楊濱娟，李萍，胡啟良，黃國勤

紫云英與油菜混播對稻田土壤N2O排放及相關(guān)功能基因豐度的影響

楊濱娟，李萍，胡啟良，黃國勤

江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)科學(xué)研究中心，南昌 330045

【】探究綠肥混播對稻田土壤N2O的減排效果和機(jī)制，篩選既高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，又減排的適合南方雙季稻區(qū)發(fā)展應(yīng)用的綠肥混播種植模式。比較不同紫云英與油菜混播比例（單播紫云英（CK1）、單播油菜（CK2）)、3/4紫云英+1/4油菜（3/4M + 1/4R）、1/2紫云英+1/2油菜（1/2M + 1/2R）、1/4紫云英+3/4油菜（1/4M + 3/4R））對稻田N2O排放規(guī)律及相關(guān)功能基因的影響。（1）作物種類影響N2O排放。各處理的N2O排放規(guī)律基本一致，其中冬作季N2O排放主要集中在冬季綠肥的盛花期，早晚稻季主要集中在水稻的分蘗、灌漿和成熟期?？傮w來看，稻田N2O排放主要集中在水稻季，早稻季的N2O排放量低于晚稻季；2018年稻田N2O排放通量總體比2019年高。（2）各處理的早稻N2O累積排放量差異均不顯著。連續(xù)兩年單播處理的N2O累積排放量低于混播各處理，其中2019年處理CK1最低，處理3/4M+1/4R的N2O周年累積排放量在各混播處理中最低。（3）整體來看，晚稻土壤的-AOA和-AOB基因拷貝數(shù)比早稻要高，-AOA基因拷貝數(shù)比-AOB高1—2個數(shù)量級。晚稻的土壤、、基因拷貝數(shù)比早稻要高，其中基因拷貝數(shù)比和高1—2個數(shù)量級。紫云英與油菜混播提高了土壤-AOA和-AOB基因豐度，-AOA基因為優(yōu)勢功能基因，而且提高了土壤、、基因豐度，基因占主導(dǎo)地位。反硝化基因拷貝數(shù)比硝化基因拷貝數(shù)高1—3個數(shù)量級，反硝化作用對N2O排放貢獻(xiàn)更大?！?/4紫云英+1/4油菜-早稻-晚稻”種植模式在保證高產(chǎn)和高肥力的情況下，N2O排放量相對較低，是較理想的種植模式。

紫云英；油菜；綠肥混播；氧化亞氮；功能基因；稻田

0 引言

【研究意義】雙季稻田冬種綠肥的稻田三熟制是我國南方一種傳統(tǒng)的種植模式[1-2]。但目前普遍存在綠肥種子價格高、成苗率低、鮮草量少等問題，制約了綠肥種植技術(shù)的直接經(jīng)濟(jì)效益，導(dǎo)致農(nóng)民種植積極性不高。冬季綠肥紫云英（含氮量較高）和油菜（含磷鉀較高）混播不但能滿足水稻不同生長時期對養(yǎng)分的需求，而且能充分利用各自生育上的時間差和生長上的空間差，從而提高光能和土地的利用率[3-4]，其可持續(xù)能值指數(shù)為0.0315，環(huán)境負(fù)載率較低[5]。因此，在南方雙季稻區(qū)合理開發(fā)紫云英、油菜混播模式，對發(fā)展冬季綠肥、高效利用農(nóng)業(yè)資源、改善土壤性狀、提高經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大氣中N2O對溫室效應(yīng)的貢獻(xiàn)率僅為5%[6]，但其增溫效應(yīng)約為CO2的296—310倍，在大氣中的存留時間長達(dá)150年左右[7]。水稻生長季排放的N2O占稻田總排放量的7%—11%[8]。有報道指出在淹水稻田等厭氧環(huán)境下，土壤硝化作用受到限制，N2O主要來源于土壤反硝化作用。土壤農(nóng)田管理措施和土壤性質(zhì)都會對、、型反硝化細(xì)菌微生物豐度和多樣性產(chǎn)生一定影響[9]，尤其是、、群落對于土壤pH和土壤速效氮較為敏感[10]。冬季綠肥在生長發(fā)育過程中會產(chǎn)生一系列復(fù)雜的生理生化作用，改變了以土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量及其活性等微生態(tài)環(huán)境為主的根際土壤環(huán)境[11]，直接或間接影響了土壤中硝化反硝化過程，從而影響土壤中N2O的排放和各形態(tài)氮庫容量及其相互轉(zhuǎn)化與平衡。另外，農(nóng)田作物多樣性改變，增加了農(nóng)田生物多樣性[12]。紫云英、油菜混播相比常規(guī)冬種綠肥模式，由于根系分布的范圍不同，根系分泌物、根系微生物區(qū)系、生長特性等諸方面不同，可能會對稻田土壤氮循環(huán)微生物群落產(chǎn)生不同的影響。王艷秋等[13]研究表明，在江西黃泥田中，紫云英翻壓還田能提高土壤硝化強(qiáng)度及硝化勢，進(jìn)而顯著提高-AOA和-AOB的基因豐度。高嵩涓[14]研究結(jié)果顯示，冬種紫云英翻壓還田后增加了酸性紅壤中的-AOA-AOB和的基因豐度，紫云英與化肥配施能提高土壤中的基因豐度。【本研究切入點】但綠肥混播模式下稻田N2O排放及土壤相關(guān)硝化與反硝化基因豐度的研究較少。【擬解決的關(guān)鍵問題】因此，開展紫云英、油菜混播對稻田土壤N2O相關(guān)功能基因豐度的影響，為減少稻田氧化亞氮排放和構(gòu)建氧化亞氮等溫室氣體減排的稻作制度提供重要理論指導(dǎo)與技術(shù)支撐，也為紫云英、油菜混播技術(shù)的推廣應(yīng)用以及南方稻區(qū)生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗從2017年9月開始，在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技園水稻試驗田（28°46′N，115°55′E）進(jìn)行。試驗地屬于亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候，年均太陽總輻射量為4.79×1013J·hm-2，年均日照時數(shù)為1 852 h。光照分布與水稻生長旺季基本同步，對水稻生產(chǎn)有利?！?℃的年積溫達(dá)6 450℃，年降水量1 624 mm，年平均氣溫17.1—17.8℃。供試土壤為發(fā)育于第四紀(jì)的紅黏土，為亞熱帶典型紅壤分布區(qū)。試驗前表層（0—15 cm）土壤pH 5.29，有機(jī)質(zhì)38.87 g·kg-1，全氮2.90 g·kg-1，堿解氮137.38 mg·kg-1，全磷0.56 g·kg-1，全鉀21.24 g·kg-1，有效磷10.68 mg·kg-1，速效鉀36.22 mg·kg-1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)5個處理，3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，共15個小區(qū)，小區(qū)面積16.5 m2（5.5 m×3 m），小區(qū)之間用水泥埂隔開，試驗前各小區(qū)土壤肥力均勻一致。兩邊設(shè)有保護(hù)行，保護(hù)行寬度為30 cm。具體試驗處理為：單播紫云英（CK1）；單播油菜（CK2）；3/4紫云英+ 1/4油菜（3/4M + 1/4R）；1/2紫云英+ 1/2油菜（1/2M + 1/2R）；1/4紫云英+ 3/4油菜（1/4M + 3/4R），其他季節(jié)的種植模式均為雙季稻。

紫云英品種為余江大葉籽、油菜為德油5號、早稻為中嘉早17、晚稻為天優(yōu)華占。

田間管理措施：（1）冬季綠肥。2017—2018年：紫云英2017年10月2日撒播，不施肥；油菜2017年11月12日撒播，不施肥；2018年4月5日進(jìn)行冬季綠肥測產(chǎn)。2018—2019年：紫云英2018年10月1日撒播，不施肥；油菜2018年11月11日撒播，不施肥；2019年4月7日進(jìn)行冬季綠肥測產(chǎn)。單播紫云英播種量均為22.5 kg·hm-2，單播油菜播種量均為7.5 kg·hm-2，紫云英與油菜混播處理按照試驗設(shè)計要求的比例換算相應(yīng)的播種量。所有冬季綠肥在早稻移栽前15 d全部收割翻壓還田，漚8—10 d即可進(jìn)行常規(guī)耙田、施肥和早稻移栽。在翻壓時先適度截斷油菜莖稈，然后將紫云英和油菜同向翻壓，使土壤完全覆蓋紫云英和油菜植株，然后封住稻田排水口漚制，漚制時保持田面有水且最高水位不高于1.25 cm。（2）雙季稻：2018年早稻于2018年3月28日播種，4月26日施基肥，4月27日以行距為0.2 m，株距為0.2 m移栽，5月5日追加分蘗肥，5月25日開始排水曬田，6月8日追加穗肥，7月16日收獲；晚稻于2018年6月23日播種，7月24日施基肥，7月25日以行距為0.2 m，株距為0.2 m移栽，8月5日追加分蘗肥，8月25日開始排水曬田，9月4日追加穗肥，10月27日收獲。2019年早稻于2019年3月27日播種，4月22日施基肥，4月26日以行距為0.2 m，株距為0.2 m移栽，5月8日追加分蘗肥，5月30日開始排水曬田，6月14日追加穗肥，7月24日收獲；晚稻于2019年7月1日播種，8月2日施基肥，8月3日以行距為0.2 m，株距為0.2 m移栽，8月11日追加分蘗肥，8月30日開始排水曬田，9月14日追加穗肥，11月1日收獲。

化肥種類及用量參照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)施肥：所有作物施用化肥均為尿素（N 46%），鈣鎂磷肥（P2O512%），氯化鉀（K2O 60%）。水稻當(dāng)?shù)厥┓食Ｒ?guī)用量為180 kg N·hm-2、90 kg P2O5·hm-2、120 kg K2O·hm-2。氮肥按基肥﹕分蘗肥﹕穗肥= 3﹕4﹕3施用；磷肥全部作基肥，一次性施入；鉀肥按分蘗肥﹕穗肥=7﹕3施用。早晚稻收獲后所有處理秸稈均不還田。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 土壤N2O 采用靜態(tài)暗箱-氣相色譜法測定田間小區(qū)溫室氣體排放。靜態(tài)箱長、寬、高均為0.5 m，采樣箱體由304不銹鋼材質(zhì)制成，箱體高度隨水稻高度而增加（拔節(jié)期前放置一層0.5 m，拔節(jié)期后放置兩層共1 m）。采樣箱內(nèi)頂部裝有12V小風(fēng)扇，防止箱內(nèi)氣體不均勻。箱子頂部設(shè)有3個小孔，分別為風(fēng)扇電池接口、溫度計插口、采氣孔，采氣孔插入硅膠管然后用注射器連接，用三通閥控制開關(guān)。外部包有白色海綿罩，防止太陽照射導(dǎo)致箱內(nèi)溫度變化過大。綠肥生長季10—15 d采樣1次，水稻生長季一般7 d采樣1次。采樣時間為上午9：00—11：00，采樣前將采樣箱體置于事先埋好的底座上，采樣時用50 mL注射器來回抽5—10次以混勻氣體，隨后抽取氣體樣品到氣袋中，4個連續(xù)樣品分別在箱體密閉后按0、10、20和30 min的時間間隔用50 mL的注射器采集氣體，3 d內(nèi)利用A7890b安捷倫氣相色譜（美國安捷倫科技有限公司）完成N2O濃度測定，其中，N2O檢測器ECD檢測溫度為300℃，柱溫60℃，載氣為99.99%高純氬/甲烷氣（95%氬氣＋5%甲烷），流速40 mL·min-1。

（1）氣體排放通量計算公式為：

F=ρ×h×dc/dt×273/(273+T)

式中，F(xiàn)為氣體排放通量（mg·m-2·h-1或μg·m-2·h-1），ρ為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下氣體的密度（kg·m-3），h是采樣箱的凈高度（m），dc/dt為單位時間內(nèi)采樣箱內(nèi)氣體的濃度變化率，T為采樣過程中采樣箱內(nèi)的平均溫度（℃），273為氣態(tài)方程常數(shù)[15]。

（2）N2O累積排放量（EN2O，kg N·hm-2）的計算公式[16]如下：

EN2O=∑(fi+fi+1)/2×(ti+1-ti)×24×10-2

式中，f代表N2O氣體通量（mg N2O-N·m-2·h-1），i代表測量次數(shù)，（ti+1-ti）代表兩次鄰近測量天數(shù)。

1.3.2 土壤功能基因豐度 分別于2019年5月12日（早稻分蘗期）、7月24日（早稻成熟期）、8月14日（晚稻分蘗期）、11月1日（晚稻成熟期）隨機(jī)在各小區(qū)選取5個點，采集0—15 cm土層土樣進(jìn)行混勻，手工挑去礫石和植物殘體等，然后用干冰冷凍保存，樣品委托武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測定。

本試驗以土壤中氨氧化古菌基因、氨氧化細(xì)菌基因、亞硝酸鹽還原酶（）基因和一氧化二氮還原酶（）基因的拷貝數(shù)分別表示AOA、AOB 、和基因型豐度。利用熒光定量PCR技術(shù)依次檢測AOAAOB和基因拷貝數(shù)，即用SYBR? Select Master Mix（2X）試劑盒，在熒光定量PCR儀（Applied Biosystems StepOnePlus? Real-Time System）上進(jìn)行絕對定量PCR的分析，具體PCR引物如表1。定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線采用含有AOAAOB和基因的克隆進(jìn)行制備。首先采用特定引物分別擴(kuò)增目的基因，構(gòu)建克隆文庫后，將含有目的基因的克隆在培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒純化并測定質(zhì)粒濃度，根據(jù)摩爾常數(shù)計算標(biāo)準(zhǔn)品基因的拷貝數(shù)，取標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒稀釋至109，然后取10 μL加入到90 μL無菌水中，依次10倍梯度稀釋得到108、107、106、105、104、103，6個濃度梯度按照定量PCR中引物信息實驗條件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取qPCR96Well，配制反應(yīng)體系，每個反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。定量PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，包括2xqPCRmix10 μL、上下游引物（5 pmol·μL-1）各1 μL、DAN模板2 μL、滅菌水6 μL。試驗控制擴(kuò)增率在83.0%—105.0%。將得到的結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，以不同濃度質(zhì)粒的Cp值為橫坐標(biāo)建立出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算基因豐度。

表1 實時熒光定量PCR擴(kuò)增引物

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用 Microsoft Excel 2010 處理數(shù)據(jù)；StepOne Software v2.3軟件分析功能基因豐度數(shù)據(jù)；SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 不同混播比例對稻田土壤N2O排放的影響

2.1.1 稻田N2O排放通量的動態(tài)變化 2018年N2O的總體排放量比較少，各處理的N2O排放規(guī)律基本一致。冬作季出現(xiàn)了2個排放高峰（2017年11月26日和2018年4月1日），峰值分別為處理1/2M+1/2R的48.49 μg·m-2·h-1和處理CK2的30.09 μg·m-2·h-1，而兩個時期排放最低的是處理3/4M+ 1/4R和1/2M+1/2R，分別低于峰值67.5%和66.5%。在早稻季和晚稻季均出現(xiàn)了3個排放高峰，而全年N2O的排放最高峰出現(xiàn)在晚稻季的10月14日，峰值為處理1/4M+3/4R的111 μg·m-2·h-1，排放最低的為CK2的43.37 μg·m-2·h-1。總體來看，單播處理的N2O排放量要低于混播各處理，混播處理中3/4M+ 1/4R排放量較低。

數(shù)據(jù)為2017年冬作起至2018年晚稻收獲后 The data is between winter crop in 2017 and harvest of the late rice in 2018

數(shù)據(jù)為2018年冬作起至2019年晚稻收獲后 The data is between winter crop in 2018 and harvest of the late rice in 2019

2019年稻田N2O排放通量總體低于2018年。冬作季各處理N2O排放通量很低，排放范圍為-11.46—12.52 μg·m-2·h-1。冬作季也出現(xiàn)了2個排放高峰（1月12日和3月30日），峰值分別為處理1/4M+3/4R的11.24 μg·m-2·h-1和處理1/2M+1/2R的12.52 μg·m-2·h-1。早稻季出現(xiàn)了3個排放高峰，晚稻季比2018年多了1個排放小高峰，出現(xiàn)了4個排放高峰，但2019年晚稻季排放通量總體要低于2018年?？傮w來看，與2018年趨勢一致，單播處理的N2O排放量要低于混播各處理，混播處理中的3/4M+1/4R排放量較低。

2.1.2 稻田N2O累積排放量 由表2可知，2018年冬作季，混播各處理N2O累積排放量均高于處理CK1，處理1/2M+1/2R最高，處理CK1累積排放量最低，且除了處理3/4M+1/4R外，與其他處理間差異顯著（＜0.05）；但早晚稻各處理間差異不顯著（＞0.05）。總的來看，兩個對照的N2O累積排放量要低于混播各處理，其中處理CK2的累積排放量最低，比其他處理分別低1.8%、20.6%、27.0%、22.9%。2019年，冬作季各處理累積排放量很低，其中CK1最低為-0.11 kg·hm-2，且與其他處理存在顯著差異（＜0.05）；晚稻季，處理CK2最低，處理1/2M+1/2R最高，除了處理1/4M+3/4R外，與其他處理間差異顯著（＜0.05），但早稻季各處理間差異不顯著（＞0.05）?？偟膩砜?，單播N2O累積排放量要低于混播各處理，處理CK1低于其他處理14.8%—61.0%，處理CK1、CK2、3/4M +1/4R與處理1/2M+1/2R、1/4M + 3/4R間差異顯著（＜0.05）。綜合兩年數(shù)據(jù)可以看出，2019年的累積排放量低于2018年，作物種類會影響N2O的排放。冬種不同作物還田對早稻N2O排放沒有顯著影響。單播處理的N2O累積排放量低于混播各處理，其中2018年處理CK2的周年N2O的累積排放量最低，2019年處理CK1最低，處理3/4M+1/4R的N2O周年累積排放量在各混播處理中最低。

2.2 不同混播比例對土壤硝化和反硝化功能基因豐度的影響

2.2.1基因豐度 由圖3可知，土壤-AOA基因各處理各時期間差異均不顯著（＞0.05）。由圖4可知，處理CK2的土壤AOB基因拷貝數(shù)在早稻分蘗期（5月12日）、成熟期（7月24日）和晚稻成熟期（11月1日）均達(dá)到最大，但晚稻成熟期各處理間差異不顯著（＞0.05）。處理CK2在早稻分蘗期，除了處理1/2M+1/2R，顯著高出其他處理182.1% —530.0%（＜0.05）；在成熟期達(dá)到7.37×105copies·g-1，顯著高于其他處理（＜0.05）。晚稻分蘗期（8月14日）的土壤AOB基因拷貝數(shù)較早稻分蘗期有所增加，處理1/2M + 1/2R最高，顯著高出兩個對照處理137.1%、216.8%（＜0.05）。整體來看，晚稻土壤的AOA和AOB基因拷貝數(shù)比早稻要高，AOA基因拷貝數(shù)比AOB高1—2個數(shù)量級。

表2 各處理N2O累積排放量

同列不同的字母分別表示差異達(dá)5%顯著水平。下同 The different letter in same column indicated significantly at 5% levels. The same as below

圖3 土壤amoA-AOA基因豐度變化

圖4 amoA-AOB基因豐度變化

2.2.2、、基因豐度 由圖5可知，早稻分蘗期和晚稻分蘗、成熟期的土壤基因拷貝數(shù)均是處理1/4M+3/4R達(dá)到最大，但早稻分蘗期和晚稻成熟期各處理間差異不顯著（＞0.05），在晚稻分蘗期處理1/4M+3/4R與處理1/2M+1/2R達(dá)到顯著差異（＜0.05）。早稻成熟期的土壤基因的拷貝數(shù)處理CK2最高，但僅與處理3/4M+1/4R間差異顯著（＜0.05）。土壤基因的拷貝數(shù)總體表現(xiàn)為晚稻高于早稻，處理1/4M+3/4R表現(xiàn)較好。由圖6可知，早稻分蘗期、晚稻分蘗期和晚稻成熟期的土壤基因拷貝數(shù)各處理間差異不顯著（＞0.05）；早稻成熟期是CK2達(dá)到最大，且與其他處理間差異顯著（＜0.05）。由圖7可知，早稻分蘗期和晚稻分蘗、成熟期的土壤基因拷貝數(shù)各處理間均差異不顯著（＞0.05）。早稻成熟期CK2處理達(dá)到最大，為7.06×107copies·g-1，且顯著高出其他處理43.5%—106.4%（＜0.05）?？傮w來看，晚稻的土壤基因拷貝數(shù)比早稻要高，其中基因拷貝數(shù)比和高1—2個數(shù)量級。反硝化基因拷貝數(shù)比硝化基因拷貝數(shù)高1—3個數(shù)量級。其中處理1/4M+3/4R和CK2表現(xiàn)較好。

圖5 土壤nirS基因豐度變化

圖6 土壤nirK基因豐度變化

圖7 土壤nosZ基因豐度變化

3 討論

3.1 稻田N2O排放主要影響因素

稻田N2O排放主要受田間水分管理、作物種類及肥料施用等的影響[22-23]。冬作季N2O的排放主要集中在冬季綠肥的盛花期，因為當(dāng)溫度達(dá)到土壤微生物的最適溫度時，能夠刺激微生物活動，從而促進(jìn)N2O的排放，這與唐海明等[24]的研究結(jié)果一致。而水稻季N2O的排放主要集中在水稻的分蘗、灌漿和成熟期，主要是因為稻田灌溉-排水曬田、下雨等造成的干濕交替環(huán)境及施肥增加了N2O的排放[25-26]，這與張岳芳等[27]、田偉等[28]的研究結(jié)果一致。GOLDBERG等[29]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土壤含水量較低時會出現(xiàn)N2O負(fù)排放。本研究中，N2O排放量為負(fù)值多集中在冬作季，因為與水稻季相比，冬季土壤多為干旱環(huán)境并且冬季溫度較低，導(dǎo)致出現(xiàn)凈吸收。本試驗結(jié)果還表明，2019年各處理的周年累積排放量比2018年降低了20.0%—58.2%，說明冬季綠肥翻壓還田可以降低N2O的排放，這與常單娜等[30]、聶江文等[31]研究結(jié)果相似，但還需要長期的監(jiān)測。唐海明等[32]研究表明，不同冬季作物種類會影響稻田N2O的排放。本研究中，綠肥混播各處理的N2O排放總量比單播要高，一方面是因為綠肥翻壓還田后，混播的腐解速率要高于單播[33]，釋放更多的養(yǎng)分，另一方面是由于混播能夠改善土壤化學(xué)性狀，提高土壤肥力，為土壤提供充足的營養(yǎng)條件，從而使混播的碳氮比更能滿足土壤微生物的需求，為硝化與反硝化作用過程提供了豐富的基質(zhì)，從而增加了N2O的排放。但在各混播處理中3/4M+1/4R的N2O周年累積排放量最低。另外，本研究N2O的累積排放量高于朱波等[34]、紀(jì)欽陽等[35]的研究結(jié)果，低于鐘川等[36]的研究結(jié)果，這可能與作物種類、種植模式、施肥方式有關(guān)。

3.2 稻田N2O相關(guān)功能基因豐度

微生物轉(zhuǎn)化過程主要是含有氧化亞氮還原酶（NOS）基因的反硝化微生物將N2O還原為N2的過程。氧化亞氮還原酶（NOS）在反硝化過程中主導(dǎo)N2O的還原，因此以氧化亞氮還原酶基因（）為靶基因揭示微生物種群的N2O消耗還原能力是較直觀的[37]。本研究也得出類似結(jié)果，晚稻土壤基因拷貝數(shù)比早稻要高，其中基因拷貝數(shù)比和高1—2個數(shù)量級。本試驗土壤為酸性土壤，pH在4.85—5.55之間，而AOA的豐度比AOB高1—2個數(shù)量級，說明在酸性環(huán)境中AOA基因豐度高于AOB，且在硝化作用中AOA占比更高，這與李雙雙等[38]研究結(jié)果類似。土壤NO3-含量的增加可以提高反硝化速率[39]，土壤有機(jī)質(zhì)可以為反硝化微生物提供能量和良好的反應(yīng)條件，進(jìn)而有利于反硝化過程的發(fā)生[40-41]。本研究結(jié)果亦表明，土壤反硝化基因拷貝數(shù)方面是處理1/4M+3/4R和CK2表現(xiàn)較好，而通過土壤理化性質(zhì)分析[42]，處理1/4M+3/4R能提高土壤全氮、堿解氮和有機(jī)質(zhì)含量，進(jìn)一步影響了土壤反硝化基因進(jìn)程，與前人結(jié)果一致。同時，本研究中土壤基因豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于AOAAOB基因豐度，說明反硝化作用對N2O的貢獻(xiàn)更大。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，晚稻土壤中的AOA、AOB、基因豐度比早稻要高，說明紫云英與油菜混播能提高土壤硝化和反硝化基因豐度。由于本研究試驗時間較短，導(dǎo)致有不少指標(biāo)差異不顯著，需繼續(xù)定位試驗加以探究。在今后的試驗中可增加與N2O排放相關(guān)的影響指標(biāo)如土壤含水量、Eh等，進(jìn)行更深入研究。

4 結(jié)論

冬作季N2O排放主要集中在冬季綠肥的盛花期，早晚稻季N2O排放主要集中在水稻的分蘗、灌漿和成熟期。總體來看，稻田N2O排放主要集中在水稻季，早稻季的N2O排放量要低于晚稻季。連續(xù)兩年的N2O周年累積排放量均是單播處理比混播處理要低，而混播處理中3/4M+1/4R的N2O周年累積排放量最低。反硝化作用對N2O排放貢獻(xiàn)更大。紫云英與油菜混播提高了土壤AOA和AOB基因豐度，AOA基因為優(yōu)勢功能基因，而且提高了土壤基因豐度，基因占主導(dǎo)地位。綜合來看，“3/4紫云英+1/4油菜-早稻-晚稻”種植模式在保證高產(chǎn)和高肥力的情況下，N2O排放量相對較低，是較理想的種植模式。

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Effects of the Mixted-cropping of Chinese Milk Vetch and Rape on Soil Nitrous Oxide Emission and Abundance of Related Functional Genes in Paddy Fields

YANG BinJuan, LI Ping, HU QiLiang, HUANG GuoQin

College of Agronomy, Jiangxi Agricultural University/Research Center on Ecological Science Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045

【】The aim of this study was to determine how a green manure mixted-cropping affected nitrous oxide (N2O) emissions from soil and the abundance of related functional genes in paddy field soil. The ultimate aim of this research was to identify a green manure mixted-cropping that had high and stable yields and reduces emissions, and was suitable for cultivation in the double-rice areas of southern China.【】The effects of mixted-cropping of Chinese milk vetch and rape at different ratios (single Chinese milk vetch, single rape, 3/4 Chinese milk vetch +1/4 rape, 1/2 Chinese milk vetch +1/2 rape, and 1/4 Chinese milk vetch +3/4 rape) on N2O emissions and the abundance of related functional genes in paddy field soil were determined and compared.【】(1) The crop species affected N2O emissions. The N2O emissions were similar among the different treatments. Among them the N2O emissions from winter crop soil were mainly concentrated at its flowering stage, and those during the rice growing period were concentrated at the tillering, filling, and maturity stages of early and late rice crops. On the whole, the N2O emissions from paddy fields were lower N2O in the early rice season than that in the late rice season. The overall N2O emissions flux in the paddy fields was higher in 2018 than that in 2019. (2) There was no significant difference in N2O cumulative emission of early rice under different treatments. The cumulative N2O emissions from a single seeding treatment were lower than those from mixed treatments over two consecutive years. The annual cumulative N2O emissions were lowest under CK1 in 2019. Among all the mixed treatments, the 3/4 Chinese milk vetch +1/4 rape treatment had the lowest annual cumulative N2O emissions. (3) In general, the copy number of-AOA and-AOB genes was higher in the soil of late rice than that in the soil of early rice, and the copy number of-AOA was up to two orders of magnitude higher in late rice soil than in early rice soil. The copy numbers of,andwere higher in the soil of late rice crops than that in the soil of early rice crops, and the copy number ofwas up to two orders of magnitude higher than those ofandin late rice soil. The mixted-cropping of Chinese milk vetch and rape increased the abundance-AOA and-AOB genes in soil, and-AOA was the dominant functional gene. It also increased the abundance of,andgenes in soil, andgene was the dominant gene. The copy number of genes related to denitrification was one to three orders of magnitude higher than the copy number of genes related to nitrification, indicating that denitrification made a larger contribution to N2O emissions.【】Overall, the 3/4 Chinese milk vetch + 1/4 rape-early rice-late rice was the best mixed planting system, because it had the best combination of low N2O emissions as well as high yield and high fertility.

Chinese milk vetch; rape; green manure mixted-cropping; nitrous oxide; functional gene; paddy fields

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.04.010

2021-01-21；

2021-05-14

國家自然科學(xué)基金項目（32160528）、國家重點研發(fā)計劃課題（2016YFD0300208）、國家自然科學(xué)基金（41661070）

楊濱娟，Tel：0791-83828143；E-mail：yangbinjuan@jxau.edu.cn。通信作者黃國勤，Tel：0791-83828143；E-mail： hgqjxes@sina.com

（責(zé)任編輯 李云霞）