陳 勇，鄭元梅，喻 晨，周宇凡，胡曉嵐

(1.湖北理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435003；2.鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院)，湖北 黃石 435000)

肝癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，在我國癌癥發(fā)病率中排第5位，死亡率排第2位[1]。雖然目前其手術(shù)及藥物治療效果不斷提高，但是由于大多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已為肝癌中晚期，其臨床療效仍不理想，且容易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差[2]，因此研究新的肝癌預(yù)后標(biāo)志物具有十分重要的意義。TIMM9主要編碼Tim9蛋白，Tim9與Tim10構(gòu)成分子伴侶復(fù)合物位于細(xì)胞線粒體膜間隙，介導(dǎo)線粒體蛋白的輸入和轉(zhuǎn)運(yùn)。前期研究發(fā)現(xiàn)，TIMM9在胃癌中表達(dá)增加，并且是胃癌的預(yù)后標(biāo)志物[3]，但是在其他癌癥中的情況尚不清楚。

本研究通過下載UCSC Xena數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、TCGA數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)錄組及臨床數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法探討TIMM9在泛癌以及肝癌中的表達(dá)情況，并做肝癌生存分析和臨床相關(guān)性分析，闡明TIMM9表達(dá)異常與肝癌患者的生存及預(yù)后相關(guān)性。通過單因素及多因素COX回歸分析，進(jìn)一步明確TIMM9是否可作為獨(dú)立預(yù)后因素。通過HPA數(shù)據(jù)庫下載免疫組化結(jié)果了解Tim9蛋白在肝癌中的表達(dá)情況，利用GSEA富集分析探討和其相關(guān)的信號(hào)通路。

1 材料方法

1.1 數(shù)據(jù)收集與整理

從UCSC Xena數(shù)據(jù)庫下載33種常見癌癥的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從TCGA數(shù)據(jù)庫下載肝癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(腫瘤樣本374例，正常樣本50例)和臨床數(shù)據(jù)，刪除數(shù)據(jù)不完整的臨床樣本，從HPA數(shù)據(jù)庫下載Tim9蛋白在正常肝臟和肝癌中的免疫組化結(jié)果。

1.2 TIMM9在肝癌與正常肝臟中的表達(dá)差異分析

采用非參秩檢驗(yàn)(Wilcox Test)，用R軟件(版本4.0.5)中的limma包和beeswarm包分析統(tǒng)計(jì)TIMM9在肝癌和正常肝臟中的差異表達(dá)情況，并做配對(duì)差異分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從HPA數(shù)據(jù)庫的免疫組化結(jié)果中進(jìn)一步明確Tim9蛋白在肝癌和正常肝臟中的表達(dá)差異。

1.3 TIMM9表達(dá)差異與肝癌預(yù)后及臨床相關(guān)性分析

整理TCGA數(shù)據(jù)庫中的臨床數(shù)據(jù)，刪除數(shù)據(jù)不完整的臨床樣本，用R軟件(版本4.0.5)中的survival包做生存分析，明確TIMM9和患者預(yù)后是否相關(guān)，用limma包和ggpubr包做臨床相關(guān)性分析，明確TIMM9與患者年齡、性別、分級(jí)、臨床分期以及TNM分期是否相關(guān)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 TIMM9單因素及多因素COX回歸分析

整理TCGA數(shù)據(jù)庫中的臨床數(shù)據(jù)，刪除數(shù)據(jù)不完整的臨床樣本，用R軟件(版本4.0.5)中的survival包和survminer分別進(jìn)行單因素和多因素COX回歸分析，明確TIMM9是否可作為肝癌的獨(dú)立預(yù)后因素。

1.5 KEGG信號(hào)通路富集分析

利用GSEA軟件(4.1.0版本)分析肝癌中可能與TIMM9相關(guān)的信號(hào)通路。選擇帶注釋的基因集(c2.cp.kegg.v7.2.symbols.gmt)作為參考基因集，每個(gè)分析隨機(jī)運(yùn)行排列基因組1 000次，設(shè)置過濾條件為FDR值小于0.25且NOMP值小于0.05。

2 結(jié)果

2.1 TIMM9在多種癌癥中表達(dá)增加

為了了解TIMM9在泛癌中的表達(dá)情況，從UCSC Xena數(shù)據(jù)庫中下載33種癌癥的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，用R軟件(版本4.0.5)的ggpubr包提取并分析TIMM9在泛癌中的表達(dá)情況并繪制箱線圖。TIMM9在泛癌中的表達(dá)情況如圖1所示。由圖1可知，和正常組織相比，TIMM9在肝癌、結(jié)腸癌、食管癌等14種癌癥中高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TIMM9可能在癌癥發(fā)展中具有重要作用。

*—P<0.05；**—P<0.01；***—P<0.001。

2.2 TIMM9在肝癌中表達(dá)增加

從TCGA數(shù)據(jù)庫的肝癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提取并分析TIMM9的表達(dá)情況。TIMM9在正常肝臟和肝癌中的差異表達(dá)情況如圖2所示。由圖2可知，TIMM9在肝癌中表達(dá)增高，P值均小于0.05，且Tim9蛋白在肝癌中呈強(qiáng)陽性。

(a) 散點(diǎn)圖 (b) 配對(duì)差異圖 (c) Tim9蛋白免疫組化結(jié)果

2.3 TIMM9表達(dá)增高與患者臨床相關(guān)性分析

提取TIMM9表達(dá)數(shù)據(jù)，分別分析與患者年齡、分級(jí)、臨床分期以及TNM分期的關(guān)系。TIMM9臨床相關(guān)性分析如圖3所示。由圖3可知，TIMM9表達(dá)增高與肝癌的分級(jí)、臨床分期和T分期具有相關(guān)性(P<0.05)，提示TIMM9可能對(duì)肝癌的發(fā)展具有促進(jìn)作用。

(a) 年齡 (b) 分級(jí) (c) 臨床分期

2.4 單因素及多因素COX回歸分析

單因素及多因素COX回歸分析是臨床常用的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，當(dāng)某個(gè)因素在單因素及多因素分析中均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，可以判斷該因素可作為預(yù)后獨(dú)立因素。本研究探討了TIMM9以及患者年齡、性別、分級(jí)、分期以及TNM分期等對(duì)患者預(yù)后的影響。單因素及多因素COX分析見表1，多因素COX回歸分析森林圖如圖4所示。結(jié)果顯示，TIMM9在單因素及多因素分析中均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示TIMM9可作為肝癌預(yù)后獨(dú)立因素。

表1 單因素及多因素COX分析

圖4 多因素COX回歸分析森林圖

2.5 TIMM9表達(dá)增高與患者預(yù)后分析

按TIMM9表達(dá)相對(duì)值的中位值將臨床樣本分為高、低2組，提取臨床數(shù)據(jù)中的生存時(shí)間和生存狀態(tài)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。TIMM9表達(dá)與患者生存之間的關(guān)系如圖5所示。由圖5可知，TIMM9高表達(dá)組生存率顯著低于低表達(dá)組(P<0.05)，提示TIMM9表達(dá)越高，患者預(yù)后越差。

圖5 TIMM9表達(dá)與患者生存之間的關(guān)系

2.6 GSEA富集分析結(jié)果

利用GSEA(4.1.0)軟件分析和TIMM9相關(guān)的信號(hào)通路，結(jié)果顯示有多條信號(hào)通路和TIMM9表達(dá)增高相關(guān)，提示其在細(xì)胞中的作用可能比較廣泛，選取NES值排列前10的信號(hào)通路，TIMM9在肝癌中的信號(hào)通路富集分析見表2，GSEA富集分析TIMM9在肝癌中主要參與的信號(hào)通路如圖6所示。

表2 TIMM9在肝癌中的信號(hào)通路富集分析

圖6 GSEA富集分析TIMM9在肝癌中主要參與的信號(hào)通路

3 討論

隨著科學(xué)技術(shù)發(fā)展，肝癌的治療手段不斷改進(jìn)，但是其總體治療效果仍不盡如人意。生物信息技術(shù)的發(fā)展和腫瘤數(shù)據(jù)庫的共享使人們有機(jī)會(huì)通過高通量篩查找到新的潛在的診斷和預(yù)后標(biāo)志物，為肝癌的治療以及機(jī)制研究提供了極大的便利。線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)的主要細(xì)胞器之一，線粒體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和組裝過程發(fā)生紊亂時(shí)，會(huì)導(dǎo)致癌癥、神經(jīng)退行性病變、擴(kuò)張型心肌病、腎炎樣腎病等多種疾病[4-5]，因此線粒體異常在疾病中的作用及機(jī)制越來越受到人們的重視。線粒體內(nèi)約有1 500個(gè)蛋白，大多數(shù)由核基因編碼釋放到胞質(zhì)，再由胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)特定的功能區(qū)[6]，過程中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生異常都會(huì)影響線粒體的功能。TIMM9位于人染色體14q23.1，編碼Tim9蛋白。目前，已知Tim9和Tim10構(gòu)成復(fù)合體，作為分子伴侶在線粒體膜間隙介導(dǎo)膜蛋白前體的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)受Tim8-Tim13復(fù)合體的調(diào)控[7]。線粒體膜間隙的分子伴侶復(fù)合物與多跨膜疏水蛋白前體、代謝產(chǎn)物載體蛋白前體或β-barrel蛋白前體結(jié)合，可防止此類蛋白前體在水性的膜間隙中錯(cuò)誤聚集，并引導(dǎo)其正確插入內(nèi)膜[7]。研究發(fā)現(xiàn)，在小Tim分子伴侶蛋白的內(nèi)外螺旋中含有保守的疏水性氨基酸殘基，在酵母中點(diǎn)突變這些殘基會(huì)影響酵母的生長，也會(huì)影響載體蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和裝配[8]。我們首次發(fā)現(xiàn)TIMM9基因在肝癌中表達(dá)增高，且預(yù)后及臨床相關(guān)性分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相關(guān)研究結(jié)果證明TIMM9可作為肝癌預(yù)后標(biāo)志物；同時(shí)，TIMM9編碼的Tim9蛋白位于細(xì)胞線粒體內(nèi)，提示其可能影響肝癌的蛋白合成與代謝。通過GSEA富集分析，發(fā)現(xiàn)多條相關(guān)信號(hào)通路與TIMM9表達(dá)增高相關(guān)，包括剪接體信號(hào)通路、嘧啶代謝信號(hào)通路、基底切除修復(fù)信號(hào)通路等，進(jìn)一步證實(shí)了我們的推測(cè)。我們的研究結(jié)果為肝癌找到了一個(gè)新的預(yù)后標(biāo)志物，同時(shí)也為肝癌的機(jī)制研究提供了新的思路。