李娜 ，吳陽(yáng)陽(yáng) ，段錦龍 ，鄭旭彤 ，姚魁武

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.洛陽(yáng)市中醫(yī)院心血管科二病區(qū)，洛陽(yáng) 471000；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京 100053）

高脂血癥在中醫(yī)學(xué)上一般將其歸屬于“胸痹”“眩暈”“痰濕”等范疇。多以脾失健運(yùn)、腎精不足、肝失疏泄為本，痰濁、內(nèi)濕、瘀血為標(biāo)，是一種本虛標(biāo)實(shí)證。《靈樞·本輸》云：“大腸、小腸皆屬于胃?！敝嗅t(yī)脾胃包含大腸、小腸在內(nèi)的整個(gè)消化系統(tǒng)。同時(shí)腸道菌群是人體的第二基因組，中藥湯劑經(jīng)口服進(jìn)入消化道，勢(shì)必影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)，從而影響腸道微生物群而發(fā)揮作用[1-2]。國(guó)醫(yī)大師薛伯壽認(rèn)為肝氣郁結(jié)，阻礙氣機(jī)，脾失健運(yùn)，水濕內(nèi)停，導(dǎo)致高脂血癥的發(fā)生。姚魁武教授在傳承薛教授學(xué)術(shù)思想基礎(chǔ)上，以二陳湯合越鞠丸加減組成解郁祛痰化濁方，臨床治療氣郁痰阻型高脂血癥效果良好。但解郁祛痰化濁方發(fā)揮臨床作用的機(jī)制未明。本研究旨在探討解郁祛痰化濁方干預(yù)高脂飲食大鼠腸道菌群的多樣性及對(duì)相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性SPF級(jí)別Wistar大鼠70只，體質(zhì)量（200±20）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，所有動(dòng)物飼養(yǎng)在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院動(dòng)物房清潔級(jí)環(huán)境內(nèi)，室溫控制在21～24℃，相對(duì)濕度維持在40%～50%，光照12 h（白日光照12 h，夜間黑暗12 h），自由取食動(dòng)物飲用水，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，稱重，剔除異常大鼠。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 解郁祛痰化濁方組成：香附10 g，陳皮 8 g，法半夏 9 g，茯苓 10 g，蒼術(shù) 10 g，砂仁 5 g，神曲15 g，焦山楂15 g，炒梔子10 g，川芎9 g。由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院藥劑科提取，濃縮制成顆粒劑。立普妥片（輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：AL6069）；血脂康膠囊（北京北大維信生物科技有限公司，批號(hào)：20180204）。解郁祛痰化濁方的臨床用量參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[3]，故所對(duì)應(yīng)的中劑量顆粒劑為0.8 g/kg。低劑量組為0.4 g/kg，高劑量組為1.6 g/kg。立普妥組為2 mg/kg。血脂康組為0.1 g/kg。

1.3 試劑 水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司）；10%中性福爾馬林、無(wú)水乙醇（致遠(yuǎn)化學(xué)科技有限公司）；TIANGEN糞便基因組 DNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）；KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase（美國(guó) KAPA Biosystems公司）；Midori Green Advance DNA Stain（德國(guó) Midori Greeng公司）；AMPure XP（德國(guó)Beackman公司）。

1.4 儀器 DW-25L92超低溫保存箱（海爾生物醫(yī)療）；VORTEX-5渦旋振蕩儀（美國(guó)Scientific Industries公司）；Centrifuge 581015810R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；2720熱循環(huán)PCR儀（中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）；Alpha凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)ProteinSimple公司）；Hiseq2500/1500測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）。

2 方法

2.1 高脂血癥大鼠模型的制備及給藥 70只SPF大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、血脂康組、立普妥組、解郁祛痰化濁方低、中、高劑量組，每組 10只。正常組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)飼料由斯貝爾（北京）生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2015-0015，其余組 給予高脂飼料。飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008。喂養(yǎng)期間自由攝食、飲水12周，建立高脂血癥動(dòng)物模型。在飼喂12周后，解郁祛痰化濁方劑量低、中、高劑量分別灌胃給予0.8、0.4、1.6 g/kg，立普妥組予立普妥2 mg/kg，血脂康組予血脂康0.1 g/kg，正常組和模型組大鼠灌胃同等量蒸餾水，8周后取材。

2.2 大鼠血液生化指標(biāo)的測(cè)定 在藥物干預(yù)8周后，大鼠腹主動(dòng)脈采血4～6 mL檢測(cè)血清中測(cè)膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）的含量。

2.3 糞便取樣與檢測(cè) 藥物干預(yù)8周后取材，收集大鼠糞便將其放入-80℃冰箱中保存，進(jìn)行大鼠糞便總DNA提取建庫(kù)及質(zhì)檢，擴(kuò)增16S V3-4區(qū)等16S rRNA基因測(cè)序檢測(cè)。

2.4 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析計(jì)算，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。數(shù)據(jù)若符合正態(tài)分布及方差齊，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)；若不符合正態(tài)分布或方差齊，組間比較采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量的測(cè)定 稱取給藥8周后大鼠的體質(zhì)量，觀察每組大鼠的體質(zhì)量的變化。如表1，與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯增加（P＜0.01）。藥物干預(yù)8周后，與模型組比較，血脂康組、解郁祛痰化濁方低、高劑量組大鼠體質(zhì)量明顯下降（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化（±s）Tab.1 Changes in body weight of rats in each group（±s）g

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化（±s）Tab.1 Changes in body weight of rats in each group（±s）g

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) 體質(zhì)量正常組 10 506.50±33.87模 型 組 10 618.50±54.19*血脂康組 10 568.86±46.01#立普妥組 10 578.50±31.62解郁祛痰化濁方低劑量組 10 568.42±38.99#解郁祛痰化濁方中劑量組 10 590.13±41.29解郁祛痰化濁方高劑量組 10 569.00±20.14#

3.2 血脂4項(xiàng)結(jié)果 如表2，同正常組比較，模型組大鼠血脂4項(xiàng)TC、TG、LDL-C均見(jiàn)明顯升高，HDL-C降低（P＜0.01）。同模型組比較，血脂康組TC、TG顯著性下降（P<0.01），HDL-C升高（P<0.05）、立普妥組 TC、TG明顯降低（P<0.01）；中藥低劑量組TC、TG顯著降低（P<0.01）；解郁祛痰化濁方中劑量組 TC、TG、LDL-C 顯著降低（P<0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；解郁祛痰化濁方高劑量組 TC、TG顯著降低（P<0.01），HDL-C 升高（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 大鼠血脂4項(xiàng)結(jié)果（±s）Tab.2 Results of four items of blood lipid in rats（±s）mmol/L

表2 大鼠血脂4項(xiàng)結(jié)果（±s）Tab.2 Results of four items of blood lipid in rats（±s）mmol/L

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) TC TG HDL-C LDL-C正常組 10 2.26±0.38 0.90±0.25 1.33±0.19 0.57±0.92模 型 組 10 3.22±0.75* 1.69±0.28* 0.89±0.10* 1.02±0.39*血脂康組 10 2.52±0.30## 1.14±0.34## 1.17±0.41# 1.00±0.13立普妥組 10 2.20±0.18## 1.16±0.19## 0.99±0.23 0.90±0.16解郁祛痰化濁方低劑量 10 2.51±0.29## 1.03±0.21## 1.02±0.16 1.25±0.25解郁祛痰化濁方中藥中劑量 10 2.12±0.27## 1.01±0.29## 1.09±0.24 0.77±0.16##解郁祛痰化濁方中藥高劑量 10 2.46±0.15## 1.08±0.24## 1.24±0.22## 1.06±0.23

3.3 物種結(jié)構(gòu)分析 基于豐度前15的物種進(jìn)行樣本間的物種組成差異分析，從門(mén)層次結(jié)構(gòu)分類上看，大鼠腸道菌群相對(duì)豐度中前5位的主要的菌種為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、疣微菌門(mén)。從綱層次結(jié)構(gòu)分類上看，主要的菌群主要有梭菌綱、芽孢桿菌綱、擬桿菌綱、丹毒絲菌綱、變形菌綱。從目層次結(jié)構(gòu)分類上看，主要的菌群包括梭菌、乳桿菌、擬桿菌、丹毒絲菌、脫硫弧菌。從科層次結(jié)構(gòu)分類上看，前五位的菌群是毛螺菌科、瘤胃球菌科、乳桿菌科、韋榮球菌科、擬桿菌S24-7。從屬層次菌落結(jié)構(gòu)圖上看主要為：布勞特氏菌屬、乳桿菌屬、瘤胃菌UCG-005等。見(jiàn)圖1。

圖1 物種在門(mén)、綱、目、科、屬各層次上的分類結(jié)果Fig.1 Classification results of species at the levels of phylum，class，order，family，and genus

3.4 厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)的表達(dá) LEfSe采用線性判別分析（LDA）來(lái)估算每個(gè)組分（物種）豐度對(duì)差異效果影響的大小，在組與組之間尋找組間差異顯著的物種。結(jié)果在菌門(mén)中得出差異：正常組厚壁菌門(mén)較模型組低（P<0.01），擬桿菌門(mén)較模型組高（P<0.01）。擬桿菌門(mén)解郁祛痰化濁方中劑量組較模型組增高（P<0.05）。F/B模型組顯著高于正常組（P<0.01），解郁祛痰化濁方中劑量組低于模型組（P<0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 厚壁菌門(mén)，擬桿菌門(mén)及F/B箱型圖Fig.2 Firmicutes，Bacteroidetes and F/B box plots

4 討論

國(guó)醫(yī)大師薛伯壽認(rèn)為氣郁痰阻為血脂異常當(dāng)下的主要病理因素，嗜食肥甘厚味者，膏脂積存胃中，脾臟轉(zhuǎn)輸不及，變?yōu)樘禎岱e存胃中，影響氣血生化。肝膽脾胃同居中焦，肝膽疏泄有度，脾胃才能運(yùn)化正常，今脾胃痰濁雍滯，升降失常，肝膽疏泄之氣受到影響，亦會(huì)出現(xiàn)雍滯，從而病變涉及肝膽，出現(xiàn)土壅木郁之狀況。在此認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，姚魁武教授依據(jù)薛教授經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)立解郁祛痰化濁方在臨床中治療血脂異常，效果顯著。該方由越鞠丸加二陳丸化裁而成，越鞠丸疏解六郁，二陳湯祛痰理氣，兩者合用共奏解郁祛痰，化濁調(diào)氣之效。研究表明[4]腸道菌群生物物種豐度度降低與血脂異常相關(guān)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)物種結(jié)構(gòu)分析中，發(fā)現(xiàn)正常組與模型組大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯差異，高脂飲食誘使大鼠腸道菌群的物種多樣性及豐度顯著下降，經(jīng)各藥物組干預(yù)后物種的多樣性較模型組均增高。

短鏈脂肪酸其受體在激活后能促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化，影響脂質(zhì)沉積和體質(zhì)量情況[5]。模型組大鼠的血脂4項(xiàng)TC、TG、LDL-C均見(jiàn)明顯升高，HDL-C降低，說(shuō)明高脂血癥大鼠造模成功。同模型組比較，在藥物干預(yù)8周后，發(fā)現(xiàn)各用藥組可明顯調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠血脂水平，TC、TG均可見(jiàn)顯著降低，另外解郁祛痰化濁方中劑量組顯著降低LDL-C水平，解郁祛痰化濁方高劑量組以及血脂康組可提高HDL-C水平。牟菲等[6]發(fā)現(xiàn)高脂血癥組與非高脂血癥組患者腸道菌群有30個(gè)差異菌群，而擬桿菌屬為高脂血癥與非高脂血癥間的關(guān)鍵菌群。據(jù)研究，F(xiàn)/B值的升高與肥胖密切相關(guān)，F(xiàn)/B比值越高，產(chǎn)生的氧化三甲胺（TMAO）越多，而TMAO可以促進(jìn)肝臟脂肪變性、膽固醇代謝失衡等的發(fā)生[7-8]。另有文獻(xiàn)指出，從心論治方可以調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠的血脂水平，在腸道菌群中提高擬桿菌門(mén)[9]。小檗堿可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物降低厚壁門(mén)的比例，從而降低血脂水平、減低體質(zhì)量[10]。由此可見(jiàn)擬桿菌門(mén)與厚壁菌門(mén)在調(diào)脂方面的重要性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)血脂康組，解郁祛痰化濁方低劑量組、高劑量組大鼠體質(zhì)量均下降。統(tǒng)計(jì)所有樣本在門(mén)類上的分類結(jié)果，從門(mén)層次結(jié)構(gòu)分類上看，大鼠腸道菌群相對(duì)豐度中前5位的主要的菌種為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、疣微菌門(mén)。LDA組間差異分析發(fā)現(xiàn)中藥組的F/B值與模型組相比顯著降低，且解郁祛痰化濁方中劑量組的比值最接近于正常組，同時(shí)模型組厚壁菌門(mén)多于擬桿菌門(mén)，這與上述研究結(jié)果相一致，解郁祛痰化濁方可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群F/B的豐度從而改善血脂水平，降低體質(zhì)量。

脂質(zhì)代謝異常作為心血管疾病的重要接觸點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析了高脂飲食大鼠腸道菌群的物種結(jié)構(gòu)，統(tǒng)計(jì)樣本在門(mén)、綱、目、科、屬各層次上的分類結(jié)果。同時(shí)證實(shí)了解郁祛痰化濁方以氣郁痰阻為病機(jī)立方，可以調(diào)節(jié)高脂飲食大鼠血脂，降低體質(zhì)量，調(diào)節(jié)F/B的比值及其他菌群多樣性。