董紅艷， 胡向軍， 彭瑞云， 王麗峰， 段昕妤

(1. 61886部隊門診部， 北京 100084； 2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100850；3.中國人民解放軍總醫(yī)院 第八醫(yī)學(xué)中心消化科， 北京 100093)

0 引言

微波是指頻率在300 MHz～300 GHz，波長在1～10-3m之間的電磁波。微波輻射所屬的電磁波區(qū)域是輻射產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵區(qū)域[1]，微波輻射廣泛存在于人們的日常生活和工作環(huán)境之中，因其已成為一種新的環(huán)境污染因素而倍受關(guān)注。微波對肺臟影響的研究，主要集中在間質(zhì)性肺炎，有學(xué)者認(rèn)為肺臟是微波損傷的敏感靶器官之一[2]。

前期實驗微波模擬源輻射大鼠后，在形態(tài)學(xué)上觀察到肺組織水腫及毛細(xì)血管通透性增加中的表達(dá)改變，VEGF表達(dá)增加，AQP5表達(dá)減少，并且有時效性和量效性關(guān)系，二者可能參與了微波輻射致血一氣屏障損傷的病理生理過程[3-4]。VEGF、AQP5和Occludin等參與了多種原因引起的肺部炎癥和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療過程，是引起肺組織損傷、通透性增加、水腫的重要因素[5]。為此，我們采用Western Blot、RT-PCR等技術(shù)，通過對大鼠肺組織中VEGF、AQP5的檢測，進(jìn)一步探討不同功率微波輻射對大鼠肺組織影響的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

二級雄性Wistar大鼠162只，體重(200±20)g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供并統(tǒng)一飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度21～23℃，相對濕度60%，隨機(jī)分為假輻射組和10 mW/cm2、30 mW/cm2和100 mW/cm2輻射組，其中假輻射組12只，10 mW/cm2、30 mW/cm2和100 mW/cm2輻射組各50只。

1.2 微波輻射方法

采用軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微波輻射源進(jìn)行全身均勻輻射。大鼠在輻射盒中為固定體位。輻射臺旋轉(zhuǎn)以保證全身均勻輻射。平均功率密度為10 mW/cm2、30 mW/cm2和100 mW/cm2，輻射時間為5 min。假輻射組僅將裝有大鼠的輻射盒放于輻射臺上，不進(jìn)行輻射。

1.3 檢測大鼠肺組織中VEGF和AQP5表達(dá)

各組動物分別于輻射后6 h、1 d、3 d、7 d和14 d稱重后，經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后，取肺組織置液氮中凍存，備做蛋白提取及AQP5 mRNA。兔抗VEGF抗體、兔抗AQP5抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；AQP5和β-actin PCR擴(kuò)增的成對引物序列購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；兔抗actin抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PVDF膜、Western發(fā)光底物試劑盒購自購自北京普利來基因技術(shù)有限公司。

1.3.1 免疫印跡(Western Blot)方法檢測大鼠肺組織中VEGF、AQP5

制備肺組織總蛋白后，測定蛋白濃度、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、用PBsT清洗PVDF膜、100 g/L脫脂奶粉常溫封閉2 h；分別加入兔抗VEGF抗體(1∶200)和兔抗AQP5(1∶100)，4℃過夜，PBST清洗3×10 min；加入生物素標(biāo)記的二抗(PBS-T液1∶4000稀釋)，搖床常溫孵育1 h；PBST清洗3×10 min；在硝酸纖維素膜上滴加酶的作用底物ECL(帶有化學(xué)發(fā)光劑)，作用1 min后濾紙吸干，塑料保鮮膜包裹后放入暗匣，壓X光底片曝光2～30 min，顯影，定影。將目的條帶掃描后應(yīng)用CMIAS-Ⅱ圖像分析儀，測目的條帶的積分光密度(IOD)，將掃描值與β-actin掃描值相比，然后以樣本/內(nèi)參照的比值表示AQP5 mRNA表達(dá)水平、VEGF和AQP5蛋白表達(dá)水平。

1.3.2 RT—PCR方法檢測大鼠肺組織中AQP5

AQP5上游引物mRNA5’-TCCAGGACCACACCAGAAAG-3’，下游引物5’-ATAAAATAGCACTCCGTGAGCC-3’；β-actin上游引物5’-CTGTGCCCATCTATGAGGGTTAC-3’，下游引物5’-AATCCACACAGAGTACTTGCGCT-3’。參照TRIzol試劑說明書方法提取總RNA，其A260/280在1.7～2.0之間。各組各時間點RNA提取物每1.5 μg中加入Oligo-P(dT)18Primer 0.5 μL，無RNA酶的水補(bǔ)充至6 μL、70℃、5 min；再加入5×反應(yīng)液2 μL，RNA酶抑制劑0.5 μL和dNTP混合物1 μL、37℃，水浴5 min后加入0.5 μL AMV-RT、42℃、60 min；之后70℃反應(yīng)10 min、4℃或冷凍保存。以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行PCR，突觸素AQP5擴(kuò)增條件為94℃、5 min；94℃、30 s；52℃、30 s (β-actin，54℃、30 s)，72℃、30 s；72℃、5 min；均為25個循環(huán)。取5 μL PCR產(chǎn)物與1 μL DNA上樣緩沖液混勻后在10 g/L的凝膠上電泳，用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

2 結(jié)果2.1 大鼠肺組織VEGF免疫印跡的變化

可見10 mW/cm2組輻射后6 h，肺組織中VEGF含量與假輻射組相比無明顯改變，在1 d、3 d時含量減少(P<0.05)，7 d時見基本恢復(fù)；30 mW/cm2組大鼠肺組織VEGF的改變和恢復(fù)時間基本與10 mW/cm2組相似；100 mW/cm2組于輻射后6 h即見減少，1 d、3 d和7 d持續(xù)減少(P<0.05)，至第14 d基本恢復(fù)。表明10 mW/cm2、30 mW/cm2和100 mW/cm2微波輻射后大鼠肺組織VEGF蛋白的表達(dá)變化呈先降低后恢復(fù)的過程，具有明顯的量效關(guān)系，即輻射劑量越大，其表達(dá)減少越明顯，且出現(xiàn)早、恢復(fù)遲。

結(jié)果見表1及圖1。

表1 微波輻射后大鼠肺組織VEGF與β-actin MOD比值變化

圖1 微波輻射后大鼠肺組織VEGF蛋白變化Western Blot結(jié)果1. 假輻射組；2. 10 mW/cm2-6 h；3. 30 mW/cm2-6 h；4. 100 mW/cm2-6 h；5. 10 mW/cm2-1 d；6. 30 mW/cm2-1 d；7. 100 mW/cm2-1 d；8. 10 mW/cm2-3 d；9. 30 mW/cm2-3 d；10. 100 mW/cm2-3 d；11. 10 mW/cm2-7 d；12. 30 mW/cm2-7 d；13. 100 mW/cm2-7 d；14. 10 mW/cm2-14 d；15. 30 mW/cm2-14 d；16. 100 mW/cm2-14 d

2.2 大鼠肺組織AQP5免疫印跡的變化

輻射后10 mW/cm2、30 mW/cm2組大鼠肺組織中AQP5與假輻射組相比未見顯著改變；100 mW/cm2組大鼠肺組織中AQP5與假輻射組相比降低，其中在輻射后1 d顯著降低(P<0.05)，持續(xù)至輻射后第3 d、7 d基本恢復(fù)。表明100 mW/cm2HPM輻射后大鼠肺組織AQP5蛋白的表達(dá)呈先降低后恢復(fù)的過程。結(jié)果見表2及圖2。

表2 微波輻射后大鼠肺組織AQP5與β-actin MOD比值變化

2.3 大鼠肺組織AQP5 mRNA的變化

10 mW/cm2、30 mW/cm2組各時間點未見明顯異常，100 mW/cm2HPM輻射后6 h～3 d 大鼠肺組織AQP5 mRNA表達(dá)減少，1 d時減少最為明顯(P<0.05)，輻射后7 d見恢復(fù)，14 d見基本恢復(fù)。表明100 mW/cm2HPM輻射后大鼠肺組織AQP5 mRNA表達(dá)呈先減少后恢復(fù)的過程。結(jié)果見圖3及圖4。

圖2 微波輻射后大鼠肺組織AQP5蛋白變化Western Blot結(jié)果1. 假輻射組；2. 10 mW/cm2-6 h；3. 30 mW/cm2-6 h；4. 100 mW/cm2-6 h；5. 10 mW/cm2-1 d；6. 30 mW/cm2-1 d；7. 100 mW/cm2-1 d；8. 10 mW/cm2-3 d；9. 30 mW/cm2-3 d；10. 100 mW/cm2-3 d；11. 10 mW/cm2-7 d；12. 30 mW/cm2-7 d；13. 100 mW/cm2-7 d；14. 10 mW/cm2-14 d；15. 30 mW/cm2-14 d；16. 100 mW/cm2-14 d

圖3 微波輻射后大鼠肺組織AQP5 mRNA的RT-PCR檢測結(jié)果1. 假輻射組；2. 10 mW/cm2-6 h；3. 30 mW/cm2-6 h；4. 100 mW/cm2-6 h；5. 10 mW/cm2-1 d；6. 30 mW/cm2-1 d；7. 100 mW/cm2-1 d；8. 10 mW/cm2-3 d；9. 30 mW/cm2-3 d；10. 100 mW/cm2-3 d；11. 10 mW/cm2-7 d；12. 30 mW/cm2-7 d；13. 100 mW/cm2-7 d；14. 10 mW/cm2-14 d；15. 30 mW/cm2-14 d；16. 100 mW/cm2-14 d

圖4 微波輻射后大鼠肺組織AQP5 mRNA與β-actin mRNA IOD比值變化

3 討論

VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞的專用肽絲裂原，其家族成員VEGF-A是調(diào)節(jié)血管功能的最關(guān)鍵因子[6]，有關(guān)射線對肺組織VEGF的影響，已有研究表明，肺屬于對輻射中度敏感的器官，較高劑量的輻射易造成放射性肺損傷，放射性肺損傷早期表現(xiàn)為組織充血水腫、滲透增加等炎癥反應(yīng)[7]。VEGF是一類促血管生成因子，分為VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和VEGF-F六大類型。VEGF-A是目前研究最多，能在一定程度上影響血管新生[8]。放射線可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而導(dǎo)致管腔狹窄或閉塞。而VEGF可以激活血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性，增加血管的滲透性，促進(jìn)血管的新生[9-10]。

水通道蛋白5位于Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞，是調(diào)節(jié)水分子轉(zhuǎn)運的功能性蛋白，生理狀態(tài)下可協(xié)助清除肺泡腔內(nèi)多余水分，保持肺泡腔干燥環(huán)境[11]。MA發(fā)現(xiàn)敲除AQP5基因，肺泡透水性較生理狀態(tài)下可降低10倍，表明AQP5介導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞的水分子跨膜轉(zhuǎn)運機(jī)制[12]?？梢?，AQP5的表達(dá)與急性肺水腫互為因果，相互促進(jìn)。但AQP5在ALI過程中對水腫液清除作用的機(jī)制仍不明確。多項研究顯示[13-14]，不同類型損傷因素致ALI條件下，AQP-5表達(dá)趨勢不穩(wěn)定。輻射損傷作用的關(guān)鍵靶點是細(xì)胞核內(nèi)的DNA，射線作用于細(xì)胞內(nèi)水分子產(chǎn)生HO，DNA斷裂是輻射損傷的主要機(jī)制，水分子被認(rèn)為是輻射損傷的關(guān)鍵介質(zhì)[15]。

在前期研究中，觀察到一定劑量微波輻射后大鼠肺組織，表現(xiàn)為以出血、水腫為其主要的急性肺損傷的病理改變[3]。VEGF、AQP5在微波輻射致肺損傷中的生物效應(yīng)和機(jī)制未見公開報道，肺組織內(nèi)VEGF、AQP5的表達(dá)非常豐富。那么VEGF、AQP在微波輻射致急性肺損傷時發(fā)揮著怎樣的作用？肺損傷時的出血、水腫是否與VEGF、AQP有關(guān)？為此，本研究采用Western Blot、RT-PCR方法觀察VEGF、AQP在微波輻射后大鼠肺組織中的動態(tài)變化規(guī)律，可見VEGF表達(dá)改變與輻射劑量呈正相關(guān)，三個輻射劑量組中的表達(dá)具有量效關(guān)系和時效性關(guān)系；AQP5蛋白及基因表達(dá)顯著下降，與肺水腫的形成相一致，提示肺損傷后AQP5表達(dá)下調(diào)與肺泡上皮液體轉(zhuǎn)運功能降低有關(guān)，可能是導(dǎo)致肺泡水腫形成的重要因素之一。

輻射后，肺水腫發(fā)生可能與VEGF、AQP5共同的作用、相互促進(jìn)有關(guān)[16]。VEGF水平會升高并引起高滲透肺水腫。AQP5位于器官細(xì)胞膜表面，可參與水轉(zhuǎn)運及腺體分泌，屬于肺泡上皮細(xì)胞分化的重要標(biāo)志，當(dāng)肺泡Ι型上皮細(xì)胞受損時，AQP5水平會明顯升高，本研究為為輻射防護(hù)提供一定的資料，仍需繼續(xù)深入研究，深層次探究輻射性肺水腫的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制。