黃家權，李莉，吳豐年，鄭正，鄧曉玲

攜帶不同原噬菌體的黃龍病菌在柑橘木虱體內的增殖及致病力

黃家權1，李莉1，吳豐年2，鄭正1，鄧曉玲1

1華南農業(yè)大學植物保護學院，廣州 510642；2韓山師范學院生命科學與食品工程學院，廣東潮州 521041

在中國，柑橘黃龍?。╟itrus Huanglongbing，HLB）是由候選韌皮部桿菌亞洲種（‘Liberibacter asiaticus’，Las）所引起的一種毀滅性病害，嚴重威脅著柑橘產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。前期研究表明Las全基因組上鑒定出3種單獨類型的原噬菌體基因序列，而廣東黃龍病菌主要以Type-2原噬菌體類型和Type-1+3混合原噬菌體類型為主。這兩種Las菌株在傳病媒介——柑橘木虱（）體內的增殖及其對寄主植物的致病力差異依然不清楚?！尽勘容^Type-2-Las菌株和Type-1+3-Las菌株在柑橘木虱體內的增殖能力和對砂糖橘（Blanco cv. shatangju）的致病力差異。嫁接準備含有不同Las菌株的砂糖橘，分別將50頭柑橘木虱若蟲和50頭成蟲放置到含有不同Las菌株的砂糖橘嫩梢上刺吸獲菌 6、12、18 d，利用熒光定量PCR檢測并統(tǒng)計柑橘木虱若蟲期、成蟲期對Type-2-Las和Type-1+3-Las的獲菌率和獲菌量差異。飼養(yǎng)分別攜帶Type-2-Las和Type-1+3-Las菌株的柑橘木虱種群，分別將攜帶Type-2-Las和Type-1+3-Las菌株的20頭柑橘木虱成蟲置于健康砂糖橘嫩梢上刺吸2周，移除木虱后統(tǒng)計柑橘木虱獲菌率和獲菌量，每月追蹤砂糖橘癥狀變化和葉片病菌濃度，利用光學顯微鏡觀察接種360 d時葉片韌皮部和薄壁細胞形態(tài)學變化情況。柑橘木虱以若蟲形態(tài)對Type-2-Las和Type-1+3-Las菌株的獲菌率和獲菌量無顯著差異，但柑橘木虱以成蟲形態(tài)對Type-2-Las的獲菌率和獲菌量顯著高于Type-1+3-Las菌株。在蟲傳后120 d時接種Type-2-CLas菌株的葉片附近新葉會呈現(xiàn)更嚴重的斑駁癥狀。Type-2-Las菌株侵染砂糖橘一年后抽出的新葉轉綠不正常，出現(xiàn)均勻黃化、小葉的明顯癥狀，而Type-1+3-CLas菌株新葉癥狀則為典型斑駁和革質化。葉片解剖觀察結果發(fā)現(xiàn)，在葉片病菌濃度相近的情況下，相比于接種了Type-1+3-Las 的葉片，接種了Type-2-Las菌株的葉片韌皮部細胞發(fā)生更嚴重的細胞塌縮，在葉脈和葉肉薄壁細胞內造成較多的淀粉粒積累。Type-2-Las比Type-1+3-Las更容易在柑橘木虱成蟲體內增殖，且達到較高的病菌濃度，間接證明了Type-2-Las菌株具有高傳染性。感染Type-2-Las的新葉呈現(xiàn)均勻黃化、葉小的癥狀，而感染Type-1+3-Las的新葉呈現(xiàn)較為斑駁和革質化的癥狀，Type-2-Las比Type-1+3-Las造成更嚴重的葉脈韌皮部塌縮和淀粉粒積累情況，說明Type-2-Las比Type-1+3-Las對柑橘具有更強的致病力。

柑橘黃龍??；候選韌皮部桿菌亞洲種；原噬菌體；柑橘木虱；致病力

0 引言

【研究意義】柑橘黃龍?。╟itrus Huanglongbing，HLB）是世界柑橘生產上的毀滅性病害[1]，由韌皮部桿菌屬‘Liberibacter spp.’引起[2]，在我國，主要是由亞洲種‘Liberibacter asiaticus’（Las）所引起[3]。廣東是最早發(fā)生柑橘黃龍病的地方，該病害在20世紀50年代開始流行危害[4-5]。前期研究表明，Las基因組鑒定出多種類型原噬菌體，廣東地區(qū)的Las菌株主要為攜帶Type 2原噬菌體類型的Las（簡稱Type-2-Las）以及攜帶Type 1和Type 3混合原噬菌體類型的Las（簡稱Type-1+3-Las），而目前尚未有針對這兩種菌株在柑橘木虱（）體內增殖情況以及致病力差異的研究?！厩叭搜芯窟M展】近年來，已從Las全基因組中鑒定出3種單獨的原噬菌體類型：Type 1（SC1）、Type 2（SC2）、Type 3（P-JXGC-3）[6-7]，并且成功應用于柑橘黃龍病菌種群多樣性分析[8]。在美國佛羅里達地區(qū)報道的UF506菌株中Type 1和Type 2噬菌體可以整合在同一染色體上，為單一Las菌株。在中國主要的黃龍病流行區(qū)，Type 2原噬菌體類型是優(yōu)勢菌株，而Type 1類型往往是與其他原噬菌體類型混合，尤其是與Type 3原噬菌體類型[9-10]。在廣東地區(qū)，Type-2-Las檢出頻率最高，Type-1+3-Las檢出頻率高于Type 3單獨原噬菌體類型和其他混合類型，Type 1單獨原噬菌體類型未被檢出[10]。已有研究表明Type 2原噬菌體可編碼假定的黏附素基因和過氧化物酶基因來增強細菌定殖和抵抗植物免疫反應，延緩癥狀表現(xiàn)[6,11]。Type-1+3-Las上的Type 1原噬菌體序列編碼假定的裂解基因和穿孔蛋白基因參與噬菌體裂解循環(huán)，而Type 3原噬菌體序列則編碼了限制-修飾系統(tǒng)（R-M），抑制外來DNA的入侵[7,12]。柑橘黃龍病的傳播蔓延主要依賴于其昆蟲媒介——亞洲柑橘木虱[13]，柑橘木虱若蟲及成蟲均可從柑橘黃龍病樹獲菌[14]，若蟲期的獲菌率和獲菌量高于成蟲期[15]。柑橘木虱傳病效率與帶菌木虱數(shù)量、病菌濃度、枝梢幼嫩程度有明顯關系，而若蟲期獲菌的柑橘木虱比成蟲期獲菌的柑橘木虱具有更高的傳病效率，單頭柑橘木虱可實現(xiàn)病菌傳播[14,16-18]。在柑橘木虱傳播Las后，植株有幾個月的潛伏期[19-21]，此時基于熒光定量PCR的檢測方法可實現(xiàn)病菌的早期追蹤[22]。柑橘黃龍病樹感病初期的葉片典型癥狀為新梢新葉在發(fā)育過程中停止轉綠，出現(xiàn)新葉均勻黃化、革質化，老葉出現(xiàn)斑駁、葉脈腫大等[4]。顯癥葉片的微觀癥狀主要呈現(xiàn)為韌皮部塌縮及細胞形變，薄壁細胞內淀粉粒積累，胼胝質沉積導致篩孔堵塞[23]?！颈狙芯壳腥朦c】在廣東地區(qū)主要存在Type-2-Las和Type-1+3-Las菌株，目前尚未有柑橘木虱獲取和傳播Type-2-Las和Type-1+3-Las 菌株的報道，亦未見針對這兩種Las菌株致病力差異的探討。【擬解決的關鍵問題】比較Type-2-Las和Type-1+3-Las在柑橘木虱體內的增殖情況，在此基礎上，通過從宏觀和微觀癥狀上的比較來解析兩種Las菌株的致病力差異。

1 材料與方法

試驗于 2018 年 3 月至 2020 年 11 月在華南農業(yè)大學植物保護學院柑橘黃龍病研究室完成。

1.1 供試材料

含有Las的枝條采集于廣東省惠州市博羅縣楊村鎮(zhèn)柑橘基地，使用Las的3種原噬菌體特異性引物（表1）檢測出Type-1+3-Las 和Type-2-Las，而后將含有不同Las菌株的芽條分別嫁接于健康砂糖橘材料。兩個月后提取DNA，檢測Las感染情況和原噬菌體類型。

柑橘木虱種群飼養(yǎng)在華南農業(yè)大學柑橘黃龍病研究室的健康九里香，來自于單一父本母本的3代種群。供試柑橘木虱成蟲是在九里香上羽化2 d的成蟲，在刺吸病株前進行1 d饑餓處理。柑橘木虱若蟲是在九里香上由卵孵化的3齡若蟲。

表1 實時熒光定量PCR引物序列信息

1.2 健康柑橘木虱若蟲和成蟲獲取不同CLas菌株的比較

參考Wu等[15]的方法，研究柑橘木虱若蟲期和成蟲期Type-1+3-Las和Type-2-Las的獲菌率和獲菌量差異，設置如下：（1）健康木虱若蟲飼菌處理：分別將50頭3齡柑橘木虱若蟲用毛筆從九里香上轉移至病株嫩梢上，刺吸6、12、18 d各收集10頭柑橘木虱，單頭提取DNA。其中6 d采集的為5齡若蟲，12 d時柑橘木虱已全部羽化為成蟲，設置3組病株重復；（2）健康木虱成蟲飼菌處理：分別將50頭剛羽化的健康柑橘木虱成蟲置于不同Las菌株的柑橘嫩梢上，刺吸6、12、18 d各收集10頭柑橘木虱，單頭提取DNA。上述木虱DNA使用Las-4G引物檢測Las濃度，并記錄木虱獲菌率和獲菌量，設置3組病株重復。

1.3 攜帶不同CLas菌株的柑橘木虱傳病比較和葉片癥狀觀察

為比較不同Las菌株的致病力差異，將腹部為橙黃色的健康柑橘木虱雌蟲置于帶有嫩芽的不同Las菌株砂糖橘上產卵，待產卵后將健康柑橘木虱移走，待卵孵化并繼續(xù)刺吸獲菌至成蟲后2周，檢測柑橘木虱帶菌率。對病株上的帶菌木虱種群隨機采樣10頭成蟲進行檢測，確認柑橘木虱種群帶菌率為80%以上后，分別從種群內取20頭攜帶不同Las菌株的柑橘木虱成蟲轉移至兩組各10株健康砂糖橘的一周齡嫩梢上并套袋，放置于同等條件下刺吸傳病。待木虱取食2周后，移走柑橘木虱，統(tǒng)計木虱存活率并提取DNA，利用Las-4G引物檢測并統(tǒng)計木虱帶菌量，對植株噴施70%吡蟲啉水分散粒劑（中科化工）2000倍進行蟲害防治，后放置于華南農業(yè)大學植物保護學院網室中，統(tǒng)一水肥管理。移除柑橘木虱后的60d開始對植株進行樹勢拍照觀察，至360 d結束。

1.4 感染不同CLas菌株的柑橘葉片韌皮部和薄壁組織切片觀察

在360 d時，對感染不同Las菌株葉片的葉中脈和葉肉組織的韌皮部和薄壁細胞進行觀察，具體方法：對病葉的葉柄往上約0.5 cm處截取約1 cm的葉中脈，對病葉左側葉片截取約0.5 cm×0.5 cm的矩形葉片，均放入F.A.A固定液中固定24 h。F.A.A固定液配比為福爾馬林溶液（38%甲醛）5 mL與70%酒精90 mL、冰醋酸5 mL[25]。固定后的樣品送往武漢塞維爾公司進行番紅固綠染色并制作石蠟切片，最后使用Nikon ECLIPSE Ni series顯微鏡對切片進行觀察并拍照記錄。

1.5 DNA提取和實時熒光定量PCR檢測

植物DNA提?。焊涕偃~片剪取葉中脈和枝條韌皮部直接剪碎進行DNA提取?？侱NA的提取方法參照 OMEGA BIO-TEK公司的植物DNA提取試劑盒HP Plant DNA Kit（200）（2485-02）。柑橘木虱DNA提?。簡晤^柑橘木虱成蟲和單頭5齡若蟲分別放入1.5 ml離心管中，使用研磨棒研磨后，提取方法參照北京天根生化科技公司的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（DP-304-02），DNA定容60μL。DNA樣品使用核酸定量儀Nanodrop（Thermo Fisher Scientific）進行純度和濃度的測定，提取的DNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

采用實時熒光定量PCR（qPCR）的方法對植物和昆蟲DNA樣品中的Las（Las-4G-qPCR）及其原噬菌體區(qū)域（Prophage-qPCR）進行檢測，參考ZHENG等的方法[10,25]，具體引物序列參照表1。所有反應均在Bio-Rad Real-Time PCR儀（Bio-Rad Laboratories Inc., HercuLes，CA，USA）上進行。針對1.2和1.3試驗中柑橘木虱和病株樣品采用Taq-Man-qPCR定量檢測，以ddH2O為空白對照，健康柑橘木虱DNA樣本為陰性對照，已知含有Las的柑橘木虱DNA為陽性對照。Taq-Man-qPCR產生的Ct值大于34代表樣本不含有Las，數(shù)值小于32代表樣本含有Las。參考文獻[26]中以菌株質粒和拷貝數(shù)為計算依據(jù)來檢測樣品中Las數(shù)量的方法，Las-4G-qPCR使用含有引物Las-4G擴增片段的pEASY-T1（TransGen Biotech）重組質粒制作標準曲線，共7個梯度（10倍稀釋）。初始的質粒濃度用核酸定量儀（Qubit）進行測定。質粒的拷貝數(shù)計算公式為質?？截悢?shù)=（阿伏伽德羅常數(shù)×濃度）/（重組質粒堿基對長度×1×109×650），阿伏伽德羅常數(shù)為6.022×1023，濃度單位為ng·μL-1。通過qPCR得出的標準曲線方程，計算每個引物的擴增效率，對每個樣品進行拷貝數(shù)的換算。Las的濃度以總DNA的換算拷貝數(shù)來表示，Las-4G 引物是針對Las基因組上具有3個拷貝的16S rRNA基因位點設計的引物，且DNA定容體積為60 μL，因此單頭柑橘木虱總Las數(shù)目的計算公式為（樣品換算拷貝數(shù)值/3）×60 μL。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)分析使用R語言實現(xiàn)，參考WU[15]的方法（https://gist.github.com/eduardofox2/7a904d7422bace 77e2d8f8ee517f77f5）?；谠囼灁?shù)據(jù)的重復性和正態(tài)分布分析，本試驗的數(shù)據(jù)使用非參數(shù)分析中的Kruskal-Wallis 秩和檢驗方法進行三因子分析和Wilcoxon Mann-Whitney檢驗進行雙因子分析。

2 結果

2.1 健康柑橘木虱若蟲與成蟲獲取不同CLas菌株的比較

利用Wilcoxon Mann-Whitney檢驗方法統(tǒng)計柑橘木虱若蟲期刺吸對Type-1+3-Las和Type-2-Las 的總獲菌率和獲菌量，結果如表2所示，在連續(xù)采樣時間內的總獲菌率和獲菌量均無顯著差異（獲菌率=0.08＞0.05；獲菌量=0.91＞0.05）。利用Kruskal-Wallis秩和檢驗方法對Type-1+3-Las和Type-2-Las在柑橘木虱體內的增殖情況進行分析，結果顯示5齡若蟲對Type-1+3-Las的獲菌率明顯低于羽化后成蟲的獲菌率，若蟲期對Type-2-Las和Type-1+3-Las的獲菌量分別在12 d和18 d達到最高，而Type-2-Las的獲菌量在18 d回落。

利用Wilcoxon Mann-Whitney檢驗方法統(tǒng)計柑橘木虱成蟲期刺吸對Type-1+3-Las和Type-2-Las的總獲菌率和獲菌量，結果如表2所示，健康柑橘木虱成蟲在連續(xù)采樣時間內對Type-2-Las的總獲菌率和獲菌量均顯著高于在Type-1+3-Las（獲菌率=0.009＜0.05；獲菌量=2.25e-05＜0.05），在12 d的Las個數(shù)達到最高的單蟲（4.59±1.27）×106個，顯著高于成蟲在其他時間段的獲菌量，且與木虱若蟲期在12 d時的獲菌量接近。

2.2 攜帶不同CLas菌株的柑橘木虱傳病情況及植株癥狀觀察

Type-1+3-Las和Type-2-Las的蟲傳植株分別有8個重復樣本。在進行蟲傳前，對健康砂糖橘嫩梢葉片進行qPCR檢測，結果顯示用于蟲傳試驗的植株在試驗前均不攜帶Las（表3）。在蟲傳兩周后對袋內存活的柑橘木虱進行檢測，結果顯示用于Type 1+3蟲傳的8組柑橘木虱的獲菌率為100%，Ct值范圍為21.25—22.84，而用于Type 2蟲傳的8組柑橘木虱除了CCT2-2、2-5、2-7、2-8植株的獲菌率分別為94.12%、50.00%、88.89%、20.00%外，其余4組柑橘木虱獲菌率均為100%，Ct值范圍為21.05—25.74（表3）。對獲菌率＞50%的柑橘木虱帶菌Ct值進行統(tǒng)計，結果表明在柑橘木虱體內的兩種菌株濃度無顯著差異。在移除媒介昆蟲后的60 d對兩組蟲傳的嫩梢進行qPCR檢測，結果顯示在60 d時，Type 1+3組的傳病率為87.5%，而Type 2組的傳病率為42.86%，至360 d時對抽發(fā)新梢進行檢測，蟲傳植株獲菌率均為100%。

表2 不同蟲期的柑橘木虱對不同CLas菌株的獲菌率及獲菌量

A柑橘木虱在5齡若蟲期收集were collected at 5th instar nymph stage；數(shù)據(jù)后小寫字母lowercases after the data：利用Kruskal-Wallis秩和檢驗方法對連續(xù)取樣時間內的數(shù)值進行統(tǒng)計分析，字母的相異表示在置信區(qū)間為95%的水平下，與其他值有顯著差異Kruskal-wallis rank sum test was used to statistic the value of continuous sampling times, different lowercases represent significant variance among the value within 95% confidence interval

表3 經柑橘木虱傳播的不同CLas菌株對植株的侵染情況

FL：柑橘木虱直接刺吸的嫩葉Flush leaves；NFL：柑橘木虱刺吸部位附近的嫩葉Near flush leaves；YFL：移除媒介昆蟲后新抽出的嫩葉Leaves emerged afterremoval。圖1同 The same as Fig. 1

對蟲傳后的植株的癥狀觀察結果顯示，在移除媒介昆蟲60 d時所有蟲傳植株的木虱刺吸部位出現(xiàn)了葉片卷曲、異常革質化的癥狀，但是并沒有出現(xiàn)明顯的黃龍病癥狀。在120 d時能觀察到鄰近的新梢出現(xiàn)斑駁的癥狀，而Type-2-Las蟲傳植株的斑駁癥狀更為嚴重；在360 d時，Type-2-Las病樹新抽出的葉片普遍出現(xiàn)葉小，均勻黃化等癥狀，而Type-1+3-Las病樹新抽出的葉片普遍為斑駁，葉肉輕微黃化，葉片大小正常（圖1）。

圖1 不同CLas菌株引起的柑橘黃龍病癥狀差異

2.3 感染不同CLas菌株的葉片韌皮部和薄壁組織的顯微切片觀察

分別采集圖1 中處于360 d的Type-1+3-Las和Type-2-Las的Ct值無顯著差異的新抽梢葉片，對其葉中脈和葉肉組織進行切片觀察，結果顯示在葉中脈組織中，與健康葉片相比，感染了Type-1+3-Las和Type-2-Las的韌皮部細胞出現(xiàn)明顯的不規(guī)則排列和細胞變形（圖2-a、2-c、2-e）。感染了Type-2-Las的中脈韌皮部細胞（圖2-c）較Type-1+3-Las的塌縮程度更為嚴重（圖2-a）。感染了Type-1+3-Las和Type-2-Las的中脈薄壁細胞對比健康葉片出現(xiàn)淀粉粒積累的現(xiàn)象，但是相比于Type-1+3-Las，Type-2-Las葉片的薄壁細胞出現(xiàn)了更明顯的淀粉粒積累（圖2-a、2-c）。在葉肉薄壁組織中，感染了Type-1+3-Las和Type-2-Las的葉片（圖2-b、2-d）對比健康葉片（圖2-f）出現(xiàn)明顯的淀粉粒積累，而感染Type-2-Las的葉肉薄壁組織中淀粉粒積累程度是最高的。

紅色數(shù)字：使用CLas-4G引物的Ct值Red numbers below the leaf images are the Ct value generated by qPCR using CLas-4G primer；黑色箭頭：指向淀粉粒積累的位置Black arrow pointed out the starch granule；紅色箭頭：指向韌皮部細胞塌縮的位置red arrow pointed out the collapse of phloem cell；藍色和紅色矩形框：葉肉和葉中脈組織切片采樣區(qū)域Mesophyll tissues enclosed by blue rectangle and midrib tissues enclosed by red rectangle in leaves were sampled for tissue section；Pa：薄壁細胞parenchyma cell；Ph：韌皮部phloem；Xy：木質部xylem；Fi：韌皮部纖維phloem fibers；Pi：髓心pith

3 討論

筆者課題組在2010—2019年間從廣東不同地市采集的柑橘黃龍病樣本中，檢出Type-2-Las為頻率最高的菌株，其次為Type-1+3-Las[10]。因此，本研究以柑橘木虱為傳病昆蟲媒介，研究Type-2-Las和Type-1+3-Las兩種不同菌株在柑橘木虱體內的增殖情況以及這兩種Las菌株對砂糖橘的致病力差異。

3.1 Type-2-CLas菌株的強增殖能力是其成為廣東地區(qū)主要菌株的原因

柑橘木虱在若蟲期分別獲取不同Las菌株后，雖然對Type-2-Las的獲菌指標都高于Type-1+ 3-Las，但是并沒達到統(tǒng)計學的差異。前人研究表明，柑橘木虱在若蟲期獲取Las的能力和隨后的增殖濃度都明顯高于成蟲期獲菌[15,17]，而這兩種Las菌株都成功在木虱若蟲體內增殖，原噬菌體區(qū)域的基因可能并未對Las的后期增殖產生顯著的影響。而柑橘木虱成蟲期對Type-2-Las的獲菌率和獲菌量顯著高于對Type-1+3-Las的獲菌率和獲菌量，推測原因可能是SC2（Type 2）可以編碼黏附素，從而增強病菌在寄主細胞上的黏附性[6]，促使Type-2-Las對比于Type-1+3-Las更容易侵染柑橘木虱成蟲，且具備在木虱體內增殖的能力。WU等[15]研究表明，在成蟲期獲菌的柑橘木虱比在若蟲期獲菌的木虱更難以傳播病菌至植株，這是因為健康柑橘木虱只能獲取低濃度的Las。本試驗結果顯示，雖然成蟲期柑橘木虱的獲菌率仍然顯著低于若蟲期獲菌，但成蟲期在12 d檢測到的Type-2-Las獲菌量與若蟲期在12 d檢測到的Type- 2-Las獲菌量無顯著差異（表2）。CCT2-8植株被攜帶Type-2-Las的兩頭柑橘木虱刺吸，在移除媒介昆蟲360 d時可檢測出黃龍病菌（表3）。結合前人研究中提到，單頭帶菌柑橘木虱可傳播Las至植株[14,16]。筆者由此推斷健康柑橘木虱成蟲也存在一定概率獲得較高的Type-2-Las濃度且具備傳播能力，這可能是Type-2-Las菌株在廣東地區(qū)始終保持優(yōu)勢地位的原因。Type-2-Las菌株在廣東等低海拔地區(qū)為優(yōu)勢菌株，而在中國高海拔地區(qū)，如云南、貴州等地，則以Type 1+3-Las 菌株為主[27]。同樣地，在云南、貴州、四川等高海拔地區(qū)的柑橘木虱種群為MG1種群，區(qū)別于廣東、廣西地區(qū)的MG2種群[28]。因此未來可以進一步探討云南、貴州、四川地區(qū)柑橘木虱種群對Type-1+3-Las菌株的獲取情況和傳播能力，這將為柑橘木虱和柑橘黃龍病菌共進化提供直接證據(jù)。

3.2 Type-2-CLas菌株對砂糖橘造成的嚴重癥狀與其自身致病因子與侵染的寄主品種相關

本研究對蟲傳后的植株進行跟蹤拍照，發(fā)現(xiàn)木虱直接刺吸的部位都發(fā)生了物理上的形變（圖1），與前人描述的物理危害一致[29]。在移除媒介昆蟲后的60 d和120 d時可在直接刺吸的葉片檢測出高濃度病菌（較低的Ct值），可葉片并未出現(xiàn)典型的黃龍病癥狀。這可能是由于Las具有編碼過氧化物酶基因的能力，降低植物的自身免疫反應，延緩了被刺吸葉片上癥狀的表現(xiàn)，間接增強Las定殖能力[30]。而在120 d時，在兩種類型的病株上都觀察到鄰近的新梢葉片（未被直接刺吸），仍出現(xiàn)斑駁的癥狀，這與PANDEY等[31]近期的蟲傳研究結果一致。從總體癥狀上觀察，Type-2-Las對柑橘葉片造成的癥狀比Type-1+3-Las的嚴重，特別是360 d時，Type-2-Las的病株抽出的新梢成熟后均為小葉、嚴重革質化、均勻黃化的癥狀（圖1）。對感病葉片的韌皮部和薄壁細胞進行顯微觀察，可清晰看出Type-2-Las葉片的韌皮部塌縮情況和淀粉粒積累情況嚴重于Type-1+3-Las的葉片（圖2）。植株對Las的免疫應激響應會導致韌皮部篩管堵塞，進而造成韌皮部細胞塌縮，光合產物無法運轉出去，而光合作用相關基因的上調進一步加劇淀粉粒在薄壁細胞的積累[23]。淀粉的積累會負反饋調節(jié)光合作用，并且過量的淀粉積累會破壞葉綠體的類囊體結構，加劇葉片的衰老[32]。由此推測Type-2-Las 菌株導致的均勻黃化癥狀與過量淀粉粒積累有關。由于處于同等發(fā)育狀態(tài)且具有接近Las濃度的Type-1+3類型感病葉片并未出現(xiàn)如此嚴重的癥狀，因此本研究推測砂糖橘在感染Type-2-Las之后產生更嚴重的癥狀的原因可能有兩點：（1）Type-2-Las菌株本身相對于Type-1+3-Las具有更強的致病因子，這部分基因可能在Type 2原噬菌體序列上，目前已知的是Type-2-Las具有編碼過氧化物酶基因的能力[11]，而過氧化物酶可降解由植物產生的過氧化合物，從而增強Type-2-Las的系統(tǒng)侵染能力；（2）本研究使用的指示植物為廣東傳統(tǒng)種植的砂糖橘，而不同柑橘品種對于柑橘黃龍病的抗性和癥狀表現(xiàn)程度均不相同，如椪柑是感病品種，植株葉片感染后會顯現(xiàn)典型的斑駁黃化、小葉等癥狀，而琯溪蜜柚是耐病品種，葉片僅顯現(xiàn)斑駁、褪綠的等輕微癥狀[33]。

3.3 展望

在本文中僅開展了Type-1+3-Las和Type-2-Las菌株對砂糖橘的致病力差異研究，而在今后可進一步比較這兩種菌株對其他柑橘品種造成癥狀的差異，這對于病原-寄主互作研究具有一定的意義。Type-2-Las更易于在東南地區(qū)柑橘木虱種群成蟲內增殖且具有較高傳播能力，說明Type-2-Las具有高傳染性；另外，通過柑橘木虱傳播Type-2-Las導致砂糖橘表現(xiàn)更為嚴重的葉片癥狀和韌皮部組織破壞，說明Type-2-Las菌株對于砂糖橘具有更強的致病性，綜合以上兩個結果可得出在我國廣東地區(qū)，Type-2-Las比Type-1+3-Las對砂糖橘具有更高的危害性。已知Type-1+3-Las和Type -2-Las的基因組存在差異，因此今后可通過病原-媒介-寄主三者互作轉錄組分析等手段挖掘造成這兩種菌株致病力差異的基因和效應因子，進一步探明造成這一差異的致病機制與通路。

4 結論

Type-2-Las 比Type-1+3-Las更容易在柑橘木虱成蟲體內增殖，且達到較高的病菌濃度，證明Type-2-Las菌株具有高傳染性。感染Type-2-Las的新葉呈現(xiàn)均勻黃化、葉小、革質化的癥狀，Type-2-Las比Type-1+3-Las造成更嚴重的葉脈韌皮部塌縮和淀粉粒積累情況，表明在我國廣東地區(qū)，Type-2-Las比Type-1+3-Las對柑橘具有更強的致病力。

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Proliferation of Two Types Prophage of ‘Liberibacter asiaticus’ inand their Pathogenicity

HUANG JiaQuan1, LI Li1, WU FengNian2, ZHENG Zheng1, DENG XiaoLing1

1College of Plant Protection, South China Agricultural University, Guangzhou 510642;2School of Life Sciences and Food Engineering, Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, Guangdong

【】In China, citrus Huanglongbing is a destructive disease associated with ‘liberibacter asiaticus’ (Las), which currently threatening the sustainable development of citrus industry. Previous studies had identified three types of prophage sequences in the genome ofLas strains. Prophage group typing analysis revealed that the Type 2 prophage strains and Type 1+3 prophage strains dominated in Guangdong province. However, the difference in propagation capacity of these two strains ofLas in Asian citri psyllid () and pathogenicity of these two strains leading by insect transmission remains unknown.【】The objective of this study is to assess the difference in proliferation capacity between Type-2-Las and Type-1+3-Las inand the pathogenicity variations between them onBlanco cv. shatangju.【】The buds with different strains ofLas were grafted to healthy Shatangju. Fifty nymphal and fifty adultwere caged on the young shoots of infected shatangjuto acquire different strains ofLas for 6, 12, and 18 days, respectively. Real-time quantitative PCR (qPCR) was used to detect and analyze the difference in the acquisition rate and quantity of Type-2-Las and Type-1+3-Las between the nymphal stage and the adult stage of. Further, twenty adultinfected with Type-2-Las or Type-1+3-Las were placed on the young shoots of healthy shatangju to inoculate for two weeks, respectively. Thewere collected and detected by qPCR. The general information of infection rate and quantity ofLas was collected. Symptom development of shatangju and titers ofLas in leaves were monitored each month. Morphological change of leaves phloem and parenchyma cell was visualized by light microscopy 360 days after inoculation.【】There was no significant difference between acquisition rate and quantity of Type-2-Las and Type-1+3-Las detected inthat fed on the infected plant at the nymphal stage. In contrast to fed as nymphs, the acquisition rate and quantity of Type-2-Las were significantly higher than Type-1+3-Las whenfed on infected plant at the adult stage. The leaves presented more severe mottled symptom after inoculation with Type-2-Las at 120 d afterremoval. The immature leaves at young shoots had an obstacle on turning green, presenting leathery, small size, and yellowing which was infected with Type-2-Las. The symptoms on Type-1+3-Las infected plants were presented as typical mottled leaves and leathery. Anatomical analyses indicated that Type-2-Las caused more severe damage to phloem and accumulated more starch in parenchyma cell even if the titer of Type-1+3-Las was closed to Type-2-Las.【】Compared to Type-1+3-Las, Type-2-Las was more capable of invading and proliferating in adult, accompanied by a higher titer ofLas which indirectly proved the high contagious capacity of Type-2-Las. The young leaves infected with Type-2-Las presented symptoms of uniform yellowing, small size, while infected with Type-1+3-Las showed lightly mottled and leathery. Type-2-Las destroyed more phloem cells and caused severe starch accumulation, indicating that Type-2-Las had stronger pathogenicity to citrus than Type-1+3-Las.

citrus Huanglongbing; ‘Liberibacter asiaticus’ (Las); prophage;; pathogenicity

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.04.008

2021-07-14；

2021-08-13

國家自然科學基金青年科學基金（31801742）、廣東省重點研發(fā)計劃（2019B020217003）

黃家權，E-mail：380794041@qq.com。通信作者鄧曉玲，E-mail：xldeng@scau.edu.cn

（責任編輯 岳梅）