 min）和曙紅（0.5%，室溫，10 min）分別對(duì)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行染色。在每個(gè)樣本中隨機(jī)選擇三個(gè)高倍視野進(jìn)行觀察，破骨細(xì)胞指數(shù)即為單位面積中破骨細(xì)胞數(shù)目（個(gè)/μm2）。

1.3.2 MicroCT掃描

使用Micro-CT機(jī)在555 uA電流和42 kV電壓下掃描，層厚為1 mm，分辨率為8.73 μm，掃描角度為360°，以骨折部位為中點(diǎn)分別在上部和下部各選擇200張，然后統(tǒng)計(jì)骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）以及骨小梁的數(shù)量、厚度和分離度。

1.3.3 Western blot

將中段骨痂組織，假手術(shù)組取骨組織，裂解后收集總蛋白。通過(guò)8%的SDS-PAGE分離每個(gè)樣品中等量（50 μg）的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后將5%脫脂牛奶完全浸沒(méi)硝酸纖維素膜來(lái)封閉非特異性抗原（室溫下2 h），將膜分別與一抗（1∶800稀釋）在4°C下孵育過(guò)夜，然后將山羊抗免IgG二抗按照1∶2 000的比例稀釋并在室溫下孵育1 h進(jìn)行反應(yīng)。使用化學(xué)發(fā)光試劑顯示，使用Quantum One軟件分析灰度計(jì)算BMP2、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、Nrf2、OH-1蛋白相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量。

1.3.4 RT-qPCR

使用RNeasy Mini試劑盒取中段骨痂組織（假手術(shù)組取骨組織）中的總RNA，然后使用Bestar qPCR RT試劑盒將其逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件如下：37°C/15 min；98°C/5 min。然后使用 Bestar?qPCR 預(yù)混液進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，條件如下：95°C/2 min，94°C/20 s，58 °C 20 s，72 °C/20 s，40 個(gè)循環(huán)，最后在 72 °C下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR分析。通過(guò)比較循環(huán)閾值并以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算Nrf2、OH-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 骨密度和破骨細(xì)胞指數(shù)

骨密度和破骨細(xì)胞指數(shù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，骨密度檢測(cè)值由高至低依次為，假手術(shù)組＞模型+ESW+鳶尾素＞模型+ESW組＞模型+鳶尾素組＞模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。破骨細(xì)胞指數(shù)由低至高依次為，假手術(shù)組＜模型+ESW+鳶尾素組＜模型+鳶尾素組＜模型+ESW組 ＜模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 五組動(dòng)物股骨骨折標(biāo)本骨密度和破骨細(xì)胞指數(shù)檢測(cè)結(jié)果（±s）與比較

表1 五組動(dòng)物股骨骨折標(biāo)本骨密度和破骨細(xì)胞指數(shù)檢測(cè)結(jié)果（±s）與比較

注：aP＜0.05 vs.假手術(shù)組；bP＜0.05 vs.模型組；cP＜0.05 vs.模型+ESW組；dP＜0.05 vs.模型+鳶尾素組

指標(biāo)P值骨密度（m g/c m 2）破骨細(xì)胞指數(shù)（n/μ m 2）假手術(shù)組（n=1 6）8 2.9 3±5.1 8 3 5.7 2±3.1 5模型組（n=1 6）4 9.4 7±4.8 5 a 7 4.1 8±7.2 9 a模型+E S W組（n=1 6）6 0.2 1±5.2 7 b 6 4.0 6±5.7 6 b模型+鳶尾素組（n=1 6）5 9.6 2±5.4 6 b 5 9.7 2±5.0 4 b模型+E S W+鳶尾素組（n=1 6）7 7.9 4±7.0 4 cd 4 2.5 8±4.2 2 cd＜0.0 0 1＜0.0 0 1

2.2 MicroCT檢測(cè)

MicroCT檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。骨表面積骨體積比值（bone surface/bone volume,BS/BV）由高至低依次為，模型+ESW+鳶尾素＞模型+鳶尾素組＞模型+ESW組＞模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。骨小梁數(shù)（trabecular number,Tb.N）由高至低依次為，模型+ESW+鳶尾素組＞模型+鳶尾素組＞模型+ESW組＞模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。骨小梁厚度（trabecular thickness,Tb.Th）由高至低依次為，模型+ESW+鳶尾素組＞模型+ESW組＞模型+鳶尾素組＞模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。骨小梁分離度（trabecular separation,Tb.Sp）由低至高依次為，模型+ESW+鳶尾素＜模型+鳶尾素組＜模型+ESW組＜模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

表2 五組動(dòng)物股骨骨折中心樣本microCT檢測(cè)結(jié)果（±s）與比較

表2 五組動(dòng)物股骨骨折中心樣本microCT檢測(cè)結(jié)果（±s）與比較

注：aP＜0.05 vs.假手術(shù)組；bP＜0.05 vs.模型組；cP＜0.05 vs.模型+ESW組；dP＜0.05 vs.模型+鳶尾素組

指標(biāo)假手術(shù)組（n=1 6）P值B S/B V（%）T b.N（1/m m）T b.T h（μ m）T b.S p（μ m）- - - -模型組（n=1 6）3 7.1 5±2.1 4 0.1 2±0.0 1 0.1 1±0.0 1 5.0 2±0.6 5模型+E S W組（n=1 6）4 4.3 5±3.2 5 b 0.2 0±0.0 2 b 0.2 1±0.0 2 b 4.4 7±0.4 9 b模型+鳶尾素組（n=1 6）4 7.5 2±3.8 7 b 0.2 1±0.0 2 b 0.2 0±0.0 2 b 4.3 0±.0 4 7 b模型+E S W+鳶尾素組（n=1 6）5 1.7 4±4.0 2 c、d 0.2 7±0.3 0 c、d 0.2 7±0.3 0 c、d 3.4 5±0.3 6 c、d＜0.0 0 1＜0.0 0 1＜0.0 0 1＜0.0 0 1

2.3 Western blot檢測(cè)結(jié)果

Western blot檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1、表3。BMP2表達(dá)量由高至低依次為，模型+ESW+鳶尾素＞假手術(shù)組＞模型+鳶尾素組＞模型+ESW組＞模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。VEGF表達(dá)量由高至低依次為，模型+ESW+鳶尾素組＞假手術(shù)組＞模型+ESW組＞模型+鳶尾素組＞模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Nrf2F表達(dá)量由高至低依次為，假手術(shù)組＞模型+ESW+鳶尾素＞模型+鳶尾素組＞模型+ESW組＞模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。OH-1表達(dá)量由高至低依次為，假手術(shù)組＞模型+ESW+鳶尾素組＞模型+鳶尾素組＞模型+ESW組＞模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 Westernblot凝膠電泳圖 1a:BMP2和VEGF檢測(cè)凝膠電泳 1b:Nrf2和OH-1蛋白檢測(cè)凝膠電泳

表3 五組動(dòng)物股骨骨折中心樣本W(wǎng)ester blot檢測(cè)結(jié)果（蛋白相對(duì)表達(dá)量，±s）與比較

表3 五組動(dòng)物股骨骨折中心樣本W(wǎng)ester blot檢測(cè)結(jié)果（蛋白相對(duì)表達(dá)量，±s）與比較

注：aP＜0.05 vs.假手術(shù)組；bP＜0.05 vs.模型組；cP＜0.05 vs.模型+ESW組；dP＜0.05 vs.模型+鳶尾素組

指標(biāo)P值B M P 2 V E G F N r f 2 O H-1假手術(shù)組（n=1 6）2.2 1±0.1 9 1.9 7±0.1 7 3.1 2±0.2 7 2.8 9±0.2 6模型組（n=1 6）0.3 4±0.0 3 a 0.5 2±0.0 5 a 0.4 9±0.0 4 a 0.4 2±0.0 4 a模型+E S W組（n=1 6）1.2 9±0.1 1 b 1.9 1±0.1 6 b 1.4 5±0.1 2 b 1.7 0±0.1 4 b模型+鳶尾素組（n=1 6）1.4 5±0.1 2 b 1.8 5±0.1 5 b 1.6 7±0.1 4 b 1.7 6±0.1 5 b模型+E S W+鳶尾素組（n=1 6）2.2 8±0.2 0 c、d 2.3 0±0.2 0 c、d 2.9 5±0.2 7 c、d 2.7 7±0.2 5 c、d＜0.0 0 1＜0.0 0 1＜0.0 0 1＜0.0 0 1

2.4 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)4。Nrf2 mRNA相對(duì)表達(dá)量由高至低依次為，假手術(shù)組＞模型+ESW+鳶尾素組＞模型+鳶尾素組＞模型+ESW組＞模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。OH-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量由高至低依次為，假手術(shù)組＞模型+ESW+鳶尾素組＞模型+鳶尾素組＞模型+ESW組＞模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 五組動(dòng)物股骨骨折中心樣本RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果（mRNA相對(duì)表達(dá)量，±s）與比較

表4 五組動(dòng)物股骨骨折中心樣本RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果（mRNA相對(duì)表達(dá)量，±s）與比較

注：aP＜0.05 vs.假手術(shù)組；bP＜0.05 vs.模型組；cP＜0.05 vs.模型+ESW組；dP＜0.05 vs.模型+鳶尾素組

指標(biāo)P值N r f 2 m R N A O H-1 m R N A假手術(shù)組（n=1 6）4.5 2±0.3 5 4.4 9±0.3 9模型組（n=1 6）0.8 5±0.0 8 a 0.8 1±0.0 8 a模型+E S W組（n=1 6）2.9 7±0.2 4 b 3.0 4±0.2 5 b模型+鳶尾素組（n=1 6）3.2 4±0.2 9 b 3.2 2±0.2 8 b模型+E S W+鳶尾素組（n=1 6）4.2 0±0.3 8 c、d 4.3 8±0.3 9 c、d＜0.0 0 1＜0.0 0 1

3 討論

絕經(jīng)婦女是骨質(zhì)疏松癥的高危人群，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的可能方法，例如藥物治療、中藥、體育鍛煉、機(jī)械刺激和電刺激［10］。而非藥物方法包括鍛煉計(jì)劃和生物物理干預(yù)，ESW治療、磁場(chǎng)和低強(qiáng)度脈沖超聲是常見(jiàn)生物物理干預(yù)措施，而ESW也有助于提高骨質(zhì)疏松合并骨折患者的療效［11］。但是，其具體療效和機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

ESW是一種攜帶能量并可以通過(guò)軟組織傳播的短時(shí)聲波，是一種經(jīng)濟(jì)有效的非侵入性治療方式，已廣泛用于各種疾病的臨床治療，主要包括腎結(jié)石、勃起功能障礙和肌肉骨骼疾?。?2］。最新研究顯示，ESW具有促進(jìn)骨折愈合的作用［13］。鳶尾素是一種肌動(dòng)蛋白，由骨骼肌分泌，鳶尾素最初被認(rèn)為是脂肪組織褐變的活化劑，具有緩解肥胖癥和糖尿病的作用［14］。最新研究結(jié)果顯示鳶尾素可誘導(dǎo)骨形成，增加皮質(zhì)骨的質(zhì)量和強(qiáng)度，使破骨細(xì)胞減少，從而發(fā)揮增加骨量的作用［15］。本研究通過(guò)OVX誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松，并構(gòu)建股骨FF模型，分析ESW和鳶尾素聯(lián)合使用對(duì)骨折愈合的影響。結(jié)果顯示，ESW和鳶尾素單獨(dú)干預(yù)均能夠提高骨密度，減少破骨細(xì)胞數(shù)目，并誘導(dǎo)骨痂生成促進(jìn)骨折部位的愈合，并且ESW和鳶尾素聯(lián)合對(duì)骨密度和骨折愈合的促進(jìn)作用更顯著。這提示對(duì)于骨質(zhì)疏松骨折大鼠，鳶尾素和ESW二者能夠協(xié)同，共同作用加速骨再生和骨愈合。

為進(jìn)一步分析ESW和鳶尾素聯(lián)合促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合的機(jī)制，本研究檢測(cè)了骨痂組織中BMP2和VEGF蛋白的表達(dá)量，以及Nrf2、OH-1蛋白水平。研究顯示ESW對(duì)傷口愈合、血管生成、組織再生和骨骼重塑具有積極作用［16］。而B(niǎo)MP2蛋白是一種分泌蛋白，是促進(jìn)軟骨和骨形成的關(guān)鍵蛋白，其水平升高提示骨再生，是骨折愈合的積極因子［17］。VEGF是促進(jìn)血管生成的關(guān)鍵因子，有研究顯示 ESW 可通過(guò)誘導(dǎo) VEGF促進(jìn)血管生成［18］。VEGF受到Nrf2/HO-1通路的調(diào)控，Nrf2/HO-1通路會(huì)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞的作用，并Nrf2/HO-1通路也會(huì)通過(guò)促進(jìn)VEGF的表達(dá)促進(jìn)血管生成，起到組織修復(fù)的作用［19，20］。本研究結(jié)果顯示，ESW和鳶尾素均可顯著促進(jìn)BMP2和VEGF蛋白的表達(dá)，并提高Nrf2和OH-1的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)量，二者聯(lián)合可進(jìn)一步促進(jìn)它們的表達(dá)水平。Yu等［21］的研究結(jié)果顯示，ESW可通過(guò)上調(diào)Nrf2/OH-1通路促進(jìn)VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)血管再生緩解缺血/再灌注損傷。研究發(fā)現(xiàn)，鳶尾素可通過(guò)激活Nrf2通路緩解氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管生成受損［22］。Kubo等［23］的研究也顯示鳶尾素具有促進(jìn)Nrf2/OH-1通路的功能。提示在ESW的基礎(chǔ)上聯(lián)合鳶尾素干預(yù)可刺激Nrf2/OH-1通路上調(diào)，會(huì)促進(jìn)VEGF蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)血管生成，從而促進(jìn)血液循環(huán)，加速骨痂形成，并提高BMP2的表達(dá)，不但提高骨密度促進(jìn)了骨形成，進(jìn)而促進(jìn)骨折愈合。

綜上所述，鳶尾素聯(lián)合ESW可激活Nrf2/OH-1通路并促進(jìn)VEGF和BMP2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠的骨折愈合。關(guān)于鳶尾素聯(lián)合ESW對(duì)骨質(zhì)疏松骨折患者的治療效果值得進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)證明，為治療骨質(zhì)疏松骨折患者提供新思路。